патент
№ RU 2652126
МПК C08F220/54
Номер заявки
2017136569
Дата подачи заявки
17.10.2017
Опубликовано
25.04.2018
Страна
RU
Как управлять
интеллектуальной собственностью
Реферат

Изобретение относится к области биохимии и медицины, к способу получения глюкозочувствительных полимерных гидрогелей, которые могут применяться в качестве носителей для контролируемого выделения инсулина при появлении глюкозы. Способ получения глюкозочувствительных полимерных гидрогелей осуществляют путем полимеризации под действием окислительно-восстановительного инициатора водного раствора, содержащего 0,15-0,5% мас. N-(2-D-глюкоз)акриламида, 3,0-5,0% мас. акриламида, 0,01-0,06% мас. N,N-метиленбисакриламида, 0,05-0,15% мас. конканавалина А и 0,03-0,10% мас. меркаптоуксусной кислоты. Технический результат – полученный способом гидрогель обеспечивает выделение повышенного количества инсулина на начальной стадии появления глюкозы при последующем регулируемом выделении в последующее время действия. 3 табл., 7 пр.

Формула изобретения

Способ получения глюкозочувствительных полимерных гидрогелей путем полимеризации под действием окислительно-восстановительного инициатора водного раствора, содержащего 0,15-0,5% мас. N-(2-D-глюкоз)акриламида, 3,0-5,0% мас. акриламида, 0,01-0,06% мас. N,N-метиленбисакриламида и 0,05-0,15% мас. конканавалина А, отличающийся тем, что водный раствор дополнительно содержит 0,03-0,10% мас. меркаптоуксусной кислоты.

Описание

[1]

Изобретение относится к области химии полимеров, биохимии и медицины, а именно к способу получения глюкозочувствительных полимерных гидрогелей, которые могут применяться в качестве носителей для контролируемого выделения инсулина при появлении глюкозы в окружающей среде.

[2]

Как известно, жизненно важные вещества полипептидной природы (ферменты, ингибиторы, гормоны и т.п.) синтезируются внутри организма, а не попадают в него с пищей. Последнее невозможно, так как протеолитические ферменты, участвующие в процессе пищеварения, гидролизуют белки до аминокислот. Поэтому для устранения дефицита такого белка его вводят в организм инъекционно, минуя пищеварительный тракт.

[3]

Одним из таких препаратов является гормон поджелудочной железы инсулин - полипептид, вырабатываемый β-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы. Инсулин является универсальным гормоном, влияющим на большое число процессов, протекающих в организме, таких как: транспорт глюкозы через мембрану; утилизация глюкозы; ингибирование глюконеогенеза (образования глюкозы из предшественников неуглеводной природы); метаболизм глюкозы; метаболизм липидов; метаболизм белков; размножение клеток и т.д. Частичная или полная недостаточность инсулина приводит к сахарному диабету. Уже сейчас по некоторым оценкам, в мире страдают от диабета около 300 миллионов человек, причем выявлена четкая тенденция к увеличению роста числа больных.

[4]

В физиологических условиях инсулин вырабатывается поджелудочной железой в ответ на повышение концентрации глюкозы. Пороговой для секреции инсулина является концентрация глюкозы 80-100 мг/100 мл крови, а максимальная скорость секреции достигается при концентрации глюкозы 300-500 мг/100 мл. Секреция инсулина носит двухфазный характер. Немедленный ответ или первая фаза реакции начинается в пределах одной минуты после повышения концентрации глюкозы, продолжается первые 8-10 минут. Затем скорость выделения инсулина резко замедляется и наступает вторая более медленная и продолжительная фаза практически равномерного выделения инсулина, резко обрывающаяся после удаления глюкозы [Марри Р., Греннер Д., Мейес П. Родуэлл В. Биохимия человека. - М.: Мир 1993. С. 247].

