патент
№ RU 2696036
МПК C12N1/15

ШТАММ ГРИБА PENICILLIUM VERRUCULOSUM ЕЕ-105 ПРОДУЦЕНТ КОМПЛЕКСА ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ ЭНДОГЛЮКАНАЗ И ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ НА ЕГО ОСНОВЕ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ В ЗЕРНОВЫХ КОРМАХ

Авторы:
Синицын Аркадий Пантелеймонович Короткова Ольга Генриховна Зоров Иван Никитич
Все (24)
Номер заявки
2018124491
Дата подачи заявки
04.07.2018
Опубликовано
30.07.2019
Страна
RU
Дата приоритета
16.04.2024
Номер приоритета
Страна приоритета
Как управлять
интеллектуальной собственностью
Иллюстрации 
2
Реферат

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Предложен рекомбинантный штамм мицелиального гриба Penicillium verruculosum EЕ-105, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ F-4812D, продуцент эндо1,4-β-глюканазы II Penicillium verruculosum и эндо1,4-β-глюканазы I Trichoderma reesei. Предложен способ получения кормового ферментного препарата с повышенным содержанием эндо1,4-β-глюканазы II Penicillium verruculosum и эндо1,4-β-глюканазы I Trichoderma reesei с использованием указанного штамма. Группа изобретений позволяет получать комплексный ферментный препарат, который может быть использован в кормопроизводстве в качестве кормовой добавки для улучшения усвояемости питательных веществ и облегчения переваривания за счет снижения вязкости кормов, содержащих зерновые, а также повысить кормовую ценность рационов для сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 4 пр.

Формула изобретения

1. Рекомбинантный штамм мицелиального гриба Penicillium verruculosum EЕ-105, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ F-4812D, продуцент эндо1,4-β-глюканазы II Penicillium verruculosum и эндо1,4-β-глюканазы I Trichoderma reesei.
2. Способ получения кормового ферментного препарата с повышенным содержанием эндо1,4-β-глюканазы II Penicillium verruculosum и эндо1,4-β-глюканазы I Trichoderma reesei путём глубинного культивирования штамма мицелиального гриба Penicillium verruculosum EE-105 по п.1, на питательной среде в ферментёрах с последующим отделением биомассы гриба, ультрафильтрацией культуральной жидкости и последующего высушивания с помощью распылительной сушилки.

Описание

Изобретение относится к области сельскохозяйственной биотехнологии, а именно, к созданию и производству комплексных высокоэффективных ферментных препаратов (ФП), содержащих высокоактивные термостабильные ферменты. Изобретение может быть использовано в кормовой отрасли в качестве добавки к кормам сельскохозяйственных животных и птицы, например, свиней или кур-бройлеров, ведущей к уменьшению негативного воздействия некрахмальных полисахаридов (НПС) на переваривание зерновых кормов.

Зерновые корма характеризуются наличием НПС, таких как целлюлоза, β-глюканы и ксиланы – их содержание варьирует от 7-10 % в пшенице до 17 % в ячмене. НПС не перевариваются в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) моногастричных животных и птицы, в связи с тем, что животные не вырабатывают соответствующие ферменты. НПС ухудшают переваривание основных питательных веществ, поскольку повышают вязкость химуса, замедляют транзит корма в пищеварительном тракте и снижают всасывание продуктов пищеварения [Jacob J.P., Pescatore A.J. // Annals of Translational Medicine, 2014, Vol.2, No.2. doi: 10.3978/j.issn.2305-5839.2014.01.02.]. Кроме того, непереваренные остатки корма, перемещаясь в нижний отдел кишечника, обеспечивают размножение патогенной и условно патогенной микрофлоры, ухудшая состояние животного или птицы и, соответственно, продуктивность.

Основным способом уменьшения негативного влияния НПС кормов является использование ферментов, которые будучи включёнными в состав корма дополняют ферментную систему птицы, обеспечивают переваривание НПС и в результате способствуют улучшению использования питательных веществ рациона, а также улучшают здоровье сельскохозяйственных животных и птицы. Экономические преимущества использования ФП в качестве кормовых добавок заключается в увеличении доступности питательных веществ корма, что приводит к снижению его расхода на производство единицы продукции. Другая позитивная сторона применения кормовых ФП заключается в возможности использования более дешевых видов растительного сырья в качестве основы корма.

