[2]Область техники, к которой относится изобретение
[3]Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и, в частности, к генетической инженерии и может быть использовано в микробиологической и биофармацевтической промышленности для крупномасштабного производства карбоксипептидазы Б человека.
[5]Карбоксипептидаза Б (ЕС 3.14.17.2) - фермент, относящийся к классу металлозависимых протеиназ, который осуществляет специфический гидролиз пептидной связи с отщеплением С-концевых положительно заряженных остатков аминокислот, таких как лизин или аргинин. In vivo данный энзим вовлечен в процессинг гормонов, таких как инсулин, и различных белковых факторов, является участником каскада реакций системы свертывания крови и тромбоцитарного гемостаза. Последние исследования показали, что фермент играет значительную роль в развитии воспалительных и аутоиммунных процессов, тромбоэмболии и канцерогенезе (Guimarães А.Н.С., Laurens N., Weijers E.M. et al., 2011), а разработка лекарственных препаратов, селективно ингибирующих активность карбоксипептидаз, является одним из перспективных направлений для лечения таких заболеваний. Однако в настоящее время структурные особенности и функции фермента недостаточно изучены. К тому же, существует острая потребность в карбоксипептидазе Б для производства препаратов рекомбинантного инсулина, которая вызвана использованием природного энзима, выделенного из поджелудочной железы животных. Применение технологии рекомбинантной ДНК позволит получать целевой фермент в любых необходимых количествах и, кроме того, обеспечит базис для проведения белковоинженерных исследований, направленных на улучшение характеристик фермента путем введения направленных мутаций в его структуру.
[6]Использование бактериальной системы экспрессии Е. coli позволяет получить достаточно большие количества карбоксипептидазы, однако, сложная пространственная структура белка, высокая молекулярная масса и наличие трех дисульфидных связей является причиной агрегации гетерологичного белка и накопления преимущественно в тельцах включения. Длительность, трудоемкость и дороговизна методов - характерная черта экспрессии при использовании клеточных линий млекопитающих. Клетки дрожжей, в частности P. pastoris, сочетают в себе преимущества данных систем. Эти низшие эукариоты обладают развитой системой ЭПР для осуществления разнообразных посттрансляционных модификаций белков, а также просты и удобны в культивировании. Следует отметить тот факт, что биосинтез рекомбинантного фермента осуществляется в виде неактивной проформы. Активным энзим становиться после удаления пропептида путем расщепления трипсином.
[7]Наиболее близким к заявляемому техническому решению (прототипом) является способ, описанный в работе [Kim Mi-Jin, Kim Sang-Hyuk et al. High-Level Secretory Expression of Human Procarboxypeptidase В by Fed-Batch Cultivation of Pichia pastoris and its Partial Characterization. J. Microbiol.Biotechnol., 2008]. Рекомбинантная плазмидная ДНК содержит ген искусственного предшественника прокарбоксипептидазы Б человека, который состоит из последовательности, кодирующей сигнальный пептид α-фактора Saccharomyces cerevisiae и кДНК профермента, находящихся под контролем индуцибельного промотора АОХ1. Биосинтез рекомбинантного белка осуществляется при культивировании клеток на среде BMMY, содержащей 0,5% (v/v) метанола. Культивирование проводится в течение 60 часов, при этом целевой профермент секретируется в культуральную жидкость. Анализ уровня экспрессии белка производится при помощи иммуновестерн-блотинга. Недостатком способа-прототипа является относительно низкий уровень синтеза и секреции рекомбинантного фермента, который для лабораторных условий составляет около 3,5 ед/мл культуральной среды.
[9]Изобретение решает задачу получения карбоксипептидазы Б человека в клетках Pichia pastoris (назначение изобретения) с высоким (по сравнению с прототипом) выходом целевого продукта (технический результат).
[10]Поставленная задача решается путем конструирования рекомбинантной интегративной плазмиды рСРВН, обеспечивающей синтез полипептида со свойствами прокарбоксипептидазы Б человека, с уровнем экспрессии порядка 20-40 мг рекомбинантного белка на литр культуры, и рекомбинантного штамма Pichia pastoris GS115CPBH, полученного путем транформации дрожжевых клеток и последующих отбора и выращивания трансформированных клонов с максимальной продуктивностью.
[11]Рекомбинантная плазмидная ДНК рСРВН, кодирующая полипептид со структурой прокарбоксипептидазы, характеризуется следующими признаками:
[12]предназначается для интегрирования в геном и экспрессии гена предшественника карбоксипептидазы Б человека;
[13]имеет молекулярную массу 7,78 МДа (10,466 т.п.о.);
[14]состоит из XhoI/EcoRI - фрагмента ДНК плазмиды pPIC9K длиной 9,246 т.п.о.
