патент
№ RU 2646795
МПК A61K38/00

АДАМАНТИЛ ПРОИЗВОДНЫЕ КОРОТКИХ ПЕПТИДОВ С ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Авторы:
Хачатрян Дереник Саркисович Осипов Василий Николаевич Санду Роман Александрович
Все (33)
Номер заявки
2016137955
Дата подачи заявки
23.09.2016
Опубликовано
07.03.2018
Страна
RU
Дата приоритета
24.06.2024
Номер приоритета
Страна приоритета
Как управлять
интеллектуальной собственностью
Реферат

Изобретение относится к медицине и касается коротких пептидов, обладающих цитотоксическим действием, общей формулы R-Phe-D-Trp-Lys(R)-Thr-R, где Rпредставляет собой Н или трет-бутилоксикарбонил; Rпредставляет собой 1-аминоадамантильную, 1-амино-(1-адамантил)этильную группу; Rпредставляет собой R-Cys(R)- или 3-R-тиазолидин-4-карбонил, где R- Н или трет-бутилоксикарбонил; R- Н или трет-бутилоксикарбонил или ацетомидометил. Изобретение обеспечивает высокую устойчивостью пептидов к ферментативному разложению; возможность как орального, так и парентерального введения в организм. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 11 пр.

Формула изобретения

1. Короткий пептид, обладающий цитотоксическим действием, общей формулы:
,
где R1 представляет собой Н или трет-бутилоксикарбонил;
R2 представляет собой 1-аминоадамантильную, 1-амино-(1-адамантил)этильную группу;
R3 представляет собой R4-Cys(R5)- или 3-R4-тиазолидин-4-карбонил,
где R4 - Н или трет-бутилоксикарбонил;
R5 - Н или трет-бутилоксикарбонил или ацетомидометил.
2. Короткий пептид, обладающий цитотоксической активностью по п. 1, выбранный из группы:
Boc-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-1-(1 адамантил)-этиламид,
Boc-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-1-(1 адамантил)-этиламид
Boc-Cys(Boc)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-1-адамантиламид,
Вос-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys(Вос)-Thr-1-адамантиламид,
Boc-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-NH-1-адамантиламид,
где Boc обозначает трет-бутилкарбоксильную группу, Acm - ацетамидометильную группу,
Thz - остаток тиазолидин-4-карбоновой кислоты.

Описание

Короткий пептид, обладающий цитотоксическим действием

Изобретение относится к фармацевтической химии и непосредственно касается новых коротких пептидов, обладающих цитотоксической активностью, которые могут быть применены для лечения онкологических заболеваний.

Как известно, к коротким пептидам относят пептидный белок - Соматостатин (SRIF) -пептидный гормон, обнаруженный в 1973 г. (Brazeau P. et al. Science. 1973, Vol. 179, No 4068, P. 77-79). SRIF представляет собой циклический тетрадекапептидный гормон, содержащий дисульфидный мостик между положением 3 и положением 14 (Heiman, et al., Neuroendocrinology, 1987, Vol. 45, P. 429-436). Выявлено, что Соматостатин вырабатывается дельта-клетками поджелудочной железы, желудка и кишечника и также является одним из гормонов гипоталамуса. Он обладает способностью ингибировать высвобождение гормона роста (ГР, GH) и тиреотропного гормона (ТТГ, TSH), ингибировать высвобождение амилина, инсулина и глюкагона, снижать секрецию желудочного сока и высвобождение нейротрансмиттеров. SRIF действует также в качестве нейромодулятора в центральной нервной системе.

Наряду с этим соматостатин обладает широким спектром биологического действия - угнетает выделение пролактина, инсулина, глюкагона, гормонов поджелудочной железы и желудочно-кишечного тракта, стимулирующих пролиферативные процессы в клетке (Buscail L., Vernejoul F., Faure P., Torrisani J., Susini C. Ann Endocrinol. - 2002. - Vol. 63. - P. 2S13-8).