Эффективность действия кормовых ФП определяется уровнем их биокаталитической активности, соотношением компонентов в составе ферментных комплексов, а также специфичностью и свойствами индивидуальных ферментов. Определяющим фактором среди свойств индивидуальных ферментов является устойчивость к действию высокой температуры. На сегодняшний день практически на всех кормопроизводствах существует стадия краткосрочной высокотемпературной обработки кормов (80-90°С, при гранулировании кормов), которая частично или полностью способна инактивировать ферменты. Поэтому создание новых кормовых ФП, сохраняющих активность в условиях краткосрочного термического воздействия («термошока»), является важной прикладной задачей.

Одними из ключевых ферментов, используемых в качестве кормовой добавки для расщепления НПС, являются β-глюканазы. В качестве промышленно важных продуцентов данных ферментов используются грибы родов Trichoderma и Penicillium. Эндо1,4-β-глюканазы этих продуцентов обладают высокой удельной активностью по отношению к НПС (β-глюкану), что делает их востребованными при кормопроизводстве.

Мицелиальный гриб Penicillium verruculosum PV2007 (ВКМ F-3972D) обладает гидролитическим комплексом внеклеточных ферментов, способным к эффективной биоконверсии растительной биомассы, в том числе антипитательной составляющей кормов. В этот комплекс входят целлобиогидролазы, эндоглюканазы и β-глюкозидаза. На основе реципиентного штамма P.verruculosum 537 (∆niaD) создана экспрессионная система [Патент RU 2378372 С2, опубликовано 10.01.2010, Бюл. №1], что позволяет использовать данный гриб как основу для получения рекомбинантных штаммов – продуцентов ферментов для практического применения в различных областях промышленности и сельского хозяйства [Skomarovsky, A.A., Gusakov, A.V., Okunev, O.N., Solov’eva, I.V., Bubnova, T.V., Kondrat’eva, E.G., Synitsyn, A.P. // Applied Biochemistry and Microbiology. 2005. Vol. 41. P. 182–184; Martins, L.F., Kolling, D., Camassola, M., Dillon, A.J., Ramos, L.P. // Bioresource Technology. 2008. Vol. 99. P. 1417–1424; Gusakov A.V., Sinitsyn A.P. // Biofuels. 2012. Vol. 3(4). P.463-477.].

Ферменты P.verruculosum обладают высокой активностью по отношению к полисахаридным субстратам. В состав ферментного комплекса P.verruculosum входит высокоэффективная эндо-1,4-β-глюканаза II, относящаяся к 5-ой семье гликозид-гидролаз. Эндо-1,4-β-глюканаза II имеет высокую активность и обладает устойчивостью к воздействию высоких температур [Проскурина О.В. с соавт. // Катализ в промышленности. 2013. №5. С.65-73, Мерзлов Д.А. с соавт// Свойства ферментных препаратов и гомогенных ферментов эндоглюканазы EG2 Penicillium verruculosum и эндоглюканазы LAM Myceliophtora thermophile. Биохимия, 2015, том 20, вып.4, С.556-567, Синицын А.П. с соавт //Оптимизация состава целлюлазного ферментного комплекса Penicillium verruculosum: увеличение гидролитической способности с помощью методов генетической инженерии. Кат в пром. 2015, Т. 15, №6, С.78-83].

В комплекс ферментов гриба Trichoderma reesei входит эндо-1,4-β-глюканаза I. Фермент имеет массу 50 кДа и относится в 7-ой семье гликозид-гидролаз (КФ 3.2.1.4). Фермент обладает высокой удельной активностью как по отношению к β-глюкану, так и по отношению к ксилоглюкану, что позволяет расширить спектр зерновых субстратов в основе корма животных.

Таким образом, наличие в составе нового ФП высокоэффективных эндоглюканаз позволит значительно уменьшить степень полимеризации и вязкость НПС, что приведет к улучшению усвояемости животными питательных веществ корма. Также следует отметить, что увеличение экспрессии эндоглюканаз в новом рекомбинантном штамме приведет к снижению вязкости ферментационной среды за счёт деструкции полисахаридов, входящих в её состав, что позволит сделать процесс культивирования штамма более технологичным.

Кроме того, создание нового рекомбинантного штамма P.verruculosum с высоким уровнем экспрессии гомологичной эндо-β-1,4-глюканазы II и гетерологичной эндо-β-1,4-глюканазы I T.reesei увеличит выход целевых ферментов, снизив тем самым стоимость конечного продукта.

Таким образом, разработка новых высокоактивных и стабильных при повышенных температурах ФП для кормопроизводства, которые будут эффективны при кормлении сельскохозяйственных животных и птицы является важной и актуальной задачей современного агропромышленного сектора.

