[1]Изобретение относится к иммунологии и медицинской диагностике и представляет собой метод иммунохроматографического определения специфических антител. Наличие в сыворотке крови антител, специфичных к возбудителю определенного заболевания, является эффективным критерием, позволяющим с высокой достоверностью диагностировать соответствующее инфекционное заболевание (Rose N.R. (ed.). Manual of Clinical Laboratory Immunology (4th ed.). Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1992.). В случае диагностики инфекционных заболеваний преимуществами данного подхода по сравнению с непосредственным выявлением и идентификацией возбудителя является определенность при выборе тестируемой пробы (сыворотка крови, тогда как возбудитель может на данной стадии инфекции преимущественно локализоваться в самых разных органах и тканях), а также возможность быстрой детекции достаточно высокого уровня антител, индуцированного контактом с антигеном, в то время как для выявления антигена могут потребоваться довольно продолжительные стадии доращивания до достижения им регистрируемой концентрации. Хотя в настоящее время активно используются как микробиологические, так и иммунологические способы диагностики инфекционных заболеваний, для проведения массового первичного скрининга оптимально иммунологическое определение наличия в сыворотке крови специфических антител (серодиагностика), которое может быть реализовано с высокой экспрессностью и производительностью. Особенный интерес вызывают серодиагностические подходы в тех случаях, когда в силу особенностей роста микроорганизмов получение результатов микробиологического тестирования может потребовать значительного времени.
[2]Благодаря высокой чувствительности и специфичности серологические тесты незаменимы при массовых обследованиях. Кроме того, гуморальный иммунный ответ отражает активный инфекционный процесс, и поэтому результаты иммунохимического тестирования достоверно отражают именно случаи заболевания, дискриминируя их от бактерионосительства.
[3]Иммунохимический анализ может быть реализован в различных форматах. Однако, поскольку для массовых обследований первоочередное значение имеют скорость и производительность тестирования, в данной ситуации несомненными преимуществами обладает иммунохроматографический анализ, для которого все необходимые реагенты предварительно нанесены на мембранные компоненты тест-полоски, и ее контакт с тестируемой пробой непосредственно инициирует движение фронта жидкости по мембранам, протекание специфических реакций и формирование иммунных комплексов, которые благодаря включению в их состав окрашенного маркера могут детектироваться визуально или с помощью оптического детектора (Рис.1).
[4]Применительно к серодиагностике (определению антител, специфичных к определенному антигену или группе антигенов) общая схема иммунохроматографии заключается в следующем.
[5]Проба, потенциально содержащая специфические антитела, под действием капиллярных сил перемещается вдоль тест-полоски. При этом она вначале взаимодействует с окрашенными частицами (коллоидное золото или иной маркер), на поверхности которых адсорбирован компонент, предназначенный для связывания с антителами. Обычно в качестве такового компонента выбирают антивидовые антитела (иммуноглобулины, выделенные из сыворотки животного, иммунизированного препаратом иммуноглобулинов человека или другого организма, для которого проводится серодиагностика), белок А из Staphylococcus aureus или белок G из Streptococcus spp. Затем фронт жидкости преодолевает аналитическую (тестовую) зону, которая представляет собой участок мембраны с иммобилизованным антигеном (нативным или специально модифицированным для эффективной сорбции). Степень связывания маркера с иммобилизованным антигеном и, соответственно, интенсивность окрашивания мембраны определяются концентрацией специфических антител в пробе. Для проверки качества реагентов и сохранения функциональности тест-системы используется расположенная далее контрольная зона, в которой компонент, сорбированный на окрашенной частице, связывается с соответствующим иммобилизованным на мембране реагентом.
[6]Ниже представлена информация о методике, реализуемой в тест-системе «TB-Check-I» фирмы «Vedalab» (Франция) - см. http://www.sanitamedikal.com/Assets/MD_220002_m3_TB_1408_c.pdf. Данная методика определения антител к возбудителю туберкулеза рассматривается в настоящей заявке в качестве прототипной.
[7]Метод основан на комбинации антител к иммуноглобулинам человека, конъюгированных с хромогеном, и высокоочищенного БЦЖ-белка… При прохождении исследуемого образца через адсорбционную зону тестового устройства конъюгат, содержащий меченые антитела, связывается с IgG, образуя комплекс «антиген-антитело». Этот комплекс взаимодействует с высокоочищенным БЦЖ-белком в тестовой зоне устройства, и если концентрация специфического IgG к возбудителю туберкулеза превышает 350 Е/мл, образует окрашенную полосу. При низкой концентрации антител окрашенная полоса в тестовой зоне не образуется. Несвязавшийся конъюгат взаимодействует с реагентом в контрольной зоне тестового устройства, образуя окрашенную полосу, что указывает на правильное проведение теста… Процедура исследования: …заполнить одноразовую пипетку сывороткой или плазмой и внести 1 каплю в окно для пробы тестового устройства. Добавить в окно для пробы 5-6 полных капель разбавляющего раствора (дилюента). Через 10-15 мин произвести учет результатов.
