[1]Изобретение относится к молекулярной генетике, офтальмологии и может быть использовано в практической медицине. Изобретение предназначено для подтверждающей и дифференциальной ДНК-диагностики врожденной аниридии и WAGR-синдрома. Аниридия - это врожденное или приобретенное отсутствие радужной оболочки глаза, приводящее к ухудшению зрения и ряду неприятных осложнений.
[2]Врожденные пороки развития (ВПР) органа зрения являются одной из основных причин инвалидности в детском возрасте с малой эффективностью лечения и высокой распространенностью (не менее 2,7 чел. на 10000 населения). В связи с отсутствием для большинства ВПР органа зрения эффективной хирургической и терапевтической коррекции возрастает роль профилактических мероприятий, направленных на предотвращение появления повторных случаев заболевания в отягощенных семьях. Именно поэтому актуальной представляется разработка протоколов для диагностики заболеваний органа зрения, включая ВПР. С 2003 года в России зарегистрировано около 300 случаев врожденной аниридии (ВА).
[3]ВА - наследственное заболевание с аутосомно-доминантным типом наследования, встречающееся в популяции с частотой 1:45000-100000 населения. ВА - это моногенный или хромосомный множественный порок развития, затрагивающий в большинстве случаев все структуры глаза (гипоплазия макулы, врожденная катаракта, кератопатия, гипоплазия зрительного нерва, глаукома и другие), ЦНС (в 10-17% случаев грубые неврологические нарушения и задержка развития), поджелудочную железу (снижение секреторной функции, у некоторых пациентов нарушена толерантность к глюкозе из-за изменения уровней секреции глюкагона и инсулина, иногда развивается сахарный диабет), щитовидную железу и гипофиз, мочеполовую и другие системы (менее 10%) [1, 2].
[4]ВА в 75% случаев встречается как изолированный порок развития глаза без объективного визуализированного вовлечения других органов и систем, в 20-24% отмечается синдромальная ВА (включая WAGR синдром). Как изолированная, так и синдромальная ВА обусловлена гетерозиготными мутациями (когда одной копии мутации достаточно для проявления симптомов заболевания) в гене РАХ6 (Paired box 6 -тканеспецифический транскрипционный фактор), в том числе хромосомными перестройками, вовлекающими регион 11р13, в котором расположен локус гена РАХ6 (локус - местоположение определенного гена на генетической или цитологической карте хромосомы). В 13% случаев ВА встречается как часть синдрома WAGR [аббревиатура WAGR составлена из первых букв основных проявлений: опухоль Вильмса (W), аниридия (А), мочеполовые нарушения (G), умственная отсталость (R)]. Синдром WAGR обусловлен делецией региона 11р13, захватывающей локусы гена РАХ6 и гена WT1 предрасположенности к развитию опухоли Вильмса (нефробластома). WAGR-синдром встречается, в основном, в виде спорадических случаев. Во всех спорадических случаях до установления генетической причины больной аниридией имеет 50% риск развития нефробластомы до 8 лет жизни [4]. Высокий риск и злокачественность опухоли почки, составляющей синдром WAGR, определяют важность проведение ранней дифференциальной диагностики.
[5]В 2-5% случаев аниридия ассоциирована с другими моногенными и хромосомными синдромами, более редкими по частоте [3]. Среди них в международной базе данных OMIM (медицинская база данных, в которой собирается информация об известных заболеваниях с генетическим компонентом и генах, ответственных за их развитие) выделено порядка 25 различных форм.
[6]Известен «Список основных синдромов детектируемых молекулярно-цитогенетическим методом» (хромосомный микроматричный анализ) с использованием микроматрицы CGX™ - HD (4×180 K):
[7]- Аниридия: OMIM: 106210, Ген/локус: РАХ6, Локализация: 11р13;
[8]- Опухоль Вильмса с аниридией, генитальными аномалиями OMIM: 194072 Ген/локус: РАХ6, WT1, Локализация: 11р 13
[9](http://microarray.kz/syndromes.html)
[10]Известно использование генетических анализов для подтверждения наследственной аниридии, включающее проведение FISH-теста и исследования на определение типа дефекта гена РАХ6.
