[1]Изобретение относится к биотехнологии и касается способа производства препарата «Мобилан (M-VM3)». Изобретение оптимизирует стадии производства, повышая его рентабельность, делая оптимальным соотношение время производства/количество полученного препарата/количество средств, затраченных на производство. В частности, в ходе модернизации были разработаны следующие устойчивые параметры производственного процесса: объем партии - 1500 флаконов, время на производство - 18-22 суток, общий расход питательной среды - 44 л, объем вируссодержащей суспензии M-VM3 - 25 л, плотность клеток во время заражения - в диапазоне от 0,8×106 до 1×106 кл/мл; время сбора клеток - на третий день (приблизительно 72 ч); температура при заражении - 36°С, множественность заражения - 5-10 БОЕ/кл, итоговая концентрация вирусного конструкта при сборе - 8×108 БОЕ/мл.
[2]Инновационный препарат Мобилан (M-VM3), концентрат для приготовления раствора для внутриопухолевого введения, содержащий неспособный к репликации бицистронный человеческий аденовирусный вектор, экспрессирующий ген человеческого Толл-подобного рецептора 5 типа и ген фармакологически оптимизированного секретируемого фрагмента белка флагеллина бактерий рода Salmonella, в концентрации 1012 частиц неспособного к репликации бицистронного человеческого аденовирусного вектора в 1 мл буферного раствора.
[3]Из уровня техники известно получение концентратов вирусов в промышленных масштабах, в частности, из RU 2029561 от 27.02.1995. Наиболее близким решением, обнаруженным в уровне техники, является RU 2465327 от 27.10.12, которое описывает очистку рекомбинантных аденовирусов человека. Способ включает подготовку вируссодержащего материала в культуре клеток HEK293, в том числе: сбор этих клеток, подготовительный лизис клеток и освобождение аденовируса от клеточного дебриса, а также непосредственно очистка аденовируса на носителе с мономерным авидином, включающая предварительную подготовку носителя и посадку на него аденовируса, осаждение и промывка носителя с аденовирусом, элюирование аденовируса с носителя и итоговый отбор вируса после центрифугирования.
[5]Вирусный конструкт M-VM3 (Мобилан) был произведен в полупромышленном масштабе при использовании оптимизированного процесса получения клеточной культуры для данного определенного конструкта и условий лизиса и очистки человеческого аденовируса 5 серотипа, т.е. очистки методом анионообменной хроматографии. Производство осуществлялось согласно правилам GLP, все анализы были проведены с использованием надлежащей документационной практики.
[6]Отличительной особенностью конструкта M-VM3 от других рекомбинантных аденовирусных векторов является наличие в составе генома как гена человеческого Толл-подобного рецептора 5 типа, который экспрессируется на мембране инфицированных клеток, так и гена фармакологически оптимизированного секретируемого фрагмента белка флагеллина бактерий рода Salmonella. При выращивании частиц препарата M-VM3 (Мобилан) в клетках HEK293 происходит активация Толл-подобного рецептора 5 типа, что ведет к экспрессии в клетках гена транскрипционного фактора NF-κΒ. Транскрипционный фактор NF-κB - универсальный фактор транскрипции, контролирующий экспрессию генов иммунного ответа, так же он способен защищать клетку от апоптоза и влиять на клеточный цикл. Из предыдущего уровня техники не было известно, как скажется активация фактора NF-κΒ в клетках, в которых происходит размножение конструкта M-VM3, на эффективность наработки препарата и последующие стадии очистки. В результате проведения наработки нескольких серий препарата M-VM3 (Мобилан) нами был разработан следующий способ промышленного производства препарата, который условно делится на две стадии: наращивание вирусного конструкта M-VM3 в культуре клеток HEK293 и его многостадийная очистка.