[15]и XhoI/EcoRI фрагмента длиной 1,220 т.п.о., включающего участок, кодирующий сигнальный пептид α-фактора Saccharomyces cerevisiae, и синтетический ген прокар-боксипептидазы Б человека с последовательностью, соответствующей последовательности, представленной на фиг.2
[16]Особенностью предложенной плазмидной конструкции является то, что встраиваемый в вектор-носитель фрагмент представляет нуклеотидную последовательность, кодирующую предшественник карбоксипептидазы Б человека, в котором участок, кодирующий собственную сигнальную последовательность белка заменен участком, кодирующим сигнальный пептид α-фактора Saccharomyces cerevisiae, а остальная (кодирующая прокарбоксипептидазу Б) часть последовательности сконструирована путем разработки конкретного дизайна гена (фиг.2).
[17]Для получения штамма-продуцента полипептида со структурой и свойствами карбоксипептидазы Б человека трансформируют клетки Pichia pastoris штамма GS115 (his4, mut+) рекомбинантной плазмидой рСРВН, предварительно линеаризованной по 5′-участку АОХ1-промотора.
[18]Краткое описание фигур
[19]На рис.1 представлена физическая карта рекомбинантной плазмиды рСРВН; на рис.2 - нуклеотидная последовательность синтетического гена искусственного предшественника карбоксипептидазы Б человека. Жирной линией подчеркнут сайт рестриктазы EcoRI, терминирующий кодон выделен жирным шрифтом; на рис.3 - аминокислотная последовательность фермента, кодируемого синтетическим геном. Жирным шрифтом и подчеркиванием показан пропептид фермента; на рис.4 - результаты денатурирующего ПААГ-гель электрофореза образцов культуральной жидкости трансформантов при определении уровня экспрессии продукта. Слева расположен маркер молекулярных весов (10; 18,4; 25; 35; 62; 90 КДа), далее трансформанты (номер подписан снизу).
[20]Осуществление изобретения
[21]Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
[22]При осуществлении изобретения, помимо методов, подробно раскрытых в нижеследующих примерах, использовали хорошо известные специалистам методики, описанные в руководствах по молекулярной биологии и генетической инженерии [Sambrook J., Fritsch E,F, and Maniatis T. Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 1989, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York; Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., & Struhl, K. Current Protocols in Molecular Biology, 1997, John Wiley and Sons, New York; Cregg J.M, Higgins D.R. Production of foreign proteins in the yeast Pichia pastoris, 1995, Canadian J. Botany Supp.73, 5981-5987.
[23]Пример 1. Создание экспрессионного вектора рСРВН.
[24]А) Дизайн варианта синтетического гена прокарбоксипептидазы Б разрабатывали на основе известной аминокислотной последовательности прокарбоксипептидазы Б человека при помощи программы DNA Builder, руководствуясь информацией о составе кодонов сильно экспрессирующихся генов P. pastoris [Bai J, Swartz DJ, Protasevich II, Brouillette CG, Harrell PM, Hildebrandt E, Gasser B, Mattanovich D, Ward A, Chang G, Urbatsch IL. A gene optimization strategy that enhances production of fully functional P-glycoprotein in Pichia pastoris. PLoS One.6(8), 2011].
[25]Полученный вариант гена анализировали и заменяли нуклеотидные триплеты так, чтобы содержание G+C нуклеотидов было на уровне 42%, так как именно это соотношение наблюдается в природных генах, сильно экспрессирующихся в Pichia pastoris [De Schutter K, Lin YC, Tiels P, Van Hecke A, Glinka S, Weber-Lehmann J, Rouze P, Peer Y Van de, Callewaert N. Genome sequence of the recombinant protein production host Pichia pastoris. Nat Biotechnol. 2009 Jun; 27(6):561-6].
[26]При помощи программы Vienna RNA Websuite проверяли структуру получающейся мРНК гена прокарбоксипептидазы Б на наличие обширных вторичных структур и при необходимости вносили замены в кодоновый состав гена.
[27]При помощи программы Clone Manager полученную нуклеотидную последовательность гена проверяли на наличие рестрикционных сайтов, используемых в дальнейшей работе. Найденные рестрикционные сайты удаляли с помощью замены соответствующего нуклеотидного триплета с использованием таблицы кодонов P. pastoris.