[11](http://www.krasotaimedicina.ru/diseases/ophthalmology/aniridie).
[12]Известен также способ проведения генетического анализа (дифференциальной молекулярно-генетической диагностики), при котором на основании результатов исследования образца биологического материала, полученных методом MLPA, производят дальнейшие действия, выбранные из группы диагностических инструментов, обеспечивающей дифференциацию возможных диагнозов(RU 2562866).
[13]Известно решение, которое указывает врожденный ген, вызывающий заболевание аниридией (aniridia), набор для обнаружения гена, вызывающего болезнь, вызывающий врожденную аниридию, и применение этого гена. Врожденный ген, которым обусловлено заболевание аниридией, представляет собой мутационный ген РАХ6. Там же известен набор для обнаружения врожденного гена, вызывающего заболевание аниридией, а также для изучения патогенетического молекулярного механизма. Способ предусматривает сквенирование экзона (нуклеотидная последовательность экзона 6) и исследование родственников. Набор праймеров включает два праймера (CN103937804, прототип).
[14]В имеющемся уровне техники значительную сложность в молекулярном подтверждении диагноза ВА представляет гетерогенность молекулярных механизмов повреждения гена РАХ6 и отсутствие «мажорных» мутаций. Генетические повреждения включают в себя не только точковые мутации, но и крупные хромосомные перестройки с вовлечением региона 11р13, в ряде случаев затрагивающие не кодирующую часть гена РАХ6, а дистальный цис-регуляторный район, находящийся на расстоянии 200 тыс. пар нуклеотидов (п.н.) от гена. Кроме того, как и при других аутосомно-доминантных заболеваниях, при ВА частота соматического мозаицизма по патогенной мутации может достигать 17,5% спорадических случаев [5]. Оценка делеций гена WT1 региона 11р13 и диагностика WAGR-синдрома не проводится. В целом недостатками известных решений являются недостаточный объем поиска возможных причин врожденной аниридии, низкие достоверность, разрешающая способность и дифференцируемость получаемых результатов (синдромальной и изолированной аниридии), обусловленные в частности малым количеством микросателлитных маркеров, праймеров для секвенирования, и тем, что не учитываются в необходимом объеме и взаимосвязи изменения гена WT1 и гена РАХ6, а также то, что сложные фенотипы аниридии могут перекрываться с клиническими фенотипами, ассоциированными с изменениями в других генах.
[15]Технической проблемой, разрешаемой с помощью настоящего изобретения, является разработка эффективного подтверждающего протокола и дифференциальной (от дисгенеза переднего отрезка глаза, ассоциированного с мутациями в других генах) диагностики врожденной аниридии и WAGR-синдрома с учетом выраженного клинического полиморфизма и молекулярной гетерогенности, лежащей в основе повреждения функции генов, ассоциированных с дисгенезией (развитие с отклонением от нормы) переднего отрезка глаза (роговица, радужная оболочка, хрусталик).
[16]Технический результат, обеспечивающий разрешение указанной проблемы, основан на способе (подтверждающем протоколе) дифференциальной диагностики врожденной аниридии и WAGR-синдрома с учетом выраженного клинического полиморфизма проявлений врожденной аниридии (изолированной или синдромальной) и генетической гетерогенности, лежащей в основе повреждения функции генов, ассоциированных с дисгенезией переднего отрезка глаза.
