СПОСОБ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНОВ

Изобретение относится к биотехнологии и аналитической химии и представляет собой способ иммуноферментного определения антигенов. При проведении анализа на поверхности носителя формируются комплексы между молекулами антигена и специфическими антителами, которые выявляются посредством присоединения к комплексам ферментной метки и ее детекции по образованию продукта ферментативной реакции. Присоединение ферментной метки осуществляется посредством взаимодействия двух белков - бактериальной рибонуклеазы барназы и ее ингибитора барстара. При этом один из них присоединен к иммунореагенту, а другой - к ферментной метке. Изобретение позволяет определять антигены посредством непрямого введения ферментной метки в детектируемые иммунные комплексы с высокой аффинностью и специфичностью, с константой связывания комплекса - 10¹⁴ М^-1. 5 ил.

Способ иммуноферментного определения антигенов, включающий формирование на поверхности носителя комплексов между молекулами антигена и специфическими антителами, присоединение к комплексам ферментной метки и ее детекцию по образованию продукта ферментативной реакции, отличающийся тем, что присоединение ферментной метки осуществляется посредством взаимодействия двух белков - бактериальной рибонуклеазы барназы и ее ингибитора барстара, при этом один из взаимодействующих белков ковалентно или генно-инженерно присоединен к иммунореагенту, а другой - к ферментной метке.

Изобретение относится к биотехнологии и аналитической химии и может использоваться при определении биологически активных веществ в медицинской диагностике, для характеристики качества сельскохозяйственной и пищевой продукции, экологического мониторинга, контроля технологических процессов.

В современной практике широко применяются иммуноферментные методы анализа различных веществ (Gabaldon J.A., Maquieira A., Puchades R. Current trends in immunoassay-based kits for pesticide analysis. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 1999; 39 (6): 519-538; Stefan R.L, van Staden J.F., Aboul-Enein H.Y. Immunosensors in clinical analysis. Fresenius J. Anal. Chem. 2000; 366 (6-7): 659-668; Lee N.A., Kennedy I.R. Environmental monitoring of pesticides by immunoanalytical techniques: validation, current status, and future perspectives. J. AOAC Int. 2001; 84 (5): 1393-1406; Luppa P.B., Sokoll L.J., Chan D.W. Immunosensors - principles and applications to clinical chemistry. Clin. Chim. Acta. 2001; 314 (1-2): 1-26), поскольку сочетание антител и ферментов для формирования детектируемых межмолекулярных комплексов приводит одновременно к специфичности анализа, обеспечиваемой высокоселективными антителами, и его чувствительности, обеспечиваемой высокоактивными ферментными метками. Методы иммуноферментного анализа (ИФА) подразделяются на прямые, в которых метка непосредственно присоединена к иммунореагенту (стандартному препарату антигена или специфическому антителу), и непрямые, в которых введение метки в иммунный комплекс является дополнительной стадией анализа (Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. // М.: Высш. шк. 1991). Несмотря на большую продолжительность непрямого иммуноанализа, в значительной части случаев его применение предпочтительно. Непрямое мечение предотвращает контакт фермента с компонентами анализируемой пробы, которые потенциально могут вызвать его инактивацию. Кроме того, в непрямом иммуноанализе ферментсодержащий конъюгат является универсальным реагентом, пригодным для определения самых разных антигенов. Непрямое мечение исключает необходимость для каждой новой задачи синтезировать специфические конъюгаты и характеризовать свойства полученных при синтезе продуктов.

При реализации непрямого ИФА в современной практике используются два основных способа введения метки:

- взаимодействие специфических антител и меченных ферментом антивидовых антител;

- модификация специфических антител биотином и их последующее выявление с помощью конъюгата авидин-фермент или стрептавидин-фермент.

