патент
№ RU 2631613
МПК G01N33/48

Способ определения топирамата в плазме крови

Авторы:
Абаимов Денис Александрович Сариев Абрек Куангалиевич Прохоров Денис Игоревич
Все (18)
Номер заявки
2016122088
Дата подачи заявки
03.06.2016
Опубликовано
25.09.2017
Страна
RU
Дата приоритета
24.06.2024
Номер приоритета
Страна приоритета
Как управлять
интеллектуальной собственностью
Иллюстрации 
3
Реферат

Изобретение относится к фармакологии и может быть использовано для проведения терапевтического лекарственного мониторинга топирамата у пациентов в условиях стационара. Для этого проводят количественное определение топирамата в плазме крови человека с использованием высокоселективного метода хроматомасс-спектрометрии. Анализ проводят с использованием матрицы раствора внутреннего стандарта - 2,3-4,5-бис-О-изопропилиден-бета-D-фруктопиранозы-N-(4-хлорбензоил)сульфамата и топирамата, полученного экстракцией из плазмы крови. Разделение продуктов экстракции проводят на колонке ХTerra MS C18. Элюирование со скоростью 0,8 мл/мин при температуре колонки 35°C проводят раствором А (10 мМ ацетат аммония) и раствором Б (смесь ацетонитрила и 10 мМ ацетата аммония в отношении 90:10) в соотношении раствор А : раствор Б = 40:60 (%). Топирамат детектируют по четырем дочерним ионам с m/z 95.9, 122.0, 161.9, 280.0, образующимся в результате фрагментации родительского молекулярного иона топирамата с m/z 338.2, а его концентрацию рассчитывают по формуле: С=15,06732079×AR, где С - концентрация топирамата (мкг/мл), AR - отношение площади хроматографического пика топирамата к площади пика внутреннего стандарта. Изобретение позволяет количественно и с высокой достоверностью определять топирамат в плазме крови пациентов. 1 табл., 4 ил.

Формула изобретения

Способ количественного определения топирамата в плазме крови, включающий анализ крови на наличие топирамата высокоселективным методом хроматомасс-спектрометрии, отличающийся тем, что проводят хроматомасс-спектрометрию с использованием матрицы в виде плазмы крови с топираматом и внутреннего стандарта, вещества, близкого по строению молекулы к анализируемому веществу - 2,3-4,5-бис-О-изопропилиден-бета-D-фруктопиранозы-N-(4-хлорбензоил)сульфамата, разделение продуктов экстракции проводят на обращенно-фазной хроматографической колонке 4,6×150 мм, при этом в качестве элюента применяют 10 мМ ацетат аммония - раствор А и смесь ацетонитрила и 10 мМ ацетата аммония в отношении 90:10 - раствор Б, взятых в процентном соотношении раствора А к раствору Б 40:60 соответственно, с температурой разделения 35°C, и скоростью подачи элюента 0,8 мл/мин, детектирование топирамата проводят по четырем дочерним ионам с m/z 95.9, 122.0, 161.9, 280.0, образующимся в результате фрагментации родительского молекулярного иона топирамата с m/z 338.2, а его концентрацию рассчитывают по формуле С=15,06732079×AR, где С - концентрация топирамата (мкг/мл), AR - отношение площади хроматографического пика топирамата к площади пика внутреннего стандарта.

Описание

Изобретение относится к области медицины, а именно к фармакологии, и может быть использовано для количественного определения топирамата в плазме крови человека с целью проведения терапевтического лекарственного мониторинга данного препарата у пациентов в условиях стационара.

Топирамат - противоэпилептическое средство относится к классу сульфат-замещенных моносахаридов. Химическое название 2,3:4,5-Ди-O-изопропилиден-бета-D-фруктопиранозы сульфамат; брутто-формула C12H21NO8S.

