патент
№ RU 2640927
МПК G01N33/24

Способ пробоподготовки образцов почвы для определения цист лямблий и ооцист криптоспоридий

Авторы:
Рахманин Юрий Анатольевич Асланова Мария Михайловна Кузнецова Камаля Юнис кызы
Все (15)
Номер заявки
2016148897
Дата подачи заявки
13.12.2016
Опубликовано
12.01.2018
Страна
RU
Дата приоритета
24.06.2024
Номер приоритета
Страна приоритета
Как управлять
интеллектуальной собственностью
Иллюстрации 
1
Реферат

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для пробоподготовки почвы для определения цист лямблий и ооцист криптоспоридий. Для этого проводят отбор проб и поэтапные исследования. При исследовании в отобранный объем пробы почвы добавляют дистиллированную воду. Взвесь перемешивают и отстаивают в течение экспериментально установленного времени 20 мин или центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость из пробирок удаляют. Полученный осадок исследуют адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением. При этом количество исследований рассчитывают по количеству полученных осадков. Надосадочную жидкость 25 мл размещаются в 3 пробирки, после центрифугирования которых образуются 3 пробы осадка, по расчету 1 осадок на 1 исследование. Если суммарный объем осадков в пробирках составляет не более 1,0 мл, их объединяют в одно исследование, после чего проводят определение цист лямблий и ооцист криптоспоридий адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением. Результат учитывают исходя из того, что цисты лямблий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от округлых до овальных, от 8 до 14 мкм в длину, от 7 до 10 мкм в ширину, с ярко подсвеченными краями. Ооцисты криптоспоридий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты от овальных до сферических от 3 до 5 мкм в диаметре, с ярко подсвеченными краями. Изобретение обеспечивает повышение эффективности определения лямблий и ооцист криптоспоридий в почве в целях своевременной профилактики, выявлении паразитарного загрязнения. 2 табл., 1 ил., 2 пр.

Формула изобретения

Способ пробоподготовки почвы для определения цист лямблий и ооцист криптоспоридий с использованием адаптивного метода иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением, включающий отбор проб и поэтапные исследования, отличающийся тем, что при исследовании в отобранный объем пробы почвы добавляют дистиллированную воду, после чего взвесь перемешивают и отстаивают в течение экспериментально установленного времени 20 мин или центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость из пробирок удаляют, полученный осадок исследуют адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением, при этом количество исследований рассчитывают по количеству полученных осадков таким образом, что в 25 мл надосадочной жидкости размещаются в 3 пробирки, после центрифугирования которых образуются 3 пробы осадка, по расчету 1 осадок на 1 исследование, при этом, если суммарный объем осадков в пробирках составляет не более 1,0 мл, их объединяют в одно исследование, после чего проводят определение цист лямблий и ооцист криптоспоридий адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением, результат учитывают исходя из того, что цисты лямблий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от округлых до овальных, от 8 до 14 мкм в длину, от 7 до 10 мкм в ширину, с ярко подсвеченными краями, ооцисты криптоспоридий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты от овальных до сферических от 3 до 5 мкм в диаметре, с ярко подсвеченными краями.

Описание

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, более конкретно к работам по санитарной паразитологии по определению паразитологических агентов в почве с разработанной пробоподготовкой проб к проведению исследований адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением.

До настоящего времени в санитарной паразитологии определение паразитологических агентов в почве проводят с 1992 года классическим методом Падченко, включающим отбор проб и многоэтапные исследования проб почвы (Методические указания МУК 4.2.2661-10).

Этот метод является многоэтапным и трудновоспроизводимым методом исследования, в котором не определены количества исследований образовавшихся в ходе пробоподготовки больших остатков осадков. Пересчет результата исследования 1 мл осадка на весь объем надосадочной жидкости или объединенной пробы почвы, по методу не уточнен, что заведомо снижает значимость гигиенического заключения на образец. Не проведена стандартизация количества исследований промывных вод и надосадочной жидкости из одной пробы, а отстаивание конечной взвеси свыше 24 часов для проведения паразитологического исследования не позволяет интенсифицировать этап пробоподготовки.

Достигаемым при использовании предлагаемого изобретения техническим результатом является повышение эффективности определения цист лямблий и ооцист криптоспоридий в почве, сокращении времени пробоподготовки от 40 до 45 минут и сокращении потери патогенов на этапах исследования за счет сокращения множественных ее промываний.