Соматостатин оказывает свое биологическое влияние через взаимодействие с рецепторами, расположенными на мембранах клеток. В настоящее время различают 5 типов рецепторов к соматостатину: SST1, SST2, SST3, SST4 и SST5, которые имеются как в тканях различных областей ЦНС, так и в периферических тканях (Adams R.L., Adams I.P., Lindow S.W. et al. Br. J. Cancer. - 2005. - 92. - P. 1493-1498; Kilian M., Gregor J. I., Heukamp I. et al. Clin. Exp.Metastasis. - 2009. - 26. - P. 719-727).

Несмотря на полученные положительные результаты, применение соматостатина сильно ограничено из-за его короткого периода жизни в плазме (1-3 мин) (Chapman I. М., Helfgott A., Willoughby J. О. J. Endocrinol. - 1991. - 128. - P. 369-374). Метаболизм соматостатина аминопептидазами и карбоксипептидазами сокращает период его действия. В связи с коротким сроком жизни нативного соматостатина разрабатываются различные аналоги соматостатина, например, для лечения акромегалии (Raynor, et al., Molecular Pharmacol. 43:838 (1993)).

Оказалось, что для сохранения активности критически важным является наличие в циклической части молекулы последовательности Phe7-Trp8-Lys9-Thr10. Остаток Trp8-Lys9 образует часть β-изгиба, который обычно стабилизируется заменой L-Trp на D-Trp, циклизацией скелета, дисульфидным мостиком или всеми ограничениями (Veber, D. F.. Freidinger, R. М., Schwenk-Perlow, D. et al. Nature (Lond.). 1981. - 292. - P. 55-58.). Аминокислотные фрагменты Trp и Lys обязательны, a Phe и Thr могут быть заменены, например, на Tyr и Ser или Val соответственно.

Пептидные аналоги соматостатина имеют ряд ограничений в клиническом применении, таких как низкая оральная биодоступность, относительно короткий период полураспада и иммуногенность. Практическое применение синтетических пептидных аналогов также лимитируется наличием тахифилаксии (быстрое снижение лечебного эффекта при повторном применении) и значительных антисереторных эффектов. Поэтому поиск новых метаболически стабильных синтетических агонистов соматостатина является актуальной задачей в целях улучшения клинического профиля.

Одним из путей поиска эффективных аналогов соматостатина является синтез пептидов линейной структуры.

Исследованы N-замещенные нипекотиновые и изонипекотиновые амиды дипептида beta-methylTrp-Lys-OBu-t, среди которых найдены новые селективные агонисты рецептора соматостатина 2 типа (Zhou С. et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001, Vol. 11, P. 415-417). Конъюгаты замещенной мочевины и дипептидов D-Trp-Lys-OH и D-Trp-Lys-NH2 также показали высокую активность и селективность к рецептору соматостатина 2 типа (Yang L., Guo L., Pasternak A. et al. Journal of Medicinal Chemistry, 1998, Vol. 41, No. 13, P. 2175-2179).

С целью уменьшения размеров пептида и сохранения антипролиферативной активности на основе биологически значимой аминокислотной последовательности Tyr-D-Trp-Lys пептида ТТ-232 были синтезированы короткие пептиды и пептидомиметики линейной структуры с двумя или тремя аминокислотами и Вос-защищенной аминогруппой, где Boc обозначает трет-бутилоксикарбоксильную группу (Kuriyama I. et al. Biorg. Med. Chem. 2013, Vol. 21, №2, P. 403-411). Наиболее активным признано соединение - Boc-Tyr-Ile-1-naphthylamide, которое ингибирует ДНК полимеразу-β млекопитающих, значительно подавляет рост раковых клеток карциномы толстой кишки человека (НСТ116). В процессе исследования активности амидов дипептидов (Boc-Tyr-D-Trp-1-адамантиламид) и (Вос-Tyr-D-Trp-2-адамантиламид) выявлено, что они сильно подавляют рост клеток НСТ116 (Kuriyama I. et al. Anticancer Res. 2010, Vol. 30, №12, P. 4841-4849). Необходимо отметить, что при удалении Вос-группы в данных пептидах их активность значительно снижается. Часто модификация молекул адамантановым фрагментом осуществляется для повышения липофильности и стабильности лекарственных средств, тем самым улучшая их фармакокинетику. Введение жесткого диаминоадамантанового фрагмента и D-триптофана в сверхмалый цикл одного из аналогов соматостатина для стабилизации конформационного бета-поворота пептида привело к увеличению селективности к рецепторам sst2 (Blakeney J. S., Reid R. C., Le G. Т., Fairlie D. P. Nonpeptidic Ligands for Peptide-Activated G Protein-Coupled Receptors. Chem. Rev. 2007, 107, 2960-3041). Этот аналог имеет высокое сродство к рецепторам sst2 (KD=63 нМ) и ингибирует высвобождение гормона роста in vitro и in vivo в опытах на крысах.