[17]Дифференциальная идентификация патогенных изменений кодирующей последовательности или делеции региона 11р13, в частности, гена РАХ6, подтверждает диагноз изолированной аниридии, определение делеции (хромосомной перестройки, при которых происходит потеря участка 11 хромосомы) региона 11р13, захватывающей гены РАХ6 и WT1, предполагает возможный диагноз WAGR-синдрома, которым обусловлен высокий риск развития опухоли почки. При этом в заявляемом способе процедура последовательного применения молекулярно-биологических техник направлена на приоритетную проверку генетических нарушений, ассоциированных с тяжелыми и синдромальными формами аниридии и, в случае их исключения, на поиск причин заболевания, угрожающего жизни в меньшей степени - врожденной аниридии.
[18]Согласно заявляемому способу дифференциальная идентификация патогенных изменений кодирующей последовательности гена РАХ6 или делеции региона 11p13, в частности, захватывающещей ген РАХ6 или его дистантные регуляторные области, подтверждает диагноз изолированной аниридии, определение делеции (хромосомной перестройки, при которых происходит потеря участка хромосомы) региона 11р13, захватывающей гены РАХ6 и WT1, предполагает возможный диагноз WAGR-синдрома, которым обусловлен высокий риск развития опухоли почки (нефробластомы). При этом процедура последовательного применения молекулярно-биологических техник направлена на приоритетную проверку генетических нарушений, ассоциированных с тяжелыми и синдромальными формами аниридии и, в случае их исключения, на поиск менее тяжелых причин врожденной аниридии.
[19]Сущность изобретения заключается в том, что способ дифференциальной и подтверждающей молекулярно-генетической диагностики врожденной аниридии и WAGR-синдрома предусматривает, что у пациента, имеющего клинические признаки аниридии, производят забор образца биологического материала для проведения ДНК-диагноститки, в отношении которого первоначально осуществляют поиск крупных делеций с размером по меньшей мере в одну тысячу пар нуклеотидов региона 11р13 методом MLPA, и на основании результатов этого поиска производят дальнейшие мероприятия, выбранные из следующей группы диагностических инструментов:
[20]- в случае обнаружения крупной делеции региона 11р13, захватывающей локусы генов WT1 и РАХ6, и подтверждения делеции на генетическом материале пациента методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с зондом, специфичным к гену WT1, пациенту выставляется предположительный диагноз WAGR-синдрома;
[21]- в случае обнаружения крупной делеции региона 11р13, не захватывающих локус гена WT1 и захватывающей локус гена РАХ6 или его дистантные регуляторные области, и подтверждения делеции на генетическом материале пациента методом анализа потери гетерозиготности по микросателлитным маркерам, пациенту выставляется клинический диагноз врожденной аниридии;
[22]- в случае отсутствия крупных делеций региона 11р13 проводят секвенирование экзонов и фланкирующих их участков интронов гена РАХ6 для поиска малых внутригенных мутаций этого гена, при этом проводят секвенирование экзонов из по меньшей мере одной из групп: группа экзонов 5, 6, 7, 8, 9 и/или группа экзонов 1, 2, 3, 4, 10, 11, 12, 13, а при обнаружении в результате секвенирования хотя бы одной малой внутригенной мутации осуществляют проверку патогенности обнаруженной генетических повреждений в гене РАХ6 в соответствии с критериями ACMG (Американского колледжа молекулярной генетики), и при свидетельстве патогенности мутации пациенту подтверждается клинический диагноз врожденной аниридии.
[23]Как правило, производят забор образца биологического материала из группы: венозной или капиллярной крови, слюны, буккального соскоба, осадка эпителия нижних мочевыводящих путей.
[24]Предпочтительно, для подтверждения патогенности и клинической значимости выявленной делеции или иной мутации определяется генетический статус этого изменения у родителей.
[25]Предпочтительно, в качестве микросателлитных маркеров для анализа потери гетерозиготности носителей крупной делеции региона 11p13 по микросателлитным маркерам выбирают микросателлитные маркеры из группы:
[26]
[27]Предпочтительно, в качестве праймеров для секвенирования экзонов группы 5, 6, 7, 8 и 9 и фланкирующих их участков интронов гена РАХ6, выбирают праймеры из группы:
[28]
[29]Предпочтительно, проводят секвенирование экзонов группы 1, 2, 3, 4, 10, 11, 12, 13 и фланкирующих их участков интронов гена РАХ6 в случае отсутствия малых внутригенных мутаций в результате секвенирования экзонов группы 5, 6, 7, 8, 9 и фланкирующих их участков интронов гена РАХ6.