Техническая задача, на решение которой направлено данное изобретение, состоит в получении комплексного ФП на основе нового рекомбинантного штамма P.verruculosum ЕЕ-105, являющегося продуцентом гомологичной эндо-β-1,4-глюканазы II, относящаяся к 5 семье гликозид-гидролаз (КФ 3.2.1.4, мол. масса 39 кДа,) и гетерологичной эндо-β-1,4-глюканазы I T.reesei (КФ 3.2.1.4, мол. масса 50 кДа), относящаяся к 7 семье гликозид-гидролаз для применения в кормопроизводстве в качестве кормовой добавки для улучшения усвояемости питательных веществ и облегчения переваривания за счет снижения вязкости кормов, содержащих зерновые, в частности, рожь и ячмень.

Технический результат от предлагаемого изобретения состоит в снижении вязкости корма, содержащего НПС злаков и повышении кормовой ценности рационов для сельскохозяйственных моногастричных животных и птицы при обработке корма новым комплексным ФП, содержащим высокоактивные эндо-β-1,4-глюканазу I T.reesei, эндо-β-1,4-глюканазы II P.verruculosum и комплекс сопутствующих карбогидраз.

Сущность изобретения заключается в получении нового штамма-продуцента:

- P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D), который при выращивании на ферментационной среде на основе микрокристаллической целлюлозы (МКЦ), обеспечивает получение ФП комплексного действия, включающего высокоактивные гомологичную эндо-β-1,4-глюканазу II и гетерологичную эндо-β-1,4-глюканазу I T.reesei, и комплекс сопутствующих карбогидраз P.verruculosum. Общая активность культуральной жидкости (КЖ) по окончании ферментации в лабораторных ферментаторах составляет 1800-2000 ед/мл по Na-соли карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ, рН 5,0, 50°С). Комплекс сопутствующих карбогидраз представлен целлобиогидролазой I, целлобиогидролазой II и β-глюкозидазой.

Способ получения ФП предусматривает глубинное культивирование штамма – продуцента P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) на среде, содержащей МКЦ, пшеничные отруби и дрожжевой экстракт с последующей распылительной сушкой КЖ и доведении ферментативной активности препарата до 3200 ед/г по КМЦ путем добавления кукурузной муки. Изобретение позволяет получать ФП с высокой активностью целевых эндо-β-1,4-глюканаз. Полученный ФП характеризуется высокой термостабильностью, эффективностью при обработке кормовых смесей, содержащих ячмень и/или рожь по сравнению с коммерческими ФП. Применение нового комплексного ФП позволит повысить кормовую ценность рационов на основе зерновых культур.

Изобретение реализуется следующим образом.

Штамм P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) получен из исходного штамма P.verruculosum PV2007 (ВКМ F-3972D) путем котрансформации плазмидами pCBHI-EGII_B1 и pCBHI-EGI_Tr с последующей селекцией на агаризованной среде с 10 мМ NaNO3.

Культурально-морфологические и микроскопические особенности штамма P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D):

Растет на агаризованных средах (среда Чапека с дрожжевым автолизатом, Мальц-агар, глюкозо-картофельный агар, сусло-агар) при t 26-30°С в течение 7-10 суток, рН 4.5-5.0.

На среде Чапека с дрожжевым экстрактом при культивировании гриба при 25°С на 7 сутки колонии достигают 24-30 мм в диаметре, складчатые, поверхность сильно радиально складчатая, плотная, тонкая, ростовая зона врастает в агар, имеет ширину 1.5-2.0 мм. Мицелий светло-желтоватый, шерстистый, центр колонии выпуклый, конидиогенез слабый, серо-зеленоватого оттенка. Экссудата и растворимого пигмента нет. Обратная сторона светлая, в центре колонии – палево-оранжевая. При температуре 37°С колонии диаметром 5 мм, мицелий светлый, конидиообразования нет. При температуре 5°С роста нет.

При росте на Мальц-агаре диаметр колонии 23-24 мм, поверхность сильно радиально складчатая, плотная, тонкая, ростовая зона врастает в агар, шириной 1,5-2,0 мм. Мицелий белый, шерстистый, прижатый, конидиогенез очень слабый, практически отсутствует. Экссудата и растворимого пигмента нет. Обратная сторона светлая.