[8]Одной из наиболее важных задач в иммунохроматографии является повышение чувствительности анализа. Для увеличения чувствительности анализа следует использовать как можно более высокие концентрации конъюгата и рецептора в аналитической зоне. Однако увеличение концентрации коллоидного конъюгата лимитировано тем фактом, что конъюгат должен полностью продиффундировать через иммунохроматографические мембраны за время проведения анализа (~10 мин), поэтому использование конъюгатов с оптической плотностью выше 10 проблематично. Увеличение концентрации центров связывания на поверхности коллоида лимитировано низкой сорбционной емкостью наночастиц золота - обычно концентрация белка около 10 мкг/мл является насыщающей (GHITESCU, L. and M. BENDAYAN. Immunolabeling efficiency of protein A-gold complexes. J. Histochem. Cytochem., 38, 1523-1530, 1990). Сорбционная емкость рабочей мембраны иммунохроматографического теста на несколько порядков выше, чем коллоидного золота - до 15 мг/мл (http://www.millipore.com/publications.nsf/a73664f9i981af8c852569b9005b4eee/348ee7096d9 3729b85256bf40066a40d/$FILE/tb500en00.pdf), но повышение концентрации рецептора в аналитической зоне в стандартном методе иммунохроматографического анализа для серодиагностики нецелесообразно по экономическим причинам, так как рецептором обычно являются самые дорогие компоненты тест-системы: рекомбинантные белки бактерий или вирусов. Поэтому нами был предложен способ иммунохроматографического анализа, в котором молекулы антигена или антигенов сорбируются на поверхности коллоидного золота (при этом расход антигена значительно снижается: с 300-600 нг до 100 нг на тест), а в аналитической зоне тест-полоски иммобилизуется компонент для связывания антител: антивидовые антитела, белок А из Staphylococcus uureus или белок G из Streptococcus spp. Перечисленные реагенты для связывания антител широко используются в иммунохимии (в иммуноанализе, для выделения очистки антител и т.д.), поэтому существует налаженное массовое производство данных реагентов и их стоимость более чем на порядок ниже стоимости рекомбинантных антигенов, поэтому 10-кратное повышение концентрации данных реагентов не приводит к существенному повышению стоимости теста и при этом позволяет значительно повысить чувствительность анализа.
[9]Предложенный подход был реализован заявителями для серодиагностики туберкулеза с использованием антигена 38 кДа (Ag78, antigen 5, PhoS, Rv0934) M. tuberculosis. Ниже представлено описание способа получения тест-полосок и проведения иммунохроматографического анализа, а также полученные результаты.
[11]Для формирования тест-системы использовали набор мембран «mdi Easypack» фирмы «Advanced Microdevices» (Индия), включающий рабочую мембрану CNPC-SN12 L2-P25 (размер пор 15 мкм), мембрану под конъюгат PT-R5, мембрану для нанесения образца GFB-R4, адсорбирующую мембрану АР 045, для нанесения БСА использовалась мембрана PT-R5.
[12]На мембраны были нанесены следующие реагенты:
[13]1. Белок А из Staphylococcus aureus, производства ООО «Имтек» (Россия).
[14]2. Конъюгат коллоидного золота со средним диаметром частиц 30 нм и рекомбинантного антигена 38 кДа М. tuberculosis (Rv0934), фирмы «Arista Biologicals Inc.» (США), кат. № AGMTB-0220.
[15]3. Моноклональные антитела НТМ81 против рекомбинантного антигена 38 кДа M. tuberculosis. Центр молекулярной диагностики и терапии, Москва (Россия).
[16]Для формирования аналитической зоны использовали белок А, контрольной зоны - моноклональные антитела НТМ81 против рекомбинантного антигена 38 кДа M. tuberculosis. На 1 см полосы наносили 2 мкл раствора белка А (10,0 мг/мл в 50 мМ фосфатном буфере, pН 7,4) и 2 мкл раствора антител (0,5 мг/мл в том же буфере). Конъюгат коллоидного золота с антигеном наносили в разведении, соответствующем D520=6,5, в объеме 10 мкл на 1 см полосы. Для нанесения реагентов использовали диспенсер «IsoFlow» фирмы «Imagene Technology» (США). После нанесения реагентов мембраны высушивали не менее 24 ч в помещении с контролируемыми температурой и влажностью. Листы мембран с нанесенными иммунореагентами нарезали на индивидуальные тест-полоски шириной 3,5 мм.
[17]Для сравнения изготавливали тест-полоски по стандартной схеме с использованием тех же реагентов и мембран, но с коллоидным золотом. Конъюгировали белок А (10 мкг/мл, конъюгат наносили на мембрану из оптической плотности 7), а в аналитической зоне иммобилизовали рекомбинантный белок 38 кДа М. tuberculosis.
[18]Иммунохроматографический анализ проводили при комнатной температуре. Тест-полоску погружали в пробу на 1 мин в вертикальном положении, а затем извлекали и помещали на горизонтальную поверхность. Детекцию связывания коллоидного золота осуществляли через 10 мин визуально (Рис.2).
[19]Достигнутая при использовании предложенного способа анализа чувствительность на порядок превышает чувствительность, достигнутую при использовании стандартного способа анализа.
[20]Рис.1. Принцип иммунохроматографического анализа для серодиагностики. 1 - мембрана, адсорбирующая образец; 2 - частицы коллоидного золота; 3 - реагент для связывания антител: антивидовые антитела, белок А, белок G или др.; 4 - пластиковая основа; 5 - рабочая мембрана; 6 - конечная адсорбирующая мембрана; 7 - антиген, иммобилизованный в аналитической зоне; 8 - антивидовые антитела, иммобилизованные в контрольной зоне.
[21]Рис.2. Тестирование сывороток крови больных туберкулезом (3 пробы): А - стандартным методом и Б - альтернативным методом, предложенным заявителями (стрелкой указано положение аналитической зоны).