[28]Составленную таким образом нуклеотидную последовательность гена прокарбоксипептидазы Б, оптимизированную для экспрессии в клетках P. pastoris, разбивали на олигонуклеотиды длиной 50 н.п. с помощью программы DNA Builder для последующей сборки полного гена методом рекомбинантной ПЦР. При дизайне 5′ фланкирующего праймера к его 5′-концевой последовательности добавляли сайт рестриктазы XhoI, а при дизайне 3′ фланкирующего праймера - сайт рестриктазы EcoRI. Эти сайты были необходимы для последующего создания экспрессионной конструкции.
[29]Исходя из известности нуклеотидной последовательности, кодирующей сигнальный пептид альфа-фактора S. cerevisiae и разработанного дизайна гена прокарбоксипептидазы Б, были сконструированы олигонуклеотидные последовательности праймеров для наработки полного (включающего лидерную последовательность) искусственного гена прокарбоксипептидазы Б человека с необходимыми концевыми сайтами рестрикции для последующего встраивания фрагмента в плазмидную конструкцию.
[30]ПЦР-амплификацию проводили в два этапа. В реакцию вносили эквимолярную смесь (5 мкМ каждого) олигонуклеотидных праймеров (всех, кроме крайних), составляющих ген, взаимно перекрывающихся между собой на 15-20 нуклеотидов, 0.2 мкМ раствора dNTP, 1/10 часть реакционного 10х буфера и 1 ед. термостабильной ДНК-полимеразы PfuI. Температуру отжига праймеров рассчитывали по стандартной формуле:
[31]Tm(°C)=2·[NA+NT]+4·[NC+NG]-10,
[32]где NX - количество соответствующих оснований. Реакцию проводили по следующей схеме: денатурация ДНК при 95°C, 5 минут; затем 10 циклов: денатурация ДНК при 95°C, 1 минута; отжиг праймеров при 55°C, 1 минута; синтез ДНК при 74°C, 2,5 минуты. Вторую амплификацию проводили, используя в качестве матрицы раствор первой реакции и крайние праймеры, обеспечивающие синтез гена с необходимыми сайтами рестриктаз, по следующей схеме: денатурация ДНК при 95°C, 5 минут; затем 30 циклов: денатурация ДНК при 95°C, 1 минута; отжиг праймеров при 55°C, 1 минута; синтез ДНК при 74°C, 2,5 минуты.
[33]Смесь для ПЦР (50 мкл):
[34]5 мкл 10-кратного буфера для PfuI-полимеразы («Евроген»);
[36]0,5 мкл 100 мкМ праймера CPBH_f;
[37]0,5 мкл 100 мкМ праймера СРВН_r;
[38]1 мкл 10 мМ dNTP каждого вида («Fermentas»);
[39]43 мкл деионизованной воды;
[40]0,5 мкл PfuI ДНК-полимеразы («Fermentas»).
[41]После амплификации 5 мкл ПЦР смеси анализировали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле и выявляли гомогенный фрагмент размером около 1230 пн. Фрагмент выделяли из геля с помощью набора GelElute Plasmid Miniprep Kit (Sigma, США) в соответствии с инструкцией производителя.
[42]Б) В качестве вектора-носителя использовали интегративную плазмиду pPIC9K (In-vitrogen, США). С целью накопления плазмиды, проводили трансформацию компетентных клеткок штамма Escherichia coli XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F′proAB lacIqZ□M15 Tn10 (Tetr)] (Stratagene, США), затем из полученных ампициллин-устойчивых трансформантов выделяли препараты плазмидной ДНК с использованием набора QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией изготовителя.
[43]В) 200 нг исходной плазмиды pPIC9K и 100 нг полученного фрагмента (полной последовательности искусственного гена proCPBH) гидролизовали 20 единицами рестрик-таз XhoI (New England Biolabs, США) и EcoRI (New England Biolabs, США). Выделенный из агарозного геля XhoI/EcoRI фрагмент клонировали в XhoI/EcoRI вектор pPIC9K - лигировали с помощью Т4 ДНК лигазы (на 20 нг вектора 1,5 нг фрагмента). Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки штамма Escherichia coli XL1-Blue, затем из полученных ампициллин-устойчивых трансформантов выделяли препараты плазмидной ДНК с использованием набора QIAprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией изготовителя. Полученные образцы ДНК анализировали совместным гидролизом рестриктазами EcoRI/XhoI, NotI/NcoI, и отбирали «положительные» клоны, содержащие EcoRI/XhoI фрагменты размером 1220 и 9246 п.н., а также NotI/NcoI фрагменты размером 2397 и 8069 п.н, а на наличие мутаций плазмиды анализировали методом секвенирования ДНК. В конечном счете отбирали экспрессионный вектор, представленный на фиг.1 и обозначенный как рСРВН.