Хотя первый способ позволяет работать с нативными специфическими антителами, не прибегая к какой бы то ни было их обработке, взаимодействие с антивидовыми антителами вносит в анализ существенный элемент неопределенности, поскольку в зависимости от свойств антивидовых и специфических антител эффективность взаимодействия между ними может значительно варьировать. В этом отношении реакция биотин-(стрепт)авидин, безусловно, более перспективна, поскольку она характеризуется высокой константой связывания - около 10¹⁵ М^-1 (на 6-7 порядков превосходя реакцию с антивидовыми антителами), неизменной для всех взаимодействующих молекул и не зависящей от индивидуальных свойств используемых препаратов (Hevey R.C., Malmros М.К. Methods for the detection and determination of ligands. US Patent 4228237. October 14, 1980; Wilchek М., Bayer E.A. Applications of avidin-biotin technology: literature survey. Methods Enzymol. 1990; 184: 14-45; Diamandis E.P., Christopoulos Т.К. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 1991; 37 (5): 625-636; Lindqvist Y., Schneider G. Protein-biotin interactions. Curr. Opin. Struct. Biol. 1996; 6 (6): 798-803). В настоящее время коммерчески доступны как производные биотина (активированные эфиры, позволяющие быстро и в щадящих условиях биотинилировать антитела или другие белки), так и конъюгаты стрептавидина с высокоактивными ферментными метками - пероксидазой, щелочной фосфатазой и др. (Swanson P.E., Wick M.R. Commercial avidin-biotin-peroxidase complex kits. Am. J. Clin. Pathol. 1989; 91 (4, Suppl. 1): S43-44; Selvanayagam Z.E., Gopalakrishnakone P. Tests for detection of snake venoms, toxins and venom antibodies: review on recent trends (1987-1997). Toxicon. 1999; 37 (4): 565-586; Wilbur D.S., Pathare P.M., Hamlin D.K., Stayton P.S., To R., Klumb L.A., Buhler K.R., Vessella R.L. Development of new biotin/streptavidin reagents for pretargeting. Biomol. Eng. 1999; 16 (1-4); 113-118; Sugiyama К., Hoshino N., Tatsumi H., Fukuda S. Complexes containing crosslinked avidin, analytical method with the use of crosslinked avidin and analytical reagents and kits. US Patent 6787325. September 7, 2004).

Непрямой иммуноферментный анализ с использованием системы биотин-(стрептавидин) в наиболее распространенных вариантах включает следующие этапы (Avidin-Biotin Technology. Methods in Enzymology: Volume 184. John N. Abelson, Melvin I. Simon, Meir Wilchek, Edward A. Bayer, eds. San Diego, CA, USA. Academic Press, 1990):

A) до проведения анализа осуществляется биотинилирование специфических антител с отделением продукта синтеза - конъюгата, содержащего одну молекулу антитела и неопределенное (варьирующее для разных молекул конъюгата в пределах одного синтеза) количество молекул биотина, - от непрореагировавшего активированного биотина и других низкомолекулярных компонентов реакционной среды;

Б) в результате специфических иммунохимических взаимодействий (перечень и порядок которых выбирается, исходя из особенностей антигена и антител) на поверхности планшета для ИФА формируется иммобилизованный комплекс, содержащий молекулы антигена (нативного или модифицированного), биотинилированные специфические антитела и, при необходимости, дополнительные реагенты (вторые специфические антитела и др.);

B) молекулы, не включенные в иммобилизованные комплексы, удаляются посредством промывки планшета;

Г) в лунки добавляется раствор конъюгата стрептавидин-фермент. После инкубации осуществляется отмывка планшета, которая отделяет непрореагировавшие молекулы конъюгата от связавшихся с носителем. (При необходимости ускорения анализа конъюгат стептавидин-фермент может вводиться на стадии формирования специфических комплексов.);

Д) в лунки добавляется субстрат, который трансформируется молекулами фермента в составе иммобилизованных комплексов с образованием продуктов, детектируемых фотометрическим, флюориметрическим, электрохимическим или иным способом;

Е) на основании генерируемого сигнала и калибровочной зависимости определяется содержание антигена в пробе.

Один из вариантов реализации данного подхода описан в статье Song X.H., Huhle G., Wang L.C., Harenberg J. "Quantitative Determination of PEG-Hirudin in Human Plasma Using a Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay." Thrombosis Research 2000; 99 (2): 195-202. Ниже представлено изложение предлагаемой авторами этой статьи методики проведения анализа, рассматриваемой в настоящей заявке в качестве прототипной.

Раствор антигена вносили в лунки микротитрационных планшетов для ИФА и инкубировали в течение ночи при 4°С. После блокировки незанятых участков сорбции планшеты отмывали от непрореагировавших молекул. Тестируемые образцы, потенциально содержащие определяемый антиген, или их разведения вносили в лунки одновременно со специфическими антителами против определяемого антигена и инкубировали. Используемые количества иммобилизованного антигена и разведения специфических антител оптимизировали, исходя из сравнения результатов анализа для последовательных разведений обоих реагентов (так называемое «шахматное титрование»). После инкубации лунки отмывали, вносили биотинилированные антивидовые антитела, повторно инкубировали и отмывали планшет. Далее сформировавшиеся комплексы инкубировали с раствором конъюгата стрептавидин-пероксидаза и опять отмывали планшет. Инкубировали лунки с раствором субстрата пероксидазы, останавливали реакцию его трансформации серной кислотой и регистрировали поглощение продукта с помощью фотометра для микротитрационных планшетов. Концентрациюантигенавычисляли,используястандартную калибровочную кривую, полученную для образцов с внесенными известными количествами антигена.