[5]

Обычно (в норме) инсулин попадает в печень через кровеносные сосуды, соединенные с портальной печеночной веной. Печень, в свою очередь, контролирует количество инсулина, достигающего другие органы и ткани. При инъекционном же введении инсулина (а это наиболее распространенный способ лечения сахарного диабета) такой контроль отсутствует, физиологическое соотношение между концентрациями инсулина и глюкозы нарушается, что и является причиной таких осложнений при сахарном диабете, как сердечно-сосудистые заболевания, расстройство функций головного мозга и т.д. [М. Saffran, in: Targeting of Drags: The Challenge of Peptides and Proteins, G. Gregoriadis (ed.), Plenum Press, New York (1992), pp. 89-95].

[6]

Поскольку повышение концентрации глюкозы в крови - главный стимул секреции инсулина поджелудочной железой в живом организме, то крайне перспективным представляется создание систем, которые, будучи имплантированы в организм больного, контролируемо выделяли бы инсулин в ответ на повышение концентрации глюкозы по естественному, двухфазному, механизму.

[7]

Известен способ получения глюкозочувствительных полимерных гидрогелей путем взаимодействия углеводных производных инсулина с конканавалином A [Sato S., Yeong S.Y., McRea Y.C., Kim S.W. Self-regulating insulin-delivery systems. II. In vitro studies. // J. Control. Release. 1984. V. 1. P. 67-77]. В качестве углеводных производных инсулина используют N-сукцинилглюкозамин-инсулин, N-глутарилглюкозамин-инсулин, n-(глутарилоамидо)фенил-α-(D-глюкопиранозид)-инсулин, n-(глутарилоамидо)фенил-α-(В-маннопиранозид)-инсулин, n-(сукциниламидо)фенил-α- (D-глюкопиранозид)-инсулин, n-(сукциниламидо)фенил-α-(D-маннопиранозид)-инсулин. Конканавалин А - белок с молекулярной массой 102000, имеющий четыре места связывания углеводов. При реакции с углеводным производным инсулина конканавалин А выполняет роль сшивающего агента, образуя комплексные соединения с остатками углеводов. При появлении глюкозы в окружающей среде она вытесняет углеводное производное инсулина из его комплекса с конканавалином А, в результате чего гидрогель распадается и в окружающую среду выделяется углеводное производное инсулина.

[8]

Недостатком этого способа является выделение в окружающую среду всех компонентов полимерного гидрогеля, а также невозможность применения этой системы для контролируемого выделения инсулина, а не его углеводного производного.

[9]

Известен способ получения глюкозочувствительных полимерных гидрогелей путем взаимодействия декстранов с конканавалином A [Tang М., Zhang R., Bowyer A., Eisenthal R., Hubble J.A reversible hydrogel membrane for controlling the delivery of macromolecules. // Biotechnol. Bioeng. 2003. V. 82. № 1. P. 47-53].

[10]

Недостатком этого способа является выделение в окружающую среду при взаимодействии с глюкозой всех компонентов полимерного гидрогеля.

[11]

Известен способ получения глюкозочувствительных полимерных гидрогелей путем взаимодействия производного глюкозы с конканавалином А [И.Л. Валуев, В.В. Чупов, Г.А. Сытов, Л.И. Валуев, Н.А. Платэ. Фазообратимые гидрогели на основе акриламида и N-(2-D-глюкоз)акриламида. // Высокомолек. соед., 1997, Т. 39Б, №4, С. 751-754].

[12]

В качестве производного глюкозы используют сополимер 3,9-14,5% мол. N-(2-D-глюкоз)акриламида и 85,5-96,1% мол. акриламида, а взаимодействие осуществляют путем смешивания водного раствора, содержащего 10-25% мас. сополимера N-(2-D-глюкоз)акриламида и акриламида, с водным раствором конканавалина А.