[44]Пример 2. Создание экспрессионных кассет и отбор трансформантов для синтеза карбоксипептидазы Б в клетках метилотрофных дрожжей Pichia Pastoris.
[45]Необходимым условием стабильной экспрессии генов в составе генома дрожжей является создание экспрессионной кассеты. Для этого линеаризуют векторную молекулу по 5′-участку алкогольоксидазного промотора. После электропорации, в результате гомологичной рекомбинации идентичных участков промотора генома дрожжей и линеаризованного вектора, происходит включение интересующего гена в геном Pichia pastoris.
[46]Для электропорации получали 5 мкл раствора ДНК (рСРВН), предварительно линеаризованной путем гидролитического расщепления рестриктазой PmeI (Fermentas, Литва), с рабочей концентрацией не менее 2 мкг/мкл. 20 мкг плазмиды гидролизовали 100 единицами рестриктазы PmeI в течение 3 часов. К 1 объему реакционной смеси добавляли равный объем фенол-хлороформа (1:1). Перемешивали 30 сек на вортексе. Центрифугировали в течение 3 мин. Отбирали водную фазу и переносили в новую пробирку. Добавляли в пробирку с фенол-хлороформом 100 мкл ТЕ-буфера, затем перемешивали 30 сек на вортексе и центрифугировали в течение 3 мин. Отбирали водную фазу при помощи пипетки и объединяли с той частью раствора, которая была отобрана ранее. Добавляли к раствору ДНК 1/10 объема 3М раствора ацетата Na, pH 6.0 и 3 объема этанола. Перемешивали, переворачивая пробирку несколько раз, и оставляли на 10 минут. Затем центрифугировали в течение 15 мин. Супернатант сливали, пробирку с осадком ДНК центрифугировали в течение 2 мин. Супернатант тщательно удаляли и добавляли 1 мл 70%-ного этанола. Центрифугировали в течение 2 мин. Супернатант сливали. Снова повторяли центрифугирование в течение 2 мин и отбирали оставшуюся жидкость. Осадок высушивали в течение 5 мин и растворяли в 5 мкл ТЕ-буфера.
[47]Культуру дрожжей штамма P. pastris GS115 (his 4, mut+) растили на среде YPD в колбах Эйрленмейера объемом 500 мл до оптической плотности 1-2 единицы. Центрифугировали при 3000 х g в течение 5 минут. Биомассу суспендировали в 1 мМ DTT и 0,1 М HEPES, инкубировали на шейкере в течение 30 минут. Затем культуру снова центрифугировали. Биомассу промывали холодной деионизированной водой 2 раза и суспендировали в 1 мл 1 М сорбитола. Полученные клетки разливали по эппендорфам (по 40 мкл в каждый) и хранили при -70°C. Электропорацию проводили на электропораторе 2510 (Eppendorf, Германия) в специальных кюветах с зазором 2 мм. Рабочие характеристики - напряжение: 1500 В; емкость: 25 мкФ; сопротивление: 600 Ом. После электропорации быстро добавляли 1 мл холодного раствора 1 М сорбитола и ставили в термостат на 1 час при температуре 30°C.
[48]Отбор трансформантов проводили на минимальной среде, не содержащей гистидина. После электропорации культуру клеток рассевали на чашки с плотной питательной средой MD agar. Полученные трансформанты переносили на плотный питательный агар YPD, содержащей генетицин в концентрациях 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,5 мг/мл. Полученные клоны проверяли с помощью ПЦР-скрининга. Готовили ПЦР-смесь объемом 20 мкл по следующей схеме:
[49]2 мкл 10-кратного буфера для Taq-полимеразы («Евроген»);
[50]0,15 мкл 120 мкМ праймера AOX1_f;
[51]0,15 мкл 150 мкМ праймера YC1_r;
[52]0,4 мкл 10 мМ dNTP каждого вида («Fermentas»);
[53]17 мкл деиопизованной воды;
[54]0,2 мкл Taq ДНК-полимеразы («Евроген»).
[55]В каждую пробирку добавляли клетки трансформантов с плотной среды. Тщательно суспендировали и амплифицировали по следующей схеме: 95°, 5′ (денатурация), 95°, 30″; 45°, 30″; 74°, 1′30″ (амплификация).