[30]Предпочтительно, в качестве праймеров для секвенирования кодирующих экзонов группы 1, 2, 3, 4, 10, 11, 12, 13 и фланкирующих их участков интронов гена РАХ6, выбирают праймеры из группы:
[31]
[32]На чертеже приведена блок-схема общей последовательности диагностических процедур для молекулярно-генетическая диагностика врожденной аниридии и WAGR-синдрома.
[33]Способ дифференциальной и подтверждающей молекулярно-генетической диагностики врожденной аниридии и WAGR-синдрома реализуется следующим образом.
[34]Причиной для принятия решения о проведении молекулярно-генетической диагностики обычно является подозрение на генетические причины возникновения заболевания - особенности истории болезни, клиническая картина и т.д. Также проведение молекулярно-генетической диагностики может быть назначено врачом с целью вовремя начать профилактику и/или повысить эффективность лечения, а также предупредить передачу заболевания в последующих поколениях при установлении точной генетической причины патологии, когда становится возможной последующая преимплантационная или пренатальная генетической диагностики у потомства.
[35]У пациента (пробанда), имеющего клинические признаки аниридии, производят забор образца биологического материала для проведения ДНК-диагноститки. В качестве образца производят забор биологического материала из группы: венозной или капиллярной крови, слюны, буккального соскоба, осадка эпителия нижних мочевыводящих путей.
[36]В отношении взятого образца первоначально осуществляют поиск крупных делеций с размером по меньшей мере в одну тысячу пар нуклеотидов региона 11p13 высокоточным методом реакции лигазозависимой амплификации зондов (MLPA). MLPA-анализ является методом выбора для одновременного определения протяженных вариаций числа копий тех или иных регионов в геноме. Технология MLPA представляет собой мультиплексную лигазно-зависимую амплификацию зондов (от англ. Multiplex ligation-dependent probe amplification - MLPA).
[37]На основании результатов поиска методом MLPA рассматривают ситуации, при которых обнаружена крупная делеция региона 11р13, захватывающая локусы генов WT1 и РАХ6, или обнаружена крупная делеция, не захватывающая локус гена WT1, но захватывающая локус гена РАХ6 или его дистантные регуляторные области, или отсутствуют крупные делеции региона 11р13.
[38]На основании конкретных результатов поиска методом MLPA производят дальнейшие мероприятия, направленные на дифференциальную идентификацию патогенных изменений кодирующей последовательности или делеции региона 11p13, в частности, гена РАХ6, подтверждает диагноз изолированной аниридии, определение делеции (хромосомной перестройки, при которых происходит потеря короткого плеча 11 хромосомы) региона 11р13, захватывающей гены РАХ6 и WT1, предполагает возможный диагноз WAGR-синдрома, которым обусловлен высокий риск развития опухоли почки (нефробластомы).
[39]При этом процедура последовательного применения молекулярно-биологических техник направлена сначала на приоритетную проверку генетических нарушений, ассоциированных с тяжелыми и синдромальными формами аниридии и, в случае их исключения, на поиск менее тяжелых причин врожденной аниридии с помощью выбранных из приведенной далее группы диагностических инструментов.
[40]В случае обнаружения крупной делеции региона 11p13, захватывающей локусы генов WT1 и РАХ6, и подтверждения делеции на генетическом материале пациента методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с зондом, специфичным к гену WT1, а также определения генетического статуса этой делеции у родителей. Последнее (так же и далее) позволяет определить, имеется ли у пациента спонтанная мутация в случае спорадической семейной истории или же наследуемая в случае семейных случаев заболевания. Для определения генетического статуса родителей при генетическом консультировании требуются сбор подробного анамнеза, данных объективного обследования членов семьи и проведение биохимических, рентгенологических или гистологических исследований. Проводятся подтверждение патогенности впервые найденных внутригенных мутаций в гене РАХ6 с помощью анализирующих программ, доказательства отсутствия данного изменения в выборке здоровых людей и/или у здоровых членов семьи.