Технический результат достигается тем, что в способе пробоподготовки почвы для проведения определения цист лямблий и ооцист криптоспоридий, включающий отбор проб и поэтапные исследования, при исследовании в отобранный объем пробы почвы добавляют дистиллированную воду, после чего взвесь перемешивают и отстаивают в течение экспериментально установленного времени 20 мин или центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют 3 мин при 1500 об/мин, надосадочную жидкость из пробирок удаляют, полученный осадок исследуют адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением, при этом количество исследований рассчитывают по количеству полученных осадков таким образом, что в 25 мл надосадочной жидкости размещаются в 3 пробирки, после центрифугирования которых образуются 3 пробы осадка, по расчету 1 осадок на 1 исследование, после объединения которых проводят определение цист лямблий и ооцист криптоспоридий адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением, результат учитывают исходя из того, что цисты лямблий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от округлых до овальных, от 8 до 14 мкм в длину, от 7 до 10 мкм в ширину, с ярко подсвеченными краями, ооцисты криптоспоридий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты от овальных до сферических от 3 до 5 мкм в диаметре, с ярко подсвеченными краями.

Разработанный способ пробоподготовки проб почвы для исследования адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением основан на принципе замачивания проб почвы в воде и последующим исследованием осадка надосадочной жидкости после 20 мин отстаивания взвеси без промывки.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

Отобранную пробу почвы, отбираемую установленным нормируемым объемом 25 г, помещают в фаянсовую ступку и добавляют небольшое количество дистиллированной воды, затем растирают до образования гомогенной кашицы. Образовавшуюся смесь переносят в чистый стакан, заливают дистиллированной водой в соотношении 1 к 2. Взвесь перемешивают и отстаивают в течение стандартизованного времени 20 мин или центрифугируют при стандартных параметрах в течение 3 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость переливают в центрифужные пробирки и центрифугируют при стандартных параметрах 3 мин при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость из пробирок удаляют. Полученный осадок 1.0 мл исследуют адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением.

Количество исследований рассчитывают по количеству полученных осадков, таким образом, что в 25 мл надосадочной жидкости размещаются в 3 пробирки, после центрифугирования которых образуются 3 пробы осадка. По расчету 1 осадок -1 исследование. Если суммарный объем осадков в пробирках составляет не более 1.0 мл, их можно объединить в одно исследование. Результат учитывают исходя из того, что цисты лямблий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты, от округлых до овальных, от 8 до 14 мкм в длину, от 7 до 10 мкм в ширину, с ярко подсвеченными краями, ооцисты криптоспоридий представляют собой сверкающие и флюоресцирующие яблочно-зеленым светом объекты от овальных до сферических от 3 до 5 мкм в диаметре, с ярко подсвеченными краями.

Предлагаемый способ поясняется примерами.

Пример 1. Классическим методом исследования проб почвы является метод Падченко, основанный на разности удельного веса воды и цист патогенных простейших при отстаивании взвеси в больших объемах воды с последующим исследованием надосадочной жидкости. По методу Падченко анализ проводят в течение первых 2-3 суток после получения пробы и экспозиции водной взвеси, полученной 3-кратной промывкой пробы, в течение 24 ч, при этом эффективность метода выявляемости цист лямблий составляет не более 15-19%, ооцист криптоспоридий не выявляется. Этот метод является единственным унифицированным методом определения загрязненности почвы патогенными кишечными возбудителями и был принят в настоящей работе для сравнительной оценки эффективности способ пробоподготовки почвы с адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением. Для проведения исследований почвы адаптированным метод иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением разработана методика пробоподготовки (Таблица 1), которая позволяет проводить исследования в день доставки проб в лабораторию; не проводится экспозиция смеси проб почвы в течение 24 ч; не проводится дополнительная промывка смеси, что сокращает время пробоподготовки и сохраняет возможные потери патогенов, при этом эффективность адаптированного метода иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением с пробоподготовкой почвы составляет 85-90% по определению цист лямблий и ооцист криптоспоридий (потери патогена за счет их адгезии с почвенными частицами).

Пример 2. Для определения специфичности адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением со способом пробоподготовки почвы использовали экспериментальные модели с искусственным заражением натурного материала почвы. Эффективность исследований способа пробоподготовки почвы адаптированным методом иммуномагнитной сепарации с последующим иммунофлуоресцентным мечением в экспериментальной серии составила 100.0% по определению цист лямблий и 100.0% по определению ооцист криптоспоридий, в отличие от метода Падченко, эффективность которого составила 55.0% для цист лямблий, 0% - для ооцист криптоспоридий (Таблица 2).

Как компенсировать расходы
на инновационную разработку
Похожие патенты