ЦИКЛОГЕКСАНОКСИКАРБОНИЛ-ДИПЕПТИД И ЕГО ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСА ГЕПАТИТА С

Изобретение относится к новым синтетическим соединениям, а именно к N-ацилпроизводному дипептида, представляющего собой циклогексилоксикарбонил-пролил-триптофан (Cho-Pro-Trp-OH). Cho-Pro-Trp-OH ингибирует репродукцию вируса гепатита C (ВГС), а также обладает вирулицидным действием по отношению к ВГС. Соединение обладает низким токсическим эффектом на монослой перевиваемой линии клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ). Предлагаемое соединение можно рекомендовать для создания новых противовирусных препаратов, с использованием как в виде индивидуального средства, так и в составе композиций для лечения гепатита С. 2 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 табл., 5 пр.

1. Соединение Cho-Pro-Trp-OH имеет следующую структурную формулу:

2. Соединение по п. 1, обладающее противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С.

3. Соединение по п. 1, обладающее вирулицидной активностью в отношении вируса гепатита С.

Изобретение относится к медицине и фармацевтическому производству и касается нового синтетического соединения, а именно циклогексилоксикарбонил-пролил-триптофан (Cho-Pro-Trp-OH),

которое может быть использовано для создания нового противовирусного препарата против вируса гепатита C с целью применения как в виде индивидуального лекарства, так и в составе комплексной терапии для лечения гепатита C.

Функции белков вирусных ионоселективных каналов вовлечены во многие этапы репликационного цикла вируса. Эти каналы локализуются в вирусной оболочке или мембранах клетки хозяина и играют важную роль в процессе проникновения вирусов в клетку, а также в сборке и выходе вновь образовавшихся вирионов. Вирусные ионные каналы не всегда требуются для воспроизводства вируса, хотя их содействие обычно значительно увеличивает рост числа вирионов. Это семейство белков получило название виропорины (viroporins), оно включает в себя белки, которые содержат, по меньшей мере, один гидрофобный трансмембранный домен (ТМ-домен), в виде α-спирали [1]. Как правило, виропорины представлены небольшими белками (50-120 а.о.), которые имеют тенденцию к образованию гомоолигомеров. Исследования молекулярной архитектуры вирусных ионных каналов показали, что большинство из них образованы тетрамерами, хотя пента- и гексамерные структуры для виропоринов также характерны. Типичным представителем тетрамерных ион-селективных виропоринов является канал М2 вируса гриппа А. Этот уникальный виропорин специфичен к транспорту ионов водорода внутрь вириона, в то время как большинство виропоринов демонстрируют умеренную ионную селективность, то есть не отличаются предпочтением к какому-то конкретному иону. Пентамерный виропорин, представленный белком Vpu из ВИЧ-1, показывает умеренную катионную избирательность в растворах электролитов NaCl и KCl [2]. Это справедливо и для гексамерного виропорина р7 вирусного гепатита C (ВГС), который переносит одновалентные катионы (Na⁺ и K⁺) [3].

Высокая ионная селективность виропорина М2 вируса гриппа A обусловлена особым строением его ТМ-домена, который содержит остатки гистидина в положении 37 (His37) в виде тетрамерного сопряжения их имидазольных колец. Протоны из окружающей среды (внутриклеточной) протонируют три или все четыре имидазольных кольца гистидинов. Это приводит к конформационному изменению в результате электростатического отталкивания, что расширяет канал в районе His37 и позволяет протонам проникнуть внутрь клетки [4]. Индольная группа остатка триптофана-41 играет важную роль в стабилизации открытого состояния поры канала. Таким образом, молекулярная модель работы ионного канала М2 представляет собой «шлюзовой механизм» [5].

Препарат амантадин (Symmetrel. 1-адамантиламингидрохлорид) был одним из первых изученных ингибиторов протонного канала М2 вируса гриппа А. Он использовался в клинической практике против вируса гриппа А с 1966 г. [6]. Позднее, в 1985 г. было показано, что некоторые мутации в гидрофобной последовательности белка М2 могут приводить к резистентности вируса к амантадину и его аналогу римантадину (Flumantadine, 1-(1-адамантил)этиламин гидрохлорид). Эти данные позволили предположить, что белок М2 может быть мишенью для препаратов адамантанового ряда [7], а в 1992 г. эти предположения были подтверждены [8].