Отметим, что введение ферментной метки посредством взаимодействия биотин-(степт)авидин имеет существенные недостатки, не преодоленные в известных на сегодня работах.

1. При химическом конъюгировании антител с биотином образуется смесь продуктов разной стехиометрии и, соответственно, разных свойств. Соотношение продуктов зависит как от контролируемых (исходные концентрации реагентов, продолжительность взаимодействия, температурный режим, состав реакционной среды), так и от неконтролируемых факторов (наличие примесей, степень сохранения модифицированным биотином реакционной способности, конформационное состояние антител, число и степень доступности реакционно-способных групп на их поверхности).

2. При необходимости контакта конъюгата (стрепт)авидин-фермент с пробой результаты анализа искажаются в тех случаях, когда матрикс пробы содержит биотин, что свойственно, в частности, пробам мяса (Kopinski J.S., Leibholz J., Bryden W.L. Biotin studies in pigs. 4. Biotin availability in feedstuffs for pigs and chickens. Br. J. Nutr. 1989; 62 (3): 773-780). Аналогичные проблемы описаны также для анализа мочи, что, по всей видимости, связано с присутствующими в ней метаболитами биотина (Raguseo R.M. А direct streptavidin-binding assay does not accurately quantitate biotin in human urine. J. Nutrition, 2001; 131 (8): 2208-2214), а также при иммунохимической характеристике гельминтов (Romaris F., Iglesias R., Garcia L.O., Leiro J., Santamarina M.T., Paniagua E., Ubeira F.M. Free and bound biotin molecules in helminths: a source of artifacts for avidin biotin-based immunoassays. Parasitol. Res. 1996; 82 (7): 617-622). При анализе яиц имеющийся в пробе авидин (White Н.В. 3rd. Vitamin-binding proteins in the nutrition of the avian embryo. J. Exp.Zool. Suppl. 1987; 1: 53-63) блокирует биотин на поверхности модифицированных антител, препятствуя связыванию ферментной метки, даже если стадии анализа осуществляются последовательно и ферментный конъюгат не контактирует с пробой.

Возможность работы с межмолекулярными конъюгатами стандартного состава (и тем самым, унифицированных свойств) возникает при переходе от химического конъюгирования к генно-инженерному (Witkowski A., Daunert S., Kindy M.S., Bachas L.G. Enzyme-linked immunosorbent assay for an octapeptide based on a genetically engineered fusion protein. Anal. Chem. 1993; 65 (9): 1147-1151; Grigorenko V., Andreeva I., Borchers Т., Spener F., Egorov A. A genetically engineered fusion protein with horseradish peroxidase as a marker enzyme for use in competitive immunoassays. Anal. Chem. 2001; 73 (6): 1134-1139; Rau D., Kramer К., Hock В. Single-chain Fv antibody-alkaline phosphatase fusion proteins produced by one-step cloning as rapid detection tools for ELISA. J. Immunoassay Immunochem. 2002; 23 (2): 129-143). Однако для биотина из-за его небелковой природы данный подход неприменим.

Задачей изобретения является разработка способа иммуноферментного определения антигенов, в котором непрямое введение ферментной метки в детектируемые иммунные комплексы осуществляется посредством белок-белкового взаимодействия с высокой аффинностью реакции, существенно превосходящей по константе связывания иммунохимические взаимодействия, и возможностью генно-инженерного получения межмолекулярных конъюгатов стандартного состава.