Наиболее сходными по своей структуре к предлагаемым коротким пептидам являются известные аналоги соматостатина линейной структуры с защитными группами, общей формулы R(R1)Cys-Phe-D-Trp-Lys(R2)-Thr-R3, основанные на фрагменте октреотида: Phe7-D-Trp8-Lys9-Thr10, входящие в качестве активного компонента в средство, обладающее противоопухолевым действием (RU 2254139, А61К 38/08, 2005). Эти пептиды частично сохраняют специфические гормональные свойства соматостатина, что проявляется подавлением секреции гормона роста (СТГ), пролактина и инсулина соответствующими эндокринными железами, наряду со значительным противоопухолевым эффектом in vitro и in vivo (Кубасова И.Ю., Борисова Л.М., Киселева М.П. и др. Российский биотерапевтический журнал. 2006. Т. 5, №3. С. 128-133; Балаев А.Н., Осипов В.Н., Федоров В.Е. и др. Российский биотерапевтический журнал. 2012. Т. 11, №4. С. 47-53; Балаев А.Н., Осипов В.Н., Федоров В.Е. и др. Российский биотерапевтический журнал. 2013. Т. 12, №3. С. 57-60). Выявлено, что наиболее активным является пентапептид Boc-Cys(Thp)-Phe-D-Trp-Lys(Z)-Thr-ОМе, который проявляет более высокую цитотоксическую активность, чем нативный соматостатин (Михаевич Е.И., Красильников М.А. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012. Т. 154, №11. С. 629-632). В данной работе показано, что индуцированный пептидом апоптоз развивается по р53-независимому механизму и сопровождается ранним подавлением активности NF-kB. Благодаря защите всех реакционно-способных групп этот пептид частично сохраняется в кислой среде желудка, что дает возможность орального применения. Данное свойство в сочетании с небольшим размером молекулы и высокой цитотоксической активностью делает этот класс соединений потенциально перспективным для терапии опухолей.

Получение пептидов, рассматриваемых как аналоги заявляемым, описано ранее в ряде публикаций.

Одним из ключевых полупродуктов для синтеза новых заявляемых соединений является пептид H-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-OMe, синтез которого описан ранее в статьях: «Балаев А.Н., Охманович К.А., Осипов В.Н. и др. Получение H-Phe-D-Trp-Lys(ε-Boc)-Thr-ОМе - тетрапептидного фрагмента синтеза аналогов соматостатина // Российский биотерапевтический журнал. 2011 г. Т. 10, №4, С. 43-47», «Балаев А.Н., Осипов В.Н., Охманович, Фёдоров В.Е. Использование F-комплекса при получении Z-Phe-D-Trp-Lys(ε-Вос)ОН в полупромышленном масштабе // Химико-фармацевтический журнал. 2014. Т. 48, №5. С. 40-42». Синтез проводился по оригинальной схеме с использованием F-комплекса для получения активированного пентафторфенилового эфира дипептида H-Phe-D-Trp-OPfp с последующим присоединением к нему гамма-Бок-лизина и метилового эфира треонина по С-концу. Дальнейшее удаление бензилоксикарбонильной группы гидрированием на палладиевом катализаторе приводило к целевому соединению.

Синтез другого структурного аналога - пептида - Boc-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-OMe описан ранее в статье «Балаев А.Н., Осипов В.Н., Фёдоров В.Е. и др. Синтез и изучение цитотоксической активности аналогов гипоталамического гормона соматостатина // Российский биотерапевтический журнал. 2012. Т. 11, №4. С. 47-53» Синтез проводился карбодиимидным методом взаимодействием Boc-Cys(Acm)-OH с тетрапептидом H-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-OMe.