В связи с появлением новых технологий в фармакокинетике, фармакогенетике и аналитической химии современная медицина выходит на качественно новый этап развития. Базисом рациональной терапии в современной медицине становится терапевтический лекарственный мониторинг - способ управления и контроля эффективности фармакотерапии в реальном времени. Как известно, главная цель рациональной терапии - максимальный лечебный эффект при минимальном побочном действии. Для достижения этой цели в клинике осуществляется разнонаправленный мониторинг больных, с целью получения исчерпывающей информации об их состоянии. Такого рода информацию можно получить различными способами, в том числе и терапевтический лекарственный мониторинг. Топирамат уменьшает частоту возникновения потенциалов действия, характерных для нейрона в состоянии стойкой деполяризации, что свидетельствует о зависимости блокирующего действия препарата на натриевые каналы от состояния нейрона. Топирамат потенцирует активность GABA в отношении некоторых подтипов GABA-рецепторов (в т.ч. GABAA-рецепторов), а также модулирует активность самих GABAA-рецепторов, препятствует активации каинатом чувствительности каинат/АМПК-рецепторов к глутамату, не влияет на активность N-метил-D-аспартата в отношении NMDA-рецепторов. Эти эффекты топирамата являются дозозависимыми при концентрации топирамата в плазме от 1 мкМ до 200 мкМ, с минимальной активностью в пределах от 1 мкМ до 10 мкМ. Кроме того, топирамат угнетает активность некоторых изоферментов карбоангидразы, однако этот эффект у топирамата более слабый, чем у ацетазоламида и, по-видимому, не является главным в противоэпилептической активности топирамата.

На сегодняшний день известен способ оптимизации режима дозирования противоэпилептических препаратов, в том числе и топирамата, путем забора биологического материала и проведения полимеразной цепной реакции по генам-кандидатам с последующим анализом их аллельных вариантов. Далее, путем сопоставления выявленного аллельного полиморфизма с данными о его влиянии на эффективную терапевтическую дозу и возникновении побочных эффектов, производится расчет эффективной терапевтической дозы противоэпилептического препарата и определение риска развития побочных эффектов. Предложенное изобретение позволяет с высокой точностью определять эффективную терапевтическую дозу и наличие риска развития побочных эффектов (RU 2574204, 10.02.2016). Это эффективный метод молекулярной биологии, но в то же время он довольно трудоемок и требует наличия опытных специалистов по проведению данной реакции. Необходимо отметить, что наличие фармакогенетической информации о пациенте действительно обладает определенной прогностической ценностью, однако фармакогенетический скриннинг сам по себе не отменяет необходимости измерения реальной концентрации антиконвульсантов в крови конкретного пациента в процессе индивидуализации лекарственной терапии.

Известен также способ определения топирамата в плазме крови путем жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии, в котором в качестве внутреннего стандарта для определения топирамата используется дейтерированный топирамат (топирамат-d12), при этом детектирование проводится с использованием интерфейса мультимодального - электрораспыления по молекулярному иону топирамата с m/z 338.1. В качестве аналитического оборудования использовалось устройство LC (модель 1200, компания Agilent Technologies, Inc.) с бинарным насосом и автосемплером в сочетании с масс-селективным детектором (LOMSD SL, Agilent Technologies, Inc.). Точность варьировала в диапазоне от 0,075 до 7,5 мкг/мл. Определение известного значения в соответствии с предписанной концентрацией составляла от 96.93% и 97,68%.

Наиболее близким техническим решением является способ определения топирама в плазме крови с помощью хроматомасс-спектрометрии причем в качестве внутреннего стандарта для определения топирамата используется дейтерированный топирамат (топирамат-d12) (Kamal М. Matar Therapeutic drug monitoring of topiramate by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Clinica Chimica Acta, 2010, pp. 1-6, в статье Matar K., 2010). Применение в обоих этих способах в качестве внутреннего стандарта молекулы топирамата, в котором атомы водорода замещены дейтерием в целом оправдано и имеет ряд серьезных преимуществ: одинаковый с аналитом коэффициент экстракции, схожее хроматографическое поведение, одинаковый характер масс-фрагментации с анализируемым соединением. Однако дейтерированные аналоги имеют ряд серьезных недостатков, лимитирующих их широкое применение. Прежде всего это высокая цена и труднодоступность в сравнении с недейтерированными веществами. Вторая особенность связана с содержанием незамещенных дейтерием атомов водорода в молекуле. При их наличии приходится лимитировать верхнюю концентрацию внутреннего стандарта, дабы он не давал вклада в сигнал измеряемого вещества. Кроме того, при длительном нахождении в водных растворах в молекулах дейтерированных соединений может происходить самопроизвольный процесс замены дейтерия на наиболее распространенный изотоп водорода (протий), что может влиять на параметры количественного анализа, внося дополнительную погрешность в измерения. Это обуславливает их ограниченный срок годности в сравнении с недейтерированными соединениями. Также с этим связана необходимость создания особых условий хранения для этих соединений (-20°С).