[7]Для получения 25 л вируссодержащей клеточной суспензии было затрачено 44 л питательной среды. При этом культивирование проводится в инокуляторе с магнитной мешалкой Cell spin, а при масштабировании - в волновом биореакторе Biostat CultiBag, с использованием двух одноразовых стерильных пластиковых емкостей рабочим объемом 10 л и одной рабочим объемом 25 л. В процессе выращивания количество клеточной суспензии масштабируется от образца клеточного банка количеством 1 пробирка (1,5 мл) до 24.4 л. При этом в процессе масштабирования клеточная суспензия выращивается с частичной заменой отработанной питательной среды на свежую в соотношении 2/3 свежей к 1/3 старой. Процесс наращивания необходимого объема клеточной культуры в объеме 23,8 л ведется параллельно выращиванию вирусного стока объемом 1,2 л, для последующего заражения данной культуры. Концентрация клеток при заражении 1,0·106 кл/мл. Наращивание клеток проводится до финальной концентрации вируса 8×108 БОЕ/мл.
[8]Далее полученная суспензия передается на очистку. Изначально суспензия центрифугируется с отводом отработанной питательной среды. Далее обрабатывается лизирующим буфером, замораживается и обрабатывается нуклеазой для эффективного клеточного лизиса с дальнейшим успешным высвобождением вирусного конструкта M-VM3, с учетом ядерной локализации последнего. Были подобраны температурные и временные условия мягкого перемешивания для эффективной обработки нуклеазой. После лизиса проводится повторное центрифугирование с целью освобождения вирусного стока от клеточного дебриса. Далее вируссодержащий раствор передается на ультрафильтрацию и хроматографическую очистку в соответствии с разработанными параметрами для аденовируса. Выполняются множественные процедуры хроматографической очистки с объемом наполненной колонки ~ 174 мл, используя хроматографическую систему ÄKTA Avant. Далее препарат передается на стерилизующую фильтрацию и розлив во флаконы. После обжатия флаконов алюминиевыми колпачками, проверки на герметичность и маркировки препарат M-VM3 (Мобилан) замораживается и хранится при -70°С. Производственный выход - 1500 флаконов препарата с концентрацией 1012 частиц неспособного к репликации бицистронного человеческого аденовирусного вектора в 1 мл буферного раствора. Тестирование конечного продукта по показателям: описание, pH, микробиологическая чистота, содержание бактериальных эндотоксинов (ЛАЛ-тест), инфекционный титр, концентрация вирусных частиц и RCA (способный к репликации аденовирус), показало, что продукт обладает ожидаемыми характеристиками качества.
[10]Пример 1. Культивирование клеточной суспензии
[11]Приготовление и хранение питательной среды
[12]Подготовили навеску сухой питательной среды CD293AGT и растворили ее в части очищенной воды с перемешиванием на магнитной мешалке. После растворения добавили вторую часть очищенной воды из соотношения состава. Далее провели стерилизацию жидких питательных сред на системе фильтрации с вакуум-фильтрами Corning, диаметр пор 0,22 мкм. Добавили глутамин в стерильную среду. Приготовление питательных сред производили в помещении, отдельном от боксов, предназначенных для работы с культурой клеток и культурой M-VM3. Путем оптимизации процесса (за счет частичной замены питательной среды при пересеве) сокращается необходимый объем питательной среды. Общий объем 44 л (44000 мл).
[13]Транспортировали готовую среду в:
[14]а) культуральный бокс
[17]
[18]
[19]
[20]
[21]Таким образом, для получения 600 мл клеточной суспензии в качестве субстрата вирусной «затравки» M-VM3 и 23800 мл клеточной суспензии для получение вирусного конструкта M-VM3 в процессе оптимизированного масштабирования было затрачено 43 литра питательной среды. При стандартном способе культивирования эукариотической культуры клеток HEK293, включающем центрифугирование клеточной суспензии на каждой стадии и полную замену питательной среды, расход питательной среды - не менее 52,1 литра (табл. 1).
[22]
[23]Пример 2. Получение вирусного конструкта M-VM3 в суспензии клеток
[24]Для получения вирусного конструкта необходимо параллельно с наращиванием клеточной суспензии получить вирусную «затравку» с использованием клеточной суспензии, описанной в Примере 1. Для этого стерильно отобрали 600 мл клеточной суспензии из ферментера и перелили ее в Cellspin объемом 1000 мл, отстояли и слили надосадочную жидкость. Довели оставшийся объем до 1200 мл, таким образом, концентрация клеток составила 0,8-1,0×106 кл/мл. В вирусном ламинар-боксе с ламинарным потоком класса В внесли 70 мл вирусного материала M-VM3 из рабочего банка (с титром не менее 108 БОЕ/мл) в полученную клеточную суспензию. Таким образом, соотношение культуры из рабочего банка (исходной) и полученной клеточной суспензии составляет 1/17, и культивировали в нем 48-72 часа. Инкубировали в CO2-инкубаторе. Контролер ОКК провел анализ «затравки» титрованием. Титр должен быть не менее 2×108 БОЕ/мл.