Целью настоящего изобретения является получение новых производных коротких адамантилпроизводных пептидов, обладающих цитотоксическим действием, низкой токсичностью, с возможностью орального применения и с расширенным спектром противоопухолевого действия.

В качестве таких соединений предлагается короткий пептид, обладающий цитотоксическим действием, общей формулы:

,

где R1 представляет собой Н или трет-бутилоксикарбонил;

R2 представляет собой 1-аминоадамантильную, 1-амино-(1-адамантил)этильную группу;

R3 представляет собой R4-Cys(R5)- или 3-R4-тиазолидин-4-карбонил,

где R4 представляет собой Н или трет-бутилоксикарбонил;

R5 представляет собой Н, или трет-бутилоксикарбонил, или ацетомидометил.

Предлагается короткий пептид, обладающий цитотоксическим действием, выбранный из группы:

Boc-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys(Вос)-Thr-1-(1 адамантил)-этиламид,

Вос-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Вос)-Thr-1-(1 адамантил)-этиламид,

Boc-Cys(Boc)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-1-адамантиламид,

Boc-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-1-адамантиламид,

Boc-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-NH-1-адамантиламид,

где Boc обозначает трет-бутилкарбоксильную группу, Acm - ацетамидометильную группу,

Thz - остаток тиазолидин-4-карбоновой кислоты.

Все заявляемые и полученные соединения содержат общую аминокислотную последовательность из четырех аминокислот Phe-D-Trp-Lys-Thr, которая важна для сохранения активности как аналогов соматостатина. Также полученные соединения содержат цистеин или циклическое производное цистеина - тиазолидин-4-карбоновую кислоту (тиопролин), которое получают в результате взаимодействия цистеина и формальдегида, а также адамантильную группу, которая повышает цитотоксическую активность пептидов, а также их липофильность и протеолитическую стабильность.

В представленных формулах:

Boc обозначает трет-бутилкарбоксильную группу,

Acm обозначает ацетамидометильную группу,

Thz обозначает остаток тиазолидин-4-карбоновой кислоты: ,

1-адамантиламид обозначает ,

1-(1-адамантил)этиламид обозначает .

Наличие адамантанового фрагмента значительно усиливает цитотоксическое действие заявляемых соединений, при этом токсичность по отношению к нераковым клеткам - эмбриональным фибробластам человека остается низкой. Кроме того, добавление фрагмента адамантана в молекулу значительно повышает липофильность и стабильность пептидов, увеличивает проницаемость их через различные биологические мембраны, тем самым улучшая фармакокинетику лекарственных препаратов.

Особым преимуществом новых соединений является их высокая устойчивость к ферментативному разложению и возможность орального применения.

Введение может быть осуществлено любым из способов, принятых для фармацевтических, предпочтительно онкологических, средств, включая оральные и парентеральные способы, как, например, введение подкожно, внутривенно, внутримышечно и внутрибрюшинно.

Соединения могут быть введены по отдельности или в виде фармацевтических композиций.

Новые соединения получают известными методами синтеза, применимыми в пептидной химии. Пептиды синтезируют последовательным соединением аминокислот или путем связывания подходящих небольших пептидных фрагментов. При последовательном соединении, начиная с С-конца, пептидная цепь удлиняется постепенно, каждый раз на одну аминокислоту. При взаимодействии олигопептидов соединяют вместе фрагменты различной длины, а последние в свою очередь могут быть получены путем последовательного наращивания пептидной цепочки из аминокислот или из более коротких пептидов через образование амидных связей.

Химические способы для синтеза новых пептидов подробно описаны в «Synthesis of Peptides and Peptidomimetics in Houben-Weyl Methods in Organic Chemis-try Vol. E-22a / Eds. Goodman M., Felix A., Moroder L., and Toniolo C., Thieme Verlag, Stuttgart, Germany. - 2002».