[56]«Положительные» клоны отбирали для определения уровня экспрессии рекомбинантного белка.
[57]Пример 3. Культивирование трансформантов и определение уровня экспрессии гена proCPBH.
[58]Трансформанты с чашек переносили на среду YPD (10 мл) и растили при 30°C до оптической плотности 2-4 единицы. Затем культурой клеток инокулировали среду BMGY (25 мл) (разведение в 100 раз) и инкубировали в течение 48 часов при 30°C в колбах объемом 250 мл. Полученную биомассу собирали центрифугированием при 2000×g в течение 5 минут и переносили в среду BMMY (10 мл), содержащую 1% (v/v) метанола. Выращивание проводили в колбах на 100 мл в течение 72 часов, добавляя каждые 24 часа в среду 1% (v/v) метанола. После выращивания культуральную жидкость отделяли от биомассы центрифугированием при 3000×g в течение 5 минут при 4°C. Полученные образцы смешивали с 1/6 объема «Sample Loading Buffer 6×» и анализировали при помощи денатурирующего ПААГ-электрофореза в стандартном режиме (фиг.4). Клон с максимальным уровнем экспрессии отобрали для получения рекомбинантного штамма, который был обозначен как P. pastoris GS115CPBH.
[59]Полученный штамм характеризуется следующими признаками:
[60]Морфологические признаки. Клетки крупные округлой формы, почкующиеся, 1х 4-7 мкм, подвижные.
[61]Культуральные признаки. При росте на плотной среде YPD колонии круглые, гладкие, блестящие, кремовые, край ровный, диаметр колоний 3-6 мм; консистенция пастообразная. Рост в жидкой среде YPD характеризуется ровным помутнением с образованием легкого осадка.
[62]Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут при температуре 4-30°C при оптимуме pH 4,0-6,2. В качестве источника азота используют как минеральные соли в виде смеси, так и органические соединения в виде пептона, дрожжевого экстракта, аминокислот. В качестве источника углерода используют глицерин, глюкозу, метанол. В отличие от исходного штамма не является ауксотрофом по гистидину.
[63]Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 200 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена бета-лактамазы, а также к генетицину (до 100 мкг/мл), обусловленную наличием в плазмиде гена Kan.
[64]Штамм P. pastoris GS115CPBH обеспечивает синтез полипептида со свойствами прокарбоксипептидазы Б человека в количестве примерно 40 мг целевого белка на литр культуры. Совокупность перечисленных свойств штамма обусловливает большую технологичность процесса получения рекомбинантного фермента.
[65]Пример 4. Определение продуктивности полученного рекомбинантного штамма.
[66]Пример 4. Определение уровня экспрессии прокарбоксипептидазы Б у полученного рекомбинантного штамма.
[67]Определение активности СРВ в культуральной жидкости проводили, как описано в работе [Kim MJ, Kim SH, Lee JH, Seo JH, Lee JH, Kim JH, Kim YH, Nam SW. High-level secretory expression of human procarboxypeptidase В by Fed-Batch cultivation of Pichia pastoris and its partial characterization. J Microbiol Biotechnol. 2008 Dec; 18(12):1938-44]:
[68]1. Активация СРВ. 100 мкл супернатанта культуральной жидкости обрабатывали трипсином 5 Ед/л при 37°C в течение 1 часа. Затем реакцию останавливали добавлением PMSF до 1 мМ.
[69]2. Определение активности. К 900 мкл активационного буфера (50 мМ Tris-HCl, 1 мкМ ZnCl2, pH 7.5), содержащего 1 мМ гиппурил-L-аргинин, добавляли 100 мкл раствора активированной СРВ и проводили измерение поглощения на спектрофотометре при длине волны 254 нм.
[70]3. Расчет. За одну единицу активности СРВ принимается количество фермента гидролизующего 1 мкМ гиппурил-L-аргинин за 1 минуту при pH 7,5 и температуре 25°C.
[71]Активность СРВ (Ед/мл)=ΔA254/(0,349*Δt)*10,
[72]где ΔА254 - приращение оптической плотности,
[73]Δt - время измерения,
[74]0,349 - коэффициент экстинкции гиппуровой кислоты, образующейся в результате реакции расщепления субстрата ферментом,
[75]10 - коэффициент разбавления образца.
[76]Измеренная активность образцов культуральной жидкости, полученной при выращивании штамма-продуцента P. pastoris GS115CPBH, составила не менее 9,0 ед/мл (при 3,5 ед/мл в прототипе).