[41]Определяются мутации пробанда у больных членов семьи, если имеется отягощенный семейный анамнез. В случае, когда очевидной истории нет, необходимо подтвердить статус мутации de novo доказательством отсутствия мутации пробанда у родителей, а также подтвердить биологическое родительство. На этом же этапе проводится анализ возможного соматического мозаицизма у родителей.
[42]Пробанду при определении генетического статуса этой делеции у родителей выставляется предположительный диагноз WAGR-синдрома (включающего синдромальную аниридию). В случае обнаружения крупной делеции региона 11р13, не захватывающих локус гена WT1 и захватывающей локус гена РАХ6 или его дистантные регуляторные области, и подтверждения делеции на генетическом материале пациента методом анализа потери гетерозиготности по микросателлитным маркерам, а также определения (подтверждения) генетического статуса этой делеции у родителей (как изложено выше).
[43]В качестве микросателлитных маркеров для анализа потери гетерозиготности носителей крупной делеции региона 11р13 по микросателлитным маркерам выбирают и используют, предпочтительно, микросателлитные маркеры из группы:
[44]
[45]Такому пациенту выставляется клинический диагноз врожденной аниридии (изолированной).
[46]В случае отсутствия крупных делеций региона 11р13 проводят секвенирование экзонов и фланкирующих их участков интронов гена РАХ6 для поиска малых внутригенных мутаций, а именно: малых делеций или инсерций размером до пятидесяти пар нуклеотидов, точковых мутаций этого гена.
[47]При этом сначала проводят исследование экзонов из группы экзонов 5, 6, 7, 8, 9 прямым секвенированием по Сэнгеру.
[48]В качестве праймеров для секвенирования экзонов группы 5, 6, 7, 8 и 9 и фланкирующих их участков интронов гена РАХ6 выбирают и используют, предпочтительно, праймеры из группы:
[49]
[50]При обнаружении в результате секвенирования экзонов 5, 6, 7, 8, 9 варианта нуклеотидной последовательности осуществляют проверку его патогенности в соответствии с критериями ACMG (Американского колледжа молекулярной генетики), в том числе путем определения (подтверждения) генетического статуса этой мутации у родителей (как описано выше), и при свидетельстве патогенности мутации пациенту подтверждается клинический диагноз врожденной аниридии (изолированной).
[51]В случае отсутствия малых внутригенных мутаций в результате секвенирования экзонов группы 5, 6, 7, 8, 9 и фланкирующих их участков интронов гена РАХ6 проводят секвенирование экзонов группы 1, 2, 3, 4, 10, 11, 12, 13 и фланкирующих их участков интронов гена РАХ6, а при обнаружении в результате секвенирования экзонов 1, 2, 3, 4, 10, 11, 12, 13 варианта нуклеотидной последовательности осуществляют проверку его патогенности в соответствии с критериями ACMG (Американского колледжа молекулярной генетики), в том числе путем определения (подтверждения) генетического статуса этой мутации у родителей, и при свидетельстве патогенности мутации пациенту подтверждается клинический диагноз врожденной аниридии (изолированной).
[52]В качестве праймеров для секвенирования кодирующих экзонов группы 1, 2, 3, 4, 10, 11, 12, 13 и фланкирующих их участков интронов гена РАХ6, выбирают и используют, предпочтительно, праймеры из группы:
[53]
[54]При обнаружении ранее не описанных вариантов нуклеотидной последовательности возможна дополнительная проверка патогенности с помощью анализирующих программ. В этом случае уточняется международный перечень клинически значимых патогенных генетических повреждений.