Одними из ключевых полупродуктов для синтеза новых соединений являются:

пептид H-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-OMe и пептид Вос-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys(Вос)-ThrOMe, синтез которых описан выше. Новые адамантилпроизводные пептиды синтезируют путем жидкофазного синтеза с использованием стандартной методики с Z- и Вос-защитными группами.

Ниже приводятся примеры осуществления изобретения:

Пример 1

Получение Вос-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys(Вос)-Thr-ОН

Растворяют 500 мг Вос-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys(Вос)-Thr-ОМе в 7 мл метанола. При 0°С прибавляют раствор 20 мг гидроксида лития в 3 мл воды. Перемешивают реакционную массу 30 мин при комнатной температуре, добавляют 10 мл 5%-ного раствора лимонной кислоты. Отфильтровывают выпавший осадок, промывают на фильтре 5 мл воды и 5 мл гексана, сушат на воздухе. Получают 390 мг белого твердого вещества.

Пример 2

Получение Вос-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys(Вос)-Thr-1-(1-адамантил)-этиламид

К раствору 955 мг (1 ммоль) Вос-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys(Вос)-Thr-ОН, 269 мг (1.5 ммоль) 1-(1-адамантил)этиламина, 170 мг (1.1 ммоль) моногидрата N-гидроксибензотриазола в 10 мл диметилформамида при 0°С прибавляют по каплям раствор 227 мг (1.1 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 5 мл диметилформамида. Реакционную массу перемешивают 12 ч при комнатной температуре. Фильтруют выпавшие кристаллы, промывают 5 мл этилацетата, фильтрат разбавляют водой (1 объем фильтрата - 2 объема воды). Экстрагируют 2 раза по 15 мл этилацетата, органический слой промывают 10 мл 5%-ной лимонной кислотой, 10 мл воды, 10 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия, затем 2 раза по 10 мл насыщенного раствора хлористого натрия. Органическую фазу сушат над сульфатом натрия и отгоняют растворитель в вакууме (40°С, 15 мм рт. ст.), остаток растирают и сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 831 мг (74.2%) белого твердого вещества

Пример 3

Получение Вос-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Вос)-Thr-ОМе

В 30 мл диметилформамида последовательно растворяют 2.1 г (3 ммоль) H-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-OMe, 0.76 г (3.1 ммоль) Boc-Thz-OH и 0.51 г (3.1 ммоль) моногидрата N-гидроксибензотриазола. Охлаждают до 0°С и при этой температуре прибавляют по каплям раствор 0.62 г (3.0 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 5 мл диметилформамида. Реакционную массу перемешивают при этой температуре 2 ч, затем 12 ч при комнатной температуре. Отфильтровывают выпавшие кристаллы, промывают 5 мл диметилформамида, к фильтрату добавляют 50 мл 1%-ной лимонной кислоты. Экстрагируют 2 раза по 15 мл этилацетата, органический слой промывают 10 мл воды, 10 мл 5%-ного бикарбоната натрия, 2 раза по 10 мл насыщенного раствора хлористого натрия. Органическую фазу сушат над сульфатом натрия и отгоняют растворитель в вакууме (40°С, 15 мм рт. ст.), остаток растирают и сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 2.4 г белого твердого вещества.

Пример 4

Получение Boc-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-OH

Растворяют 500 мг Вос-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys(Вос)-Thr-ОМе в 7 мл метанола. При 0°С прибавляют раствор 20 мг гидроксида лития в 3 мл воды. Перемешивают реакционную массу 30 мин при комнатной температуре, добавляют 10 мл 5%-ного раствора лимонной кислоты. Отфильтровывают выпавший осадок, промывают на фильтре 2 раза по 5 мл воды и 5 мл гексана, сушат на воздухе. Получают 420 мг белого твердого вещества.