Технический результат заявленного изобретения заключается в создании способа определения топирамата в плазме крови с высокой воспроизводимостью и точностью, наиболее адаптированного для решения задач экспериментальной и клинической фармакокинетики.

Технический результат достигается тем, что проводят количественное определение топирамата в плазме крови путем ее анализа на наличие топирамата высокоселективным методом хроматомасс-спектрометрии, при этом хроматомасс-спектрометрию осуществляют с использованием матрицы в виде плазмы крови с топираматом и внутреннего стандарта, вещества, близкого по строению молекулы к анализируемому веществу - 2,3-4,5-бис-О-изопропилиден-бета-D-фруктопиранозы-N-(4-хлорбензоил)сульфамата, разделение продуктов экстракции проводят на обращенно-фазной хроматографической колонке 4,6×150 мм, при этом в качестве элюента применяют 10 мМ ацетат аммония - раствор А и смесь ацетонетрила и 10 мМ ацетата аммония в отношении 90:10 - раствор Б, взятых в процентном соотношении раствора А к раствору Б 40:60 соответственно, с температурой разделения 35°С, и скоростью подачи элюента 0,8 мл/мин, детектирование топирамата проводят по четырем дочерним ионам с m/z 95.9, 122.0, 161.9, 280.0, образующихся в результате фрагментации родительского молекулярного иона топирамата с m/z 338.2, а его концентрацию рассчитывают по формуле: С=15,06732079×AR, где С - концентрация топирамата (мкг/мл), AR - отношение площади хроматографического пика топирамата к площади пика внутреннего стандарта.

Способ осуществляется следующим образом.

Все растворители имели квалификацию «Для хроматографии», реактивы - не ниже «ч.д.а.». Для приготовления растворов стандартных образцов использовали субстанции стандартов топирамата (производства Sigma-Aldrich, США) и 2,3-4,5-бис-O-изопропилиден-бета-D-фруктопиранозы (4-хлорбензоил)сульфамата (см. фиг. 1). На фигуре 1 показан стандарт топирамата - C19H24ClNO9S Exact Mass: 477,09. В качестве биологической матрицы использовали плазму крови.

Для выделения топирамата из плазмы крови и очистки экстракта используют метод жидкостной экстракции. К образцу плазмы крови объемом 500 мкл добавляют 50 мкл внутреннего стандарта (2,3-4,5-бис-О-изопропилиден-бета-D-фруктопиранозы-N-(4-хлорбензоил)сульфамата, 100 мкг/мл) и 500 мкл пересыщенного раствора бикарбоната натрия (NaHCO3, 1,14 моль/л) с целью повышения коэффициента извлечения топирамата. Затем приливают 5 мл органического экстрагента - этилацетата. Образовавшуюся смесь встряхивают в течение 5 минут на вортекс-миксере Heidolph Ultra, а затем центрифугируют на скорости 3500 об/мин для разделения органического и гидрофильного слоя. Надосадочную жидкость осторожно декантируют и упаривают в центрифужном вакуумном концентраторе Eppendorf Concentrator 5301 при температуре 60°С. Полученный сухой остаток перерастворяют в 500 мкл метанола. Образец переносят в хроматографическую виалу, которую помещают в автосамплер хроматографа для дальнейшего хромато-масс-спектрометрического анализа. Раствор инжектируют в петлю хроматографа в объеме 10 мкл.

В данных условиях коэффициент экстракции для топирамата составляет 88,97±1,25%, для внутреннего стандарта - 90,96±0,93%.

Для высокоэффективной жидкостной хромато-масс-спектрометрии используют хроматограф - «Finnigan Surveyor LC Pump Plus», детектор - масс-спектрометрический детектор «LCQ Fleet MS» (квадрупольная ионная ловушка) и аналитическую колонку - обращенно-фазную колонку XTerra MS С18 фирмы Waters, США (4,6×150 мм; 5 мкм).

Масс-спектрометрическое детектирование топирамата проводят, по четырем дочерним ионам с m/z 95.9, 122.0, 161.9, 280.0, образующимся в результате фрагментации родительского молекулярного иона топирамата с m/z 338.2 при нормализованной энергии соударений 23 eV. Масс-спектр второго порядка для топирамата представлен на фиг. 2А и для 2,3-4,5-бис-О-изопропилиден-бета-D-фруктопиранозы-N-(4-хлорбензоил)сульфамата на фиг. 2Б1 (по вертикали интенсивность (Intensity) по горизонтали масса заряда (m/z).