[55]В случае отрицательных результатов в объеме действий по реализации настоящего способа, не приведшем к выявлению крупных делеций региона 11p13 и малых внутригенных мутаций гена РАХ6, но при наличии клинической картины врожденной аниридии, биоматериал пациента может быть направлен для дальнейшей молекулярно-генетической диагностики по назначению врачом-генетиком.
[56]Каждому пациенту, имеющему клинические признаки аниридии, даются рекомендации постоянного наблюдения у врача-офтальмолога и врача-генетика, а в том случае, если пациенту выставляется предположительный диагноз WAGR-синдрома, дополнительно даются рекомендации наблюдения у врача-онколога как минимум до 8 лет.
[57]Последовательность действий настоящего способа представляет собой сущность подтверждающего протокола диагностики врожденной аниридии и WAGR-синдрома с учетом выраженного клинического полиморфизма и генетической гетерогенности, лежащей в основе повреждения функции генов, ассоциированных с дисгенезом переднего отрезка глаза.
[58]В результате использования предлагаемого способа оптимальным путем реализуется обоснованная и доказательно подкрепленная дифференциальная диагностика врожденной аниридии и WAGR-синдрома с учетом выраженного клинического полиморфизма проявлений врожденной аниридии (изолированной или синдромальной) и генетической гетерогенности, лежащей в основе повреждения функции генов, ассоциированных с дисгенезией переднего отрезка глаза.
[59]При этом дифференциальная идентификация патогенных изменений кодирующей последовательности или делеции региона 11р13, в частности, гена РАХ6, подтверждает диагноз изолированной аниридии, определение делеции (хромосомной перестройки, при которых происходит потеря участка 11 хромосомы) региона 11р13, захватывающей гены РАХ6 и WT1, предполагает возможный диагноз WAGR-синдрома, которым обусловлены высокий риск развития опухоли почки - опухоль Вильмса (W), аниридия (А), мочеполовые нарушения (G), умственная отсталость (R). При этом процедура последовательного применения молекулярно-биологических техник направлена на приоритетную проверку генетических нарушений, ассоциированных с тяжелыми и синдромальными формами аниридии и, в случае их исключения, - на поиск менее тяжелых причин врожденной аниридии. Таким образом, использование данного способа позволяет вовремя начать профилактику, или повысить эффективность лечения или предупредить передачу заболевания в последующих поколениях при установлении точной генетической причины патологии.
[61]1. Shimo, N., et al., Aniridia with a heterozygous PAX6 mutation in which the pituitary function was partially impaired. Intern Med, 2014. 53(1): p. 39-42.
[62]2. Netland, P.A., et al., Ocular and systemic findings in a survey of aniridia subjects. J AAPOS, 2011. 15(6): p. 562-6.
[63]3. Kokotas, H. and M.B. Petersen, Clinical and molecular aspects of aniridia. Clin Genet, 2010. 77(5): p. 409-20.
[64]4. Gronskov, K., et al., Population-based risk estimates of Wilms tumor in sporadic aniridia. A comprehensive mutation screening procedure of PAX6 identifies 80% of mutations in aniridia. Hum Genet, 2001. 109(1): p. 11-8.
[65]5. Qin, L., et al., Detection and Quantification of Mosaic Mutations in Disease Genes by Next-Generation Sequencing. J MolDiagn, 2016. 18(3): p. 446-53.
[66]6. Desmet, F.O., et al., Human Splicing Finder: an online bioinformatics tool to predict splicing signals. Nucleic Acids Res, 2009. 37(9): p. e67.
[67]7. Richards, S., et al., Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med, 2015. 17(5): p. 405-24.
[68]8. Redeker, E.J., et al., Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) enhances the molecular diagnosis of aniridia and related disorders. Mol Vis, 2008. 14: p. 836-40.
[69]9. Willems, Т., et al., The landscape of human STR variation. GenomeRes, 2014. 24(11): p. 1894-904.