Пример 5

Получение Boc-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-1-(1 адамантил)-этиламид

К раствору 896 мг (1 ммоль) Boc-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-OH, 269 мг (1.5 ммоль) 1-(1-адамантил)этиламина, 170 мг (1.1 ммоль) моногидрата N-гидроксибензотриазола в 10 мл диметилформамида при 0°С прибавляют по каплям раствор 227 мг (1.1 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 5 мл диметилформамида. Реакционную массу перемешивают 12 ч при комнатной температуре. Фильтруют выпавшие кристаллы, промывают 5 мл этилацетата, фильтрат разбавляют водой (1 объем фильтрата - 2 объема воды). Экстрагируют 2 раза по 15 мл этилацетата, органический слой промывают 10 мл 5%-ной лимонной кислотой, 10 мл воды, 10 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия, затем 2 раза по 10 мл насыщенного раствора хлористого натрия. Органическую фазу сушат над сульфатом натрия и отгоняют растворитель в вакууме (40°С, 15 мм рт. ст.), остаток растирают и сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 797 мг (75.4%) белого твердого вещества.

Пример 6

Получение Boc-Cys(Boc)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-OMe

В 150 мл диметилформамида при перемешивании последовательно растворяют 20.80 г (30 ммоль) H-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-OMe, 4.59 г (30 ммоль) моногидрата N-гидроксибензотриазола, 10.59 г (33 ммоль) Boc-Cys(Boc)-OH. Охлаждают до 0°С и при этой температуре добавляют по каплям раствор 6.78 г (33 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 25 мл диметилформамида. Реакционную массу перемешивают при этой температуре 2 ч и еще 12 ч при комнатной температуре. Фильтруют выпавшие кристаллы, промывают 20 мл этилацетата, фильтрат разбавляют водой (1 объем фильтрата - 2 объема воды). Экстрагируют 2 раза по 100 мл этилацетата, органический слой промывают 25 мл 5%-ной лимонной кислотой, 25 мл воды, 25 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия, затем 2 раза по 25 мл насыщенного раствора хлористого натрия. Органическую фазу сушат над сульфатом натрия и отгоняют растворитель в вакууме (40°С, 15 мм рт. ст.), остаток растирают и сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 27.54 г (92.1%) белого мелкокристаллического вещества.

Пример 7

Получение Boc-Cys(Boc)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-OH

Растворяют 10.00 г Boc-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-OMe в 150 мл метанола. При 0°С прибавляют раствор 400 мг гидроксида лития в 50 мл воды. Перемешивают реакционную массу 30 мин при комнатной температуре, добавляют 200 мл 5%-ного раствора лимонной кислоты. Отфильтровывают выпавший осадок, промывают на фильтре 2 раза по 50 мл воды и 50 мл гексана, сушат на воздухе. Получают 8.94 г белого твердого вещества.

Пример 8

Получение Boc-Cys(Boc)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-1-(1 адамантил)-этиламид

К раствору 984 мг (1 ммоль) Boc-Cys(Boc)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-OH, 269 мг (1.5 ммоль) 1-(1-адамантил)этиламина, 170 мг (1.1 ммоль) моногидрата N-гидроксибензотриазола в 10 мл диметилформамида при 0°С прибавляют по каплям раствор 227 мг (1.1 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 5 мл диметилформамида. Реакционную массу перемешивают 12 ч при комнатной температуре. Фильтруют выпавшие кристаллы, промывают 5 мл этилацетата, фильтрат разбавляют водой (1 объем фильтрата - 2 объема воды). Экстрагируют 2 раза по 15 мл этилацетата, органический слой промывают 10 мл 5%-ной лимонной кислотой, 10 мл воды, 10 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия, затем 2 раза по 10 мл насыщенного раствора хлористого натрия. Органическую фазу сушат над сульфатом натрия и отгоняют растворитель в вакууме (40°С, 15 мм рт. ст.), остаток растирают и сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 906 мг (79.1%) белого твердого вещества

Пример 9

Получение Boc-Cys(Boc)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-1- адамантиламид