[13]

При реакции с глюкозосодержащим полимером конканавалин А выполняет роль сшивающего агента, образуя комплексные соединения с остатками глюкозы, принадлежащими различным полимерным цепям. В результате реакции образуется гидрогель, степень набухания которого в воде определяется содержанием звеньев N-(2-D-глюкоз)акриламида в сополимере и соотношением N-(2-D-глюкоз)акриламид/конканавалин А. При добавлении определенного количества глюкозы она вытесняет конканавалин А из комплекса, в результате чего происходит разрушение гидрогеля с образованием растворимого сополимера N-(2-D-глюкоз)акриламида и акриламида и растворимого комплекса конканавалин А - глюкоза. Если в гидрогель предварительно был введен инсулин, то при разрушении гидрогеля происходит выделение инсулина в раствор. Таким образом, синтезированная система представляет собой модель поджелудочной железы, способной выделять определенное количество инсулина в ответ на появление в растворе определенного количества глюкозы.

[14]

Недостатком этого способа является одностадийное выделение инсулина, а также образование растворимого синтетического сополимера N-(2-D-глюкоз)акриламида с акриламидом при выделении инсулина. При использовании в живых организмах этот сополимер накапливается в организме, сорбируясь на мембранах клеток и приводя к токсическому эффекту.

[15]

Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам является способ получения глюкозочувствительных полимерных гидрогелей путем полимеризации под действием окислительно-восстановительного инициатора водного раствора, содержащего 0,15-0,5% мас. N-(2-D-глюкоз)акриламида, 3,0-5,0% мас. акриламида, 0,01-0,06% мас. N,N-метиленбисакриламида и 0,05-0,15% мас. конканавалина А [Валуев И.Л., Ванчугова Л.В., Валуев Л.И., Глюкозочувствительные гидрогелевые системы // Высокомол. соед. 2011. Т. 53А. №5. С. 691-695].

[16]

Полимерные цепи в полученных гидрогелях сшиты ковалентными связям N,N-метиленбисакриламида и связями между конканавалином А (Кон А) и звеньями N-(2-D-глюкоз)акриламида (ГАА). В растворе глюкозы связь «Кон А- звено ГАА» замещается связью «Кон А - глюкоза» и степень набухания гидрогелей увеличивается, что приводит к выделению предварительно введенного в гидрогель инсулина. Выделение инсулина происходит равномерно в одну стадию и через 60 мин составляет до 80% от первоначально введенного в гидрогель инсулина.

[17]

Недостатком этого способа является равномерное выделение инсулина.

[18]

Задачей изобретения является повышение скорости выделения инсулина на начальном этапе.

[19]

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является реализация физиологического пути изменения концентрации инсулина при увеличении уровня глюкозы в растворе.

[20]

Технический результат достигается тем, что в способе получения глюкозочувствительных полимерных гидрогелей путем полимеризации под действием окислительно-восстановительного инициатора водного раствора, содержащего 0,15-0,5% мас. N-(2-D-глюкоз)акриламида, 3,0-5,0% мас. акриламида, 0,01-0,06% мас. N,N-метиленбисакриламида и 0,05-0,15% мас. конканавалина А, водный раствор дополнительно содержит 0,03-0,10% мас. меркаптоуксусной кислоты.

[21]

Пример 1

[22]

При комнатной температуре и постоянном перемешивании в 94,6 мл дистиллированной воды растворяют 5,0 г акриламида, 0,3 г N-(2-D-глюкоз)акриламида, 0,01 г N,N-метиленбисакриламида, 0,05 г конканавалина А и 0.03 г меркаптоуксусной кислоты. После полного растворения в раствор добавляют 0,04 г персульфата аммония и 40 мкл N,N,N',N'- тетраметилэтилендиамина. Образовавшийся раствор дегазируют в круглодонном сосуде на водоструйном насосе (давление 50 мм рт.ст.) и оставляют при комнатной температуре до окончания реакции (1,0-1,5 ч). Об окончании реакции свидетельствует образование бесцветного геля. Полученный гель извлекают из сосуда, измельчают и промывают 10-кратным избытком дистиллированной воды. Степень набухания полученного гидрогеля в воде равна 18,1 г воды/г сухого полимера.