Недавние исследования показали, что ионная активность гексамерного канала белка р7 ВГС также может быть ингибирована препаратами адамантанового ряда in vitro [9, 10]. Это дает надежду, что канал р7 может быть хорошей мишенью для анти-ВГС-препаратов на основе адамантана и других карбоциклов. Неструктурный белок р7 ВГС состоит из 63 а.о. и имеет два трансмембранных домена (ТМ1 и ТМ2) [11]. Этот виропорин, локализующийся преимущественно во внутриклеточных мембранах, в опытах in vitro демонстрирует функцию ионных каналов, необходимых для сборки вируса и оптимального выхода из инфицированных клеток путем изменения кислотно-щелочного равновесия внутриклеточных везикул. Мембранный белок р7 представляет собой новую мишень для противовирусной терапии ВГС [12].

Сущность изобретения заключается в создании нового синтетического соединения, являющегося производным дипептида пролил-триптофана, защищенного по аминогруппе циклогексилоксикарбонильной группой, которое ингибирует репродукцию ВГС и обладает вирулицидным действием по отношению к ВГС. Соединение малотоксичное in vitro. Соединение Cho-Pro-Trp-OH имеет следующую структурную формулу:

Технический результат: получено новое малотоксичное соединение: (2S)-3-(1Н-идол-3-ил)[({1-[(циклогексилокси)карбонил]пирролидин-2-ил}карбонил)амино]пропановая кислота, обладающее противовирусной, в том числе вирулицидной, активностью в отношении ВГС для создания нового противовирусного препарата против ВГС.

Краткое описание чертежей.

Для более ясного понимания сути заявленного изобретения, которое отражено в формуле изобретения, а также для демонстрации его особенностей и преимуществ далее приводится подробное описание со ссылками на фигуры чертежей.

На фиг. 1 представлена схема синтеза соединения Cho-Pro-Trp-OH методом смешанных ангидридов. Схема синтеза соединения циклогексилоксикарбонил-пролил-триптофана, где NMM - N-метилморфолин, IBCF - изо-бутилхлорформиат.

На фиг. 2 представлена масс-спектрометрия соединения Cho-Pro-Trp-OMe (циклогексилоксикарбонил-пролил-триптофан метиловый эфир), соединения Cho-Pro-Trp-OMe. [М+Н]=442.

На фиг. 3 представлена масс-спектрометрия соединения Cho-Pro-Trp-OH. [М+Н]=428; [M+Na]=450; [М+K]=466.

На фиг. 4 в виде таблицы 1 представлены данные влияния различных концентраций соединения Cho-Pro-Trp-OH на репродукцию ВГС в культуре перевиваемых клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ) при добавлении его до инфицирования, одномоментно с вирусом и после инфицирования. ИД₅₀ – концентрация, при которой происходит подавление 50% вируса. 0 - все клетки выжили, (+) - 15% клеток погибло; (++) - 50% погибло, (++++) - все клетки погибли, К.в. - контроль вируса (без вещества).

На фиг. 5 в виде таблицы 2 представлены данные о вирулицидной активности соединения Cho-Pro-Trp-OH на монослое СПЭВ при различных концентрациях вещества и разведениях вируса. ТЦИД₅₀ - тканевая инфекционная доза вируса, заражающая 50% экспонированных клеточных культур. 0 - все клетки выжили; (++) - 50% погибло; (++++) - все клетки погибли. К.в. - контроль вируса (без соединения)

На фиг. 6 в виде таблицы 3 представлены биологические свойства соединения Cho-Pro-Trp-OH. ИД₅₀ - ингибирующая доза 50: минимальное разведение препарата, вызывающее защиту 50% клеток монослоя. МПК - максимально переносимая концентрация - половина концентрации соединения, которая не оказывает на клетки токсического действия. ИД₉₅ - минимальная концентрация соединений, вызывающая защиту 95% клеток. Химиотерапевтический индекс (ХТИ) отношение МПК к ИД₅₀.

Для получения соединения Cho-Pro-Trp-OH может быть использованы различные подходы. Один из способов получения соединения Cho-Pro-Trp-OH - метод смешанных ангидридов (Фиг. 1). Однако предложенный метод синтеза не должен рассматриваться как некое ограничение объема настоящего изобретения во всех отношениях.

Образование пептидной связи между циклогексаноксикарбонилпролином и метиловым эфиром триптофана проводили в одну стадию в эквимолярном соотношении.