Заявителями предлагается для введения ферментной метки использовать реакцию между бактериальным ферментом рибонуклеазой (барназой) и ее ингибитором барстаром. Данное взаимодействие характеризуется высокой аффинностью (константа связывания комплекса - 10¹⁴ М^-1) и специфичностью, идет в широком диапазоне параметров реакционной среды и не зависит от наличия в ней каких-либо конкурирующих или ингибирующих факторов (Hartley R.W. Barnase-barstar interaction. Methods Enzymol. 2001; 341: 599-611). И барназа, и барстар представляют собой небольшие белки (массой 12 и 10 кДа соответственно) без кофакторов, углеводов и иных структурных элементов небелковой природы, что делает методически простым их генно-инженерное конъюгирование. Концевые участки аминокислотных цепей барназы и барстара не участвуют в формировании межмолекулярного комплекса, что позволяет использовать их для конъюгирования с маркерами и иммунореагентами без потери активности (Deyev S.M., Yazynin S.A., Kuznetsov D.A., Jukovich M., Hartley R.W. Ribonuclease-charged vector for facile direct cloning with positive selection. Mol. Gen. Genet. 1998; 259 (4): 379-382). Более того, показано, что генно-инженерное присоединение барназы к антителам повышает их стабильность, а благодаря этому - и воспроизводимость результатов анализа при хранении реагентов (Martsev S.P., Tsybovsky Y.I., Stremovskiy O.A., Odintsov S.G., Balandin Т.О., Arosio P., Kravchuk Z.I., Deyev S.M. Fusion of the antiferritin antibody VL domain to barnase results in enhanced solubility and altered pH stability. Protein Eng. Des. Sel. 2004; 17 (1): 85-93). Константа связывания 10¹⁴ M^-1 обеспечивает количественное формирование комплексов и отсутствие их сколько-либо существенной диссоциации за время анализа. Преимуществом системы является также возможность получения конъюгатов стандартной стехиометрии и при химическом синтезе, поскольку молекула барназы не содержит цистеиновых групп, а введенный путем сайт-специфического мутагенеза в концевой участок молекулы цистеин позволяет синтезировать конъюгаты состава 1:1.

Таким образом, отличие предлагаемого подхода от прототипного состоит в том, что присоединение ферментной метки к детектируемому иммунному комплексу осуществляют не посредством взаимодействия биотин-(стрепт)авидин, а посредством взаимодействия барназа-барстар, что позволяет получать межмолекулярные конъюгаты для анализа генно-инженерными методами и унифицировать состав конъюгатов, тем самым обеспечивая высокую воспроизводимость результатов анализа.

Возможность реализации и эффективность предлагаемого подхода подтверждают представленные ниже примеры иммуноферментного анализа с использованием системы барназа-барстар, вводимой в состав детектируемых иммунных комплексов посредством химического (Пример 1) или генно-инженерного (Пример 2) конъюгирования.

Пример 1. Иммуноферментный анализ гербицида атразина.

Схема проведения анализа представлена на фиг.1. 100 мкл раствора конъюгата атразина с бычьим сывороточным альбумином (0,5 мкг/мл, в ФБ - 50 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,4, с 0,1 М NaCl) добавляли в лунки полистиролового микропланшета для ИФА и инкубировали в течение ночи при 4°С. После этого лунки четырехкратно отмывали ФБТ - ФБ с 0,05% детергента Тритон Х-100. 50 мкл атразинсодержащих проб и 50 мкл химического конъюгата барназы с моноклональным антителом 1Е4/А12 против атразина (0,2 мкг/мл, в ФБТ) добавляли в лунки одновременно и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Затем планшет повторно четырехкратно отмывали, добавляли в каждую лунку 100 мкл химического конъюгата барстар-пероксидаза (1 мкг/мл, в ФБТ) и инкубировали 1 час при 37°С. После этого планшет трехкратно отмывали ФБТ и один раз дистиллированной водой. Чтобы зарегистрировать каталитическую активность связавшейся с поверхностью планшета ферментной метки, в лунки добавляли на 100 мкл 100 мМ Na-цитратного буфера, рН 6,0, содержащего 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (0,1 мг/мл) и пероксид водорода (3,3 мМ). После 15-минутной инкубации при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением 100 мкл 0,1 М серной кислоты. Оптическую плотность образовавшихся окрашенных продуктов регистрировали при 450 нм. Полученная калибровочная кривая конкурентной иммунодетекции представлена на фиг.2.

Пример 2. Иммуноферментный анализ белкового онкомаркера p185^HER2.

Схема проведения анализа представлена на фиг.3. 100 мкл раствора р185^HER2 (0,1 мкг/мл, в ФБ) добавляли в лунки микропланшета, инкубировали 2 часа при 37°С и четырехкратно отмывали ФБТ. 50 мкл проб, содержащих р185^HER2, и 50 мкл рекомбинатного конъюгата барназы или барстара с мини-антителом 4D5 против р185^HER2 (в обоих случаях - в концентрации 8 нг/мл, в ФБТ) инкубировали совместно в течение 20 мин при комнатной температуре и затем добавляли в лунки планшета. После 1 часа инкубации при 37°С и последующей отмывки добавляли 100 мкл конъюгата барстар-пероксидаза для выявления барназы или барназа-пероксидаза для выявления барстара (1 мкг/мл, в ФБТ) и инкубировали 1 час при 37°С. Заключительную отмывку и регистрацию пероксидазной активности осуществляли, как описано в Примере 1. Полученные калибровочные кривые конкурентной иммунодетекции представлены на фиг.4, 5.