Внутренний стандарт детектируют по дочерним ионам с m/z 154.90, 234.00, 250.00, 262.00, 418.20, образующимся в результате распада молекулярного иона внутреннего стандарта с m/z 476.4. Масс-спектрометр работал в режиме регистрации ионов, отрицательно заряженных электроспреем (ESI), создаваемым напряжением в 5 кВ. Скорость потока газа-небулайзера (азота): 5 л/мин, давление на распылителе - 100 psi. Температура интерфейса капилляра составляла 350°С, температура нагревателя - 300°С. Амплитуда возбуждения на концевых электродах ловушки 0,1 В. В качестве демпфирующего газа в ионной ловушке использовался гелий. Данные обрабатывались с помощью Xcalibur 2.1 w/Foundation 1.0.1.

Разделение осуществляют на обращенно-фазной хроматографической колонке XTerra MS С18 фирмы Waters, США, 5 мкм, 4,6×150 мм. Подвижная фаза состоит из двух растворов: 10 мМ ацетата аммония, (раствор А) и смеси ацетонитрила и 10 мМ ацетата аммония в соотношении 90:10 соответственно (раствор Б). Растворы А и Б взяты в процентном соотношении 40А:60Б. Работа проводилась в изократическом режиме элюирования. Скорость потока подвижной фазы составляла 0,8 мл/мин. Объем пробы - 10 мкл. Температура разделения 35°С. Продолжительность хроматографирования - 10 минут. Время удерживания аналита - 3,22±0,05 минут. Время удерживания внутреннего стандарта (2,3-4,5-бис-O-изопропилиден-бета-D-фруктопиранозы-N-(4-хлорбензоил)сульфамата) - 2,75±0,05 минут.

Демонстрационная хроматограмма образца плазмы крови с концентрацией топирамата 10 мкг/мл представлена на фигуре 3, на которой видна хроматограмма экстрагированного образца плазмы крови с концентрацией топирамата 10 мкг/мл, верхний пик - пик аналита, нижний пик - пик внутреннего стандарта (по вертикали относительное содержание (Relative abundance), по горизонтали время (Time) в минутах).

Для приготовления калибровки готовили маточные растворы стандартов топирамата и внутреннего стандарта в метаноле с концентрациями 1 мг/мл. Раствор топирамата применяли для приготовления растворов рабочих стандартных образцов на плазме крови с концентрациями 0,156 мкг/мл; 0,313 мкг/мл; 0,625 мкг/мл; 1,25 мкг/мл; 2,5 мкг/мл; 5 мкг/мл; 10 мкг/мл; 20 мкг/мл. Раствор внутреннего стандарта с концентрацией 1 мг/мл разбавляли в 10 раз для получения рабочего раствора внутреннего стандарта с концентрацией 100 мкг/мл. Калибровочная кривая топирамата в плазме крови показана на фиг. 4.

Количественное определение осуществляли по градуировочной зависимости для топирамата в плазме крови и рассчитывали по формуле С=15,06732079×AR, где С - концентрация топирамата (мкг/мл), AR (Area Ratio) - отношение площадей пиков аналита и внутреннего стандарта. Коэффициент корреляции составил R2=0.9973, что соответствует надлежащей аналитической аппроксимации. Предел количественного определения - 0,625 мкг/мл.

Точность и воспроизводимость

Точность выражалась в виде коэффициента вариации (% C.V.) для каждой серии образцов согласно уравнению:

, где

SD - стандартное отклонение серии определений;

- среднее арифметическое значение полученных концентраций.

Воспроизводимость измерялась, как процент отклонения (% dev.) от теоретического значения по формуле , где

- среднее арифметическое значение полученных концентраций;

Для метрологической валидации полученной методики определяли точность в течение рабочего дня. Каждый из образцов, предназначенных для контроля качества, анализировали в течение 1 рабочего дня (6 определений). Результаты представлены в таблице 1.

Относительная ошибка определения топирамата не превышала 10%.

Таким образом, заявленный способ обладает высокой эффективностью в проведении анализа, не требует использования большого количества химических реактивов. Высокая точность и чувствительность данного метода количественного определения топирамата в плазме крови обеспечивает идентификацию вещества с установленными характеристиками погрешности, что позволяет ее использовать как в экспериментальной, так и клинической фармакокинетики препарата.

Как компенсировать расходы
на инновационную разработку
Похожие патенты