При синтезе соединений использовали циклогексанол, трифосген (бис(трихлорметил)карбонат) и L-аминокислоты фирмы Sigma-Aldrich (США). Использовали изо-бутилхлорформиат (IBCF) фирмы «Fluka» (Швейцария), N-метилморфолин (NMM) фирмы Sigma-Aldrich (США). Все используемые для конденсации и удаления защитных групп растворители предварительно абсолютировали и перегоняли по стандартным методикам. Идентификация полученных соединений осуществлялась с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах Silufol (Чехия) в системах: метанол-хлороформ. 13:60 (А), втор-бутанол - 3%-ный аммиак, 100:44 (В), н-бутанол - уксусная кислота - вода - пиридин, 30:3:12:10 (С). Масс-спектры МАЛДИ получали на масс-спектрометре Bruker autoflex speed (Bruker Daltonics Inc., Германия), оснащенном твердотельным УФ-лазером с λ=355 нм и рефлектроном, в режиме регистрации положительно заряженных ионов. Для регистрации масс-спектров МАЛДИ использовали стальную мишень МТР 384 ground steel (Baiker Daltonics Inc., Германия).

Для регистрации масс-спектров МАЛДИ образец смешивали с раствором матрицы CIN (синапиновая кислота, фирмы Sigma-Aldrich (США)) в соотношении 1:1, наносили на стальную мишень и высушивали.

Вирусологические исследования проведены с цитопатогенным вариантом ВГС, генотип 1b, выделенным из сыворотки крови больных хроническим гепатитом C [13]. Вируссодержащий материал использовали в виде пробы культуральной жидкости, собранной через 5 суток после заражения клеточных культур. Изучение противовирусной активности соединения проведено на чувствительной к продукции ВГС культуре клеток почки эмбриона свиньи (СПЭВ). Культуры выращивали в виде однодневного монослоя в 48-луночных пластиковых культуральных панелях в среде 199 (производство ООО Компания «ПанЭко») с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина и 10%-ной сыворотки крупного рогатого скота. Контроль культуральных клеток проводили с помощью светооптического микроскопа.

Для более конкретного описания биологических свойств полученного соединения в предлагаемом изобретении под противовирусной и вирулицидной активности нужно понимать:

Вирулицидная активность соединения связана с прямым инактивирующим действием соединения на вирионы в составе вирусной популяции, в результате чего частично или полностью утрачивается инфекционная активность вируса. Чтобы проверить вирулицидные свойства вещества (соединения), достаточно провести инкубацию смеси вируса и вещества в течение определенного времени, после чего проверить инфекционные свойства вируса без исследуемого вещества и вируса в смеси с веществом методом титрования в культурах клеток или в организме лабораторных животных. Достоверное снижение инфекционной активности вируса более чем на 1,0 логарифм (lg) или ее полная утрата по сравнению с вирусом без вещества свидетельствует о проявлении вирулицидной активности исследуемого соединения.

Противовирусная активность соединения, как правило, включает как вирулицидную активность вещества, так и его противовирусные свойства, т.е. способность ингибировать ту или иную стадию репликации вируса: от адсорбции вируса на клетки, его проникновения, до влияния на сборку и выход вируса из зараженной клетки. Поэтому противовирусную активность исследуемого вещества проверяют путем обработки монослоя клеток или введением вещества лабораторным животным до заражения вирусом (профилактический эффект вещества), в момент заражения (лечебно-профилактический эффект) и через определенный интервал времени после заражения (лечебный эффект). Противовирусный эффект вещества оценивается как по проценту жизнеспособных инфицированных клеток, или здоровых лабораторных животных, сохранившихся в условиях применения вещества, по сравнению с контрольной группой, так и по его свойству снижать способность инфицированных клеток или зараженных животных продуцировать инфекционный вирус.

Настоящее изобретение проиллюстрировано нижеследующими примерами. Однако эти примеры не должны рассматриваться как некое ограничение объема настоящего изобретения во всех отношениях.

Cho-Pro-Trp-OH синтезировали методом смешанных ангидридов, исходя из Cho-Pro-OH, полученному по методике [14] и HCl*H-Trp-OMe с последующим омылением. Схема синтеза соединения Cho-Pro-Trp-OH представлена на фиг. 1.

Пример 1. Получение Cho-Pro-Trp-OMe (циклогексилоксикарбонил-пролил-триптофан метиловый эфир).

Cho-Pro-OH (циклогексилоксикарбонил-пролин) был получен по методике, описанной нами ранее [14]. Полученный Cho-Pro-OH был использован в синтезе конечного соединения.

К 1,0 г (4,15 ммоль) Cho-Pro-OH в 25,0 мл CHCl₃ прибавляли 0,42 мл (4,15 ммоль) NMM и при перемешивании при минус 25°C, 0,56 мл (4,15 ммоль) IBCF. Перемешивали 10 мин и добавляли охлажденный до минус 20°C раствор 1,05 г (4,15 ммоль) гидрохлорида римантадина в 10,0 мл CHCl₃ с 0,42 мл (4,15 ммоль) NMM. Перемешивали 30 мин при минус 20°C, затем 1 ч при 0°C и 10 ч при 20°C. Растворитель удаляли в вакууме, остаток растворяли в 35,0 мл этилацетата и 10,0 мл H₂O и последовательно промывали 0,25 М H₂SO₄ (4,0 мл×1), 0,25 М KHCO₃ (10,0 мл×2) и H₂O (5,0 мл×1). Органический слой отделяли и сушили безводным Na₂SO₄. Этилацетат удаляли в вакууме, получали маслянистый продукт.