[25]На данной стадии израсходовано: клеточной суспензии HEK293 0,6 л; питательной среды 1,0 л; вирусного материала M-VM3 0,07 л. Итого: 1,67 л.
[26]Получено на стадии: вирусная «затравка» M-VM3 1,27 л; отработанная питательная среда 0,4 л. «Затравка» объемом 20 мл отбирается на контроль качества.
[27]Получение вирусного конструкта M-VM3 объемом 25 л
[28]В вирусном ламинар-боксе с ламинарным потоком класса В произвели настройку режима культивирования: температура, угол наклона платформы, расход воздуха, концентрация CO2, pH, pO2. Засеяли «затравкой» M-VM3 (титр не менее 2×108 БОЕ/мл), объемом 1250 мл мешок CultiBag RM 50 с клеточной суспензией объемом 23750 мл. Культивирование продолжали до достижения концентрации M-VM3 не менее 8×108 БОЕ/мл 48-72 часов.
[29]Израсходовано на стадии: клеточной суспензии HEK293 23,75 л; M-VM3 вирусная «затравка» 1,25 л. Итого: 25 л.
[30]Получено на стадии 25 л M-VM3 вирусного конструкта.
[31]
[32]
[33]Пример 3. Очистка вирусного конструкта M-VM3
[35]Полученный и охарактеризованный вирусный конструкт M-VM3 из биореактора стерильно разлили в центрифужные пробирки, уравновесили их и центрифугировали при 6000g в течение 15 мин. Осуществили отвод супернатанта отработанной питательной среды, продуктов метаболизма и др. физических частиц, перенесли их на инактивацию автоклавированием.
[36]Осадок из 25 л вирусной суспензии ресуспендировали в буфере (коэффициент концентрации х67), таким образом, соотношение объема осадка к объему буфера составляет 1-16,6, и перемешали на магнитной мешалке. Объем суспензии составил 380±5 мл.
[38]М-VM3-содержащая суспензия была разлита в необходимое количество флаконов объемом 50 мл (по 20 мл суспензии в каждом). Далее хранилась в течение 2 часов в холодильнике.
[39]- Разрушение клеток и обработка нуклеазой
[40]Разморозили суспензию на водяной бане (23-25°С), не давая согреться. Содержимое всех пробирок объединили в один стеклянный флакон. Визуально провели контроль цветности и мутности суспензии. Обработали бензоназой до финальной концентрации 150 Ед/мл (≈240 мкл). Проводили мягкое перемешивание на магнитной мешалке, 3 часа при комнатной температуре (21-23°С).
[41]Израсходовано на стадии: 0,38 л M-VM3 содержащей суспензии; бензонала 2,4×10-4. Получено на стадии: M-VM3 содержащей суспензии (лизат) 0,377 л.
[43]Растворенную M-VM3-содержащую суспензию разлили в 5 центрифужных пробирок по ≈25 мл в каждую. Центрифугировали при 9000g в течение 10 мин. Операцию повторили дважды, используя оставшийся объем лизата. Супернатант перенесли в чистую емкость, закрыли многопортовой крышкой и поставили на магнитную мешалку для ультрафильтрации. Отвели осадок в виде клеточного дебриса на инактивацию для последующей утилизации.
[44]Израсходовано на стадии: M-VM3 содержащей суспензии (лизат) 0,377 л.
[45]Получено на стадии: M-VM3 содержащей суспензии (осветленный лизат) 0,370 л;
[46]клеточный дебрис 0,007 л.
[48]Промыли систему водой очищенной объемом 7л до полного вымывания консервирующего раствора 0.1 M NaOH (контроль pH - 6,0-7,0). Прокачали систему воздухом, уравновесили 0,5 л буфера для ультрафильтрации.