К раствору 984 мг (1 ммоль) Boc-Cys(Boc)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr-OH, 281 мг (1.5 ммоль) 1-адамантиламина гидрохлорида, 170 мг (1.1 ммоль) моногидрата N-гидроксибензотриазола и 150 мг (1.5 ммоль) N-метилморфолина в 10 мл диметилформамида при 0°С прикапывают раствор 227 мг (1.1 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 5 мл диметилформамида. Реакционную массу перемешивают 12 ч при комнатной температуре. Фильтруют выпавшие кристаллы, промывают 5 мл этилацетата, фильтрат разбавляют водой (1 объем фильтрата - 2 объема воды). Экстрагируют 2 раза по 15 мл этилацетата, органический слой промывают 10 мл 5%-ной лимонной кислотой, 10 мл воды, 10 мл насыщенного раствора- бикарбоната натрия, затем 2 раза по 10 мл насыщенного раствора хлористого натрия. Органическую фазу сушат над сульфатом натрия и отгоняют растворитель в вакууме (40°С, 15 мм рт. ст.), остаток растирают и сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 900 мг (80.5%) белого твердого вещества

Пример 10

Получение Вос-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys(Вос)-Thr-1- адамантиламид

К раствору 955 мг (1 ммоль) Вос-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys(Вос)-Thr-ОН, 281 мг (1.5 ммоль) 1-адамантиламина гидрохлорида, 170 мг (1.1 ммоль) моногидрата N-гидроксибензотриазола и 150 мг (1.5 ммоль) N-метилморфолина в 10 мл диметилформамида при 0°С прикапывают раствор 227 мг (1.1 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 5 мл диметилформамида. Реакционную массу перемешивают 12 ч при комнатной температуре. Фильтруют выпавшие кристаллы, промывают 5 мл этилацетата, фильтрат разбавляют водой (1 объем фильтрата - 2 объема воды). Экстрагируют 2 раза по 15 мл этилацетата, органический слой промывают 10 мл 5%-ной лимонной кислотой, 10 мл воды, 10 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия, затем 2 раза по 10 мл насыщенного раствора хлористого натрия. Органическую фазу сушат над сульфатом натрия и отгоняют растворитель в вакууме (40°С, 15 мм рт. ст.), остаток растирают и сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 856 мг (76.5%) белого твердого вещества

Пример 11

Получение Вос-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Вос)-Thr-NH-1 - адамантиламид

К раствору 896 мг (1 ммоль) Вос-Thz-Phe-D-Trp-Lys(Вос)-Thr-ОН, 281 мг (1.5 ммоль) 1-адамантиламина гидрохлорида, 170 мг (1.1 ммоль) моногидрата N-гидроксибензотриазола и 150 мг (1.5 ммоль) N-метилморфолина в 10 мл диметилформамида при 0°С прикапывают раствор 227 мг (1.1 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 5 мл диметилформамида. Реакционную массу перемешивают 12 ч при комнатной температуре. Фильтруют выпавшие кристаллы, промывают 5 мл этилацетата, фильтрат разбавляют водой (1 объем фильтрата - 2 объема воды). Экстрагируют 2 раза по 15 мл этилацетата, органический слой промывают 10 мл 5%-ной лимонной кислотой, 10 мл воды, 10 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия, затем 2 раза по 10 мл насыщенного раствора хлористого натрия. Органическую фазу сушат над сульфатом натрия и отгоняют растворитель в вакууме (40°С, 15 мм рт. ст.), остаток растирают и сушат на воздухе до постоянного веса. Получают 785 мг (76.1%) белого твердого вещества

Синтезированные пептиды были очищены и проанализированы.

Препаративная ВЭЖХ

Очистку проводили с помощью препаративной обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Для очистки тетрапептидов использовалась хроматографическая система, состоящая из 2 насосов GILSON 306 производительностью до 25 мл в минуту, манометрического модуля GILSON 805 и спектрофотометрического детектора UVV-105 (производство фирмы JET chrom). Разделение производилось на колонке ReproSil-PurAQ С18 5 мкм, размером 250*10 мм с предколонкой ReproSil-PurAQ С18 10 мкм, размером 30*8 мм. Элюент: 60% водный ацетатно-аммонийный буфер (рН=5)/40% ацетонитрил.

Все соединения были очищены до содержания основного вещества выше 98%.