[23]

Примеры 2-4. Процесс проводят по примеру 1, используя различные количества N-(2-D-глюкоз)акриламида, акриламида, N,N-метиленбисакриламида, конканавалина А и меркаптоуксусной кислоты (таблица 1).

[24]

Пример 5к (контрольный) проводят по способу-прототипу без использования меркаптоуксусной кислоты.

[25]

[26]

Пример 6. Проницаемость гидрогелей для молекул белков различной молекулярной массы оценивают путем выдерживания гидрогелей с раствором белка при 4°С в течение 24 ч и измерением концентрации белка в растворе спектрофотометрически при 280 им. Учитывая соотношение объемов гидрогелей и растворов, рассчитывают количество пор, доступных для каждого белка, принимая за 100% количество пор, доступных для воды. В качестве белка используют инсулин (М=6.5×103), овомукоид (М=31×103), сывороточный альбумин (М=67×103), гексокиназу (М=96×103) и алкогольдегидрогеназу (М=14×104).

[27]

Результаты приведены в таблице 2.

[28]

[29]

Видно, что гидрогели, полученные по заявленному способу, отличаются от известных глюкозочувствительных гидрогелей повышенным (в среднем на 25%) содержанием пор небольших размеров, недоступных для белков с молекулярной массой выше 140000.

[30]

Пример 7. Насыщение гидрогелей инсулином проводят путем инкубирования лиофильно высушенных гидрогелей с раствором инсулина (25 ЕД/мл) до равновесного набухания. Набухшие гидрогели, содержащие 130 ЕД инсулина помещают в проточную кювету объемом 15 мл, через которую со скоростью 3.0 мл/мин прокачивают физиологический раствор (0.9% раствора хлорида натрия), содержащий 250 мг глюкозы на 100 мл, и измеряют количество выделившегося из гидрогеля инсулина. Концентрацию инсулина в растворе определяли спектрофотометрическим при 280 нм. Скорость выделения инсулина (ЕД/мин) приведена в таблице 3.

[31]

[32]

Видно, что выделение инсулина в раствор глюкозы из гидрогелей, полученных по заявленному способу, происходит двухстадийно. Максимальная скорость достигается к восьмой минуте и составляет 5,6-6,0 ЕД/мин, а затем инсулин накапливается в растворе с равномерно понижающейся скоростью 1,9-0,7 ЕД/мин. Выделение инсулина из гидрогелей, полученных по способу-прототипу, в течение всего времени наблюдения равномерно снижается от 3,0-2,5 ЕД/мин до 1,5-0,6 ЕД/мин.

[33]

Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет получать полимерные гидрогели, способные, в отличие от известных, аналогично поджелудочной железе выделять повышенное количество инсулина на начальной стадии появления глюкозы.

[34]

Предельные количества веществ, используемых при получении полимерного гидрогеля, определяются следующим. При концентрации N-(2-D-глюкоз)акриламида ниже 0,15% мас. и концентрации конканавалина А ниже 0,05% мас. полимерные гидрогели практически не изменяют степень набухания при увеличении концентрации глюкозы, а при концентрации N-(2-D-глюкоз)акриламида выше 5,0% мас. и концентрации конканавалина А выше 0,15% мас. увеличение степени набухания гидрогелей происходит при чрезвычайно высокой концентрации глюкозы, порядка 600 мг/100 мл. При концентрации N,N-метиленбисакриламида ниже 0,01% мас. образуются гидрогели с чрезвычайно низкой механической прочностью, а при концентрации N,N-метиленбисакриламида выше 0,06% мас. образуются жесткие гидрогели, диффузия инсулина из которых чрезвычайно затруднена. Меркаптоуксусная кислота в количестве ниже 0,03 мас. % не способна изменять характер распределения пор в гидрогеле, в при концентрации выше 0,10 мас. % она ингибирует полимеризацию.

Как компенсировать расходы
на инновационную разработку
Похожие патенты