[49]Суспензию объемом ≈400 мл довели буфером для ультрафильтрации до объема 1600 мл, подвергли ультрафильтрации на установке для ультрафильтрации. Путь ретентата промыли «пустым» буфером в объеме 200 мл, объединили данный смыв с отфильтрованным ретентатом и добавили 800 мл «пустого» буфера. Измерили объем ретентата. По окончании измерили объем буфера (пермеата), прокаченного через мембрану. Производили замер давления по манометру каждые 5 минут (не должно превышать 1,2 атм).
[50]Израсходовано на стадии: M-VM3 содержащей суспензии (осветленный лизат) 0,370 л; буфер для ультрафильтрации 1,7 л, «пустой» буфер 1,0 л, вода очищенная 7 л.
[51]Получено на стадии: M-VM3 - ретентат 1,2 л.
[52]- Анионообменная хроматография
[53]Уравновесили анионообменную колонку буфером А и наполнили каналы: до установления неизменяемой проводимости ~40-50 mS/cm (1.4CV=500 мл). Приготовили буфер Б и уравновесили им колонку до проводимости ~28-30 mS/cm (1.4CV=500 мл). Контролировали давление в процессе хроматографирования (не должно превышать 2 бар).
[54]Раствор, содержащий M-VM3, нанесли на колонку, поток 193 мл/мин (300 см/ч). Объем колонки 400 мл.
[55]Промыли содержимое колонки буфером А в объеме 7CV (2800 мл) при скорости потока 100 мл/мин. Элюция примесей - 1.5 CV (600 мл) буфера Б при скорости потока 100 мл/мин; во время элюции сходит пик (фракция), содержащий M-VM3. Колонку кондиционировали буфером А - 1.5 CV (600 мл). Собрали фракции нужного пика.
[56]Израсходовано на стадии: M-VM3-содержащая суспензия (ретентат + смыв) 1,2 л; буфер «А» 3,9 л (NaCl 0.5М), буфер «Б» 1,1 л (NaCl 0.27М); сорбент Sepharose 4 Fast Flow 0,4 л.
[58]M-VM3-содержащий раствор (пик M-VM3) 0,4 л.
[59]- Эксклюзионная хроматография
[60]Колонку уравновесили буфером для эксклюзионной хроматографии в объеме 1.5CV (1.2 л). На колонку нанесли элюированный с анионообменной колонки препарат в объеме 130-140 мл, поток 100 мл/мин (77 см/ч). Собрали проскок. Элюция 1.5CV (1.2 л) буфера для эксклюзионной хроматографии, поток 100 мл/мин (~12 мин). Собрали пик и следующий элюат. Повторили операцию дважды с оставшимся объемом элюата.
[61]Израсходовано на стадии: M-VM3-содержащий раствор (пик M-VM3) 0,4 л; буфер для эксклюзионной хроматографии 4,8 л, сорбент Q SepharoseXL Virus Licensed 0,8 л.
[62]Получено на стадии: раствор (M-VM3) 1,65 л, в т.ч. M-VM3 1,1×1012 частиц/мл.
[63]- Стерилизующая фильтрация (M-VM3)
[64]Провели стерилизующую фильтрацию через систему, используя фильтр-патрон с размером пор 0,45 мкм и фильтр-патрон с размером пор 0,22 мкм под давлением (1,5-2,0) атм.
[65]Израсходовано на стадии: полупродукт-раствор (M-VM3) 1,65 л, в т.ч. M-VM3 1,1×1012 частиц/мл.
[66]Получено на стадии: Раствор (M-VM3) 1,65 л, в т.ч. M-VM3 1,0×1012 частиц/мл.
[67]Пример 4. Розлив и упаковка препарата Мобилан
[68]- Розлив раствора Мобилан (M-VM3) во флаконы
[69]На дозаторе установить объем дозируемого раствора - 1,0 мл с помощью подвижного зажима эксцентрика, фиксируя его прижимным винтом. Включить машину и проверить точность установленной дозы. Заполнить вибробункер стерильными пробками нужного размера. Заполнить подающий стол аппарата стерильными флаконами нужной емкости. Провести розлив. Периодически в процессе работы через каждые (50-100) флаконов (в зависимости от объема серии) технолог и контролер ОКК проводят контроль дозы раствора во флаконе.