ВЭЖХ-МС:

Чистоту полученных соединений определяли при помощи аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографической системе Agilent LC/MS 1200 (колонка - ReproSil-Pur Basic С18 5 мкм размером 250×4,6 мм с предколонкой SecurityGuard Cartridges Widepore C18 4×2 мм; подвижная фаза: градиент с 95% вода +5% ацетонитрил до 100% ацетонитрил с буферизацией 0,01% трифторуксусной кислотой за 20 минут). Детектирование на УФ-детекторе с длиной волны 220 нм.

Содержание основного вещества в образце определяли по относительной величине площади пика на хроматограмме.

Спектры ESI-MS регистрировались на MS детекторе Agilent Ion Trap 6310. Ионизация пробы с помощью электроспрея, регистрация в режиме положительных ионов, в некоторых случаях в режиме отрицательных ионов.

Настройки масс-детектора:

- давление на нибулайзере 40 psi;

- напряжение на нибулайзере 3500 вольт;

- поток шторного газа 7 л в минуту;

- температура газа носителя 360°С;

- детекция масс в диапазоне от 70 до 1500 атомных единиц массы.

Параметром, характеризующим анализируемое вещество, является молекулярный вес иона, определенный МС детектором.

Структуры и физико-химические характеристики полученных соединений приведены в таблице 1.

Синтезированные соединения были испытаны на цитотоксическую активность.

Цитотоксическую активность заявляемых соединений определяли с помощью МТТ-теста. Концентрацию полумаксимального ингибирования (IC50) для синтезированных веществ определяли на клетках рака молочной железы линии MCF-7, клетках аденокарциномы простаты линии РС-3, клетках колоректального рака линии НСТ-116 и ФЭЧ (фибробласты эмбриональные человека). Клетки MCF-7 и ФЭЧ культивировали в среде DMEM, клетки РС-3 и НСТ-116 - в среде RPMI1640 (ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (GE Healthcare LifeSciences) и гентамицина в концентрации 40 мг/мл.

Клетки MCF-7, РС-3 и НСТ-116 рассевали в 96-луночные планшеты по 5×103 клеток в лунку в 90 мкл культуральной среды.

Исследуемые вещества растворяли в ДМСО до получения концентрации 1×10-2 М, для последующего разведения веществ использовалась бессывороточная культуральная среда.

Через сутки в лунки с клетками добавляли растворы испытуемых веществ в объеме 10 мкл на лунку в различных концентрациях. Использовалась линейка из 10 концентраций, от 1×10-4М до 2×10-7М, каждая концентрация добавлялась в 3-4 повторах. В контрольные лунки добавляли 10 мкл бессывороточной среды. Клетки культивировали в СО2-инкубаторе в атмосфере 5% СО2, при 100% влажности и температуре 37°С в течение 72 часов. Затем в лунки добавляли реагент МТТ в концентрации 5 мг/мл в объеме 20 мкл на лунку. После 1,5-2 часовой инкубации в атмосфере 5% СО2, при 100% влажности и температуре 37°С планшеты центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут, удаляли супернатант и в каждую лунку добавили по 60 мкл ДМСО для растворения осадка кристаллов фармазана. Через 30 минут инкубации при комнатной температуре, после полного растворения кристаллов формазана, уровень оптической плотности определяли с помощью спектрофотометра Multiskan FC (Thermo Scientific), при длине волны 594 нм.

Далее в компьютерной программе строился график зависимости уровня оптической плотности (проценты от контроля) от концентрации исследуемого вещества и рассчитывалась концентрация IC50.

Результаты испытаний приведены в Таблице 2.

Как показали исследования, особым преимуществом новых соединений перед известными аналогами является их высокая цитотоксическая активность и устойчивость к ферментативному разложению, что дает возможность их орального введения в организм, дополнительно к парентеральному, осуществляемому подкожно, внутривенно, внутримышечно и внутрибрюшинно. Кроме повышения цитотоксичности добавление фрагмента адамантана в молекулу также значительно повышает липофильность и протеолитическую стабильность пептидов, тем самым улучшая их фармакокинетику.

К изобретению «Короткий пептид, обладающий цитотоксическим действием»

Как компенсировать расходы
на инновационную разработку
Похожие патенты