Выход 1,31 г (93%); R_ƒ.98 (A), 0,88 (В), 0,90 (С); [α]_D²⁰ -30°; m/z найдено [М+Н]⁺: 442,63; вычислено M (C₂₄H₃₁N₃O₅) 441,22 atomic unit (a.u.) (фиг. 2)

Полученный таким образом эфир N-ацилдипептида (Cho-Pro-Trp-OMe) впоследствии подвергался омылению в смеси 0,2 н NaOH - Ацетон (1:1)

Пример 2. Получение Cho-Pro-Trp-OH (циклогексилоксикарбонил-пролил-триптофан). К раствору 1,1 г (2,49 мМ) Cho-Pro-Trp-OMe в 12,0 мл ацетона прибавляют 16,0 мл (4,0 мМ) 0.25 н NaOH. Выдерживают реакционную смесь при 20°C в течение 45 мин. Ацетон удаляют в вакууме, водную фракцию подкисляют 10%) лимонной кислотой до pH 4, выпадает маслянистый осадок. Переносят в делительную воронку и вносят 20,0 мл этилацетата, перемешивают до образования двух прозрачных слоев, водный слой отделяют и промывают водой (2×4 мл). Водный слой вновь отделяют, органический - сушат безводным Na₂SO₄. Этилацетат удаляют в вакууме, образуется бурое масло, весом 1,66 г. После перетирания полученного масла с эфиром образуется аморфная субстанция. Эфир декантируется. Субстанция сушится в вакууме до образования плотной пены. Пена замораживается при минус 40°C, затем разрушается и вновь сушится в вакууме.

Выход: бежевая пена, 1,02 г (96%), [α]^D₂₀-20°, R_f 0.75 (A); R_f0,72 (B); R_f0,66 (С), m/z найдено [М+Н]⁺: 428,22; вычислено М (C₂₃H₂₉N₃O₅) 427,61 a.u. (фиг. 3).

Пример 3. Исследование противовирусной активности Cho-Pro-Trp-OH.

Противовирусную активность предлагаемого соединения определяли в инфицированных ВГС культурах клеток СПЭВ, выращенных в виде полного однодневного монослоя в 96-луночных пластиковых культуральных панелях. Соединение в концентрациях 10,0; 5,0; 2,5; 1,25; 0,62; 0,15; мкг/200,0 мкл вносили за 6 часов до инфицирования монослоя клеток вирусом в дозе 0,1 ТЦИД₅₀, сразу же после адсорбции ВГС на клетки и через 6 часов после инфицирования клеток. Панели инкубировали при 37°C в течение 5-6 суток, когда в контрольных, не обработанных соединением лунках, не отмечена гибель 100%) клеток монослоя. Противовирусную активность соединений определяли по их способности защищать клетки СПЭВ от цитопатогенного действия вируса в сравнении с контрольными инфицированными культурами (без соединения). Определяли ИД₅₀.

Обнаружено, что синтетическое соединение Cho-Pro-Trp-OH показало высокую степень ингибирования репродукции ВГС. Следует отметить выраженный противовирусный эффект соединения и при внесении его в культуру клеток за 6 ч до заражения и одномоментно с заражением ВГС (фиг. 4).

Пример 4. Исследование вирулицидной активности соединения в отношении ВГС.

В опыте соединение в концентрации 5,0; 2,5; 1,25 мкг/мл смешивали с вирусом следующим образом: 900,0 мкл раствора соединения с добавлением 100,0 мкл ВГС-содержащего материала в исходной концентрации. В качестве контрольного опыта к 100,0 мкл вирусного материала добавляли 900,0 мкл физиологического раствора. Экспозиция с вируссодержащим материалом проведена при комнатной температуре в течение 30 минут. После чего титровали инфекционную активность ВГС в каждом варианте опыта в культурах клеток СПЭВ, заражая клетки 10-кратными разведениями смеси вируса и смеси соединения Cho-Pro-Trp-OH с ВГС. Соединение характеризовалось вирулицидной активностью только в том случае, если инфекционный титр ВГС для клеток СПЭВ после экспозиции снижался в 100 и более раз, по сравнению с контрольным титрованием.