[70]Израсходовано на стадии: раствор (M-VM3) 1,65 л, в т.ч. M-VM3 1,0×1012 частиц/мл, 1650 стерильных флаконов и резиновых пробок.
[71]Получено на стадии: Мобилан (M-VM3) во флаконах 1610 шт., в т.ч. M-VM3 1,0×1012 частиц/мл.
[73]Флаконы, укупоренные резиновыми пробками, завальцевали алюминиевыми колпачками на машине для вальцовки флаконов GM 200 фирмы Cozzoli. Далее осуществляли проверку на герметичность. Затем маркировку и упаковку флаконов.
[74]Израсходовано на стадии: Мобилан (M-VM3) во флаконах 1610 шт., в т.ч. M-VM3 1,0×1012 частиц/мл., 1650 стерильных алюминиевых колпачков.
[75]Получено на стадии: Мобилан (M-VM3) во флаконах 1520 шт., в т.ч. M-VM3 1,0×1012 частиц/мл.
[76]- Замораживание готовой продукции
[77]Готовую продукцию сложили в контейнеры, на которые повесили желтую этикетку «В карантине» с указанием наименования препарата, номера серии, даты выработки продукта, даты сдачи на анализ в ОКК и количества пачек в контейнере. Контейнеры закрыли крышкой, опечатывают. Далее контейнеры помещают в фармацевтический холодильник на температуру -70°С на 24 часа. Далее контролер ОКК отбирал необходимое количество упаковок и передал при -70°С для проведения анализа на соответствие ФСП и арбитражного хранения. После получения положительного заключения ОКК контейнеры маркировали зеленой этикеткой, на которой указали номер серии, количество пачек в серии, количество пачек в каждом контейнере и дату сдачи на склад готовой продукции. Упакованный препарат передали на склад готовой продукции в условиях транспортировки -70°С.
[78]Пример 5. Контроль качества препарата Мобилан
[79]Инновационный препарат Мобилан (M-VM3) передается на контроль качества и должен соответствовать нормам, описанным в фармакопейной статье предприятия:
[80]1) Описание. Препарат должен быть бесцветным или с голубоватым оттенком опалесцирующим раствором.
[81]2) Подлинность. Должен присутствовать геном неспособного к репликации бицистронного человеческого аденовирусного вектора и гены человеческого Толл-подобного рецептора 5 типа и фармакологически оптимизированного секретируемого фрагмента белка флагеллина бактерий рода Salmonella. Должны отсутствовать неспецифические фрагменты.
[82]3) Прозрачность. 10% раствор препарата в 5% водном растворе глюкозы должен выдерживать сравнение с эталоном № IV (по ГФ XII).
[83]4) Цветность. Препарат должен быть бесцветным или интенсивность окраски раствора должна быть не более окраски эталона Y6.
[84]5) Механические включения. Видимые и довидимые частицы. Препарат должен выдерживать требования согласно РД 42-501-98.
[85]6) pH. От 7,0 до 9,0.
[86]7) Извлекаемый объем. Не менее номинального (по ГФ XII).
[87]8) Стерильность. Должен быть стерильным (по ГФ XII, метод мембранной фильтрации или прямого посева).
[88]9) Вирусная безопасность. Препарат должен содержать менее 7×103 репликативно-компетентных аденовирусов на мл. Анализ цитопатического эффекта на культуре клеток (А549).
[89]10) Аномальная токсичность. Препарат должен быть нетоксичным (по ГФ XII).
[90]11) Пирогенность. Препарат должен быть апирогенным (по ГФ XII).
[91]12) Посторонние примеси. Не идентифицированные примеси не более 5%.
[92]13) Количественное определение. Препарат должен содержать (1,0±0,2)×1012 частиц/мл.
[93]14) Биологическая активность. Не менее 1×1010 бляшкообразующих единиц/мл.
[94]Препарат, произведенный в количестве 1500 флаконов по оптимизированной технологии (Табл. 2), соответствует нормам ФСП на «Мобилан (M-VM3), концентрат для приготовления раствора для внутриопухолевого введения, 1012 частиц/мл».
[95]
[96]