В результате была обнаружена высокая вирулицидная активность соединения Cho-Pro-Trp-OH. Снижение инфекционного титра произошло более чем на пять логарифмов (10000 раз) по отношению к вирусному контролю. Данные представлены в таблице 2 (фиг. 5).

Пример 5. Определение цитотоксического действия.

Токсичность соединения была изучена при внесении его в концентрациях 10,0; 5,0; 2,5 и 1,25 мг/200,0 мкл на монослой клеток культуры ткани СПЭВ в 48-луночных панелях и инкубации при 37°C в течение 72 часов. Состояние клеточного монослоя проверяли с помощью свето-оптического микроскопа. Максимально переносимой концентрацией (МПК) считают концентрацию соединения, которая вызывает токсическую гибель 50% клеток монослоя. МПК для соединения Cho-Pro-Trp-OH, составила более 10 мкг/200 мкл (фиг. 5.).

Т.о., исходя из данных таблицы 3 (фиг. 6), химиотерапевтический индекс (ХТИ) для соединения Cho-Pro-Trp-OH составил >32 - при профилактической схеме внесения; >16 - при лечебно-профилактической схеме соединения с вирусом и >8 - при лечебной схеме внесения.

Предлагаемое соединение

может быть использовано для создания новых противовирусных препаратов, ингибиторов функции ионоселективного канала р7 ВГС с использованием как в виде индивидуального лекарства, так и в составе комплексной терапии гепатита C, применяемой в виде лечебной, профилактической и лечебно-профилактической схемах.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Gonzalez М.Е., Carrasco L. Viroporins, // FEBS Lett. 2003. V. 552. P. 28-34.

2. Ewart, G.D.; Sutherland, Т.; Gage, P.W.; Cox, G.B. The Vpu protein of human immunodeficiency virus type 1 forms cation-selective ion channels. // J. Virol. 1996. V. 70. P. 7108-7115.

3. Premkumar. A.; Wilson, L.; Ewart, G.D.; Gage, P.W. Cationselective ion channels formed by p7 of hepatitis С virus are blocked by hexamethylene amiloride. // FEBS Lett. 2004. V. 557, P. 99-103.

4. Gazzarrini S., Kang M., Abenavoli A., Romani G., Olivari C, Gaslini D., Ferrara G., Etten J.L., Kreim M., Kast S.M., Thiel G., Moroni A. Chlorella virus ATCV-1 encodes a functional potassium channel of 82 amino acids // Biochem. J. 2009. V. 420 P. 295-303.

5. Okada A., Miura Т., Takeuchi H. Protonation of Histidine and Histidine-Tryptophan Interaction in the Activation of the M2 Ion Channel from Influenza A Virus // Biochemistry, 2001. V. 40 (20), P. 6053-6060

6. Oxford J.S., Galbraith A. Antiviral activity of amantadine: a review of laboratory and clinical data. // Pharmacol. Ther. 1980. V. 11. P. 181-262.

7. Hay A.J., Wolstenholme A.J., Skehel J.J., Smith M.H. The molecular basis of the specific anti-influenza action of amantadine. // EMBO J. 1985. V. 4. P. 3021-3024.

8. Kendal A.P., Klenk H.D. Amantadine inhibits an early, M2 protein-dependent event in the replication cycle of avian influenza (H7) viruses // Arch. Virol. 1991, V.l 19, P. 265-273.

9. Griffin S.D., Beales L.P., Clarke D.S., Worsfold O., Evans S.D., Jaeger J., Harris M.P.,

10. Rowlands D.J. The p7 protein of hepatitis С virus forms an ion channel that is blocked by the antiviral drug, Amantadine. // FEBS Lett. 2003. V. 535. P. 34-38.

11. Griffin S., Stgelais C., Owsianka A.M., Patel A.H., Rowlands D., Harris M. Genotype-dependent sensitivity of hepatitis С virus to inhibitors of the p7 ion channel. // Hepatology. 2008. V. 48. P. 1779-1790.

12. Griffin S.D. Plugging the holes in hepatitis С virus antiviral therapy // Proc Natl Acad Sci USA 2009. V. 106. P. 12567-12568.

13. П.Г. Дерябин, Д.К. Львов. «Высокопродуктивный вариант вируса гепатита C. Выделение, характеристика, идентификация». Доклады Академии наук РФ, 1998, т. 358, N. 5, с. 688-691.

14. Порошин К.Т., Шибнев В.А., Гречишко B.C. Синтез карбоциклогексилоксиаминокислот. // Изв. акад. наук (сер. хим.). 1965. №7. С. 1294-1295.