При микроскопировании штамм имеет конидиеносцы двухярусные, терминальные, бивертициллятные, гладкие длиной около 150 мкм, шириной 2-3мкм. Метулы расходящиеся размером 10-13 х2,5-3,0 мкм, фиалиды ампуллиформные размером 7-8 х 2,8-3,0 мкм. Конидии округлые, шероховатые размером 3,0-3,5 мкм.

При культивировании в глубинных условиях с использованием растворимых субстратов (глюкоза, фруктоза, лактоза) образуется рыхлый разветвленный мицелий со слабой пеллетизацией, удельная начальная скорость роста мицелия составляла 0,35 ч–1, в конце культивирования 0,1 ч-1.

Физиолого-биохимические признаки штамма:

Мезофилен. Оптимальная температура роста мицелия 32°С (29-34°С), оптимум для образования целлюлаз 28°С (26-29°С). Оптимальные значения рН роста и секреции целлюлаз 3,5-5,0. Рост мицелия наблюдается и при рН 2,5, но при этом наблюдается очень слабое образование целлюлаз и других карбогидраз.

Резистентность к нистатину хорошая. При поверхностном культивировании устойчив к концентрации до 0,5 мкг/мл, при концентрации 2,5 мкг/мл рост подавляется. При добавлении в среду дигитонина (3,5-4,0 мкг/мл) или бенгальского розового (30-50 мкг/мл) размер колоний уменьшается.

Является прототрофом. Способен быстро ассимилировать глюкозу, глицерин, галактозу, D-маннозу, D-маннит, трегалозу, сорбозу и сорбит, медленнее - D-ксилозу, L- и D-арабинозу, L-рамнозу и рибозу. Слабо ассимилирует: D-глюкозамин, дезоксирибозу, дезоксигалактозу, 2-дезокси-D-глюкозу и 5-тио-D-глюкозу.

Использует неорганический и органический азот, хорошо ассимилирует нитратную и аммонийную формы азота.

Образует ферментные системы, позволяющие расти на соответствующих комплексных субстратах: целлюлозе, крахмале, ксилане, β-глюкане.

Штамм P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) отличается от исходного повышенной продукцией высокоактивных гомологичной эндо-β-1,4-глюканазы II и гетерологичной эндо-β-1,4-глюканазы I T.reesei, в связи с этим увеличением общей активности по КМЦ в 5 раз и значительным снижением вязкости биомассы во время ферментации – в 6 раз по сравнению с исходным штаммом.

В предлагаемом изобретении метод определения β-глюканазной, КМЦ-азной и ксиланазной активностей основан на измерении скорости образования восстанавливающих сахаров (ВС) методом Шомоди-Нельсона при гидролизе полисахаридных субстратов (β-глюкана ячменя, КМЦ и ксилана из древесины березы, соответственно). За единицу активности принимается такое количество фермента, которое приводит к образованию 1 мкмоль ВС в минуту при рН 5,0 и 50ºC [Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.А. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов. – М.: МГУ, 1995. – 144 с]. β-Глюкозидазную активность определяли по скорости образования п-нитрофенола при гидролизе пНФГ, за единицу активности принимали количество фермента, необходимое для образования 1 мкмоль п-нитрофенола в течение 1 минуты при рН 5,0 и 40°C [Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. // Итоги науки и техники, сер. Биотехнология. – М.: ВИНИТИ, 1993. Т. 25, С. 30-37].

Новый комплексный ФП обладает улучшенными эксплуатационными характеристиками, включая высокую эндо-β-1,4-глюканазную активность, увеличенную термостабильность эндо-β-1,4-глюканаз. Это является преимуществом данного ФП в сравнении с имеющимися на рынке коммерческими аналогами. Кроме того, штамм-продуцент P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) имеет улучшенные эксплуатационные характеристики за счет снижения вязкости ферментационной среды при его культивировании.

Комплексный ФП высокоактивных гомологичной эндо-β-1,4-глюканазы II и гетерологичной эндо-β-1,4-глюканазы I будет иметь высокую рентабельность его применения в кормопроизводстве за счет обеспечения высоких целевых активностей, и устойчивости ферментной системы к действию повышенных температур, необходимых условий при подготовке кормов к скармливанию и обеспечению условий для гидролиза НПС зерновой составляющей рациона корма с/х животных и птиц.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ними.

Пример 1. Получение рекомбинантного штамма P.verruculosum EE-105 (ВКМ F-4812D).

Плазмида pCBHI-EGII, полученная ранее в [Патент РФ 2532840 С2, 10.01.2010, Бюл. №31] и плазмида pCBHI-EGI_Tr, полученная ранее в [Осипов Д.О., Получение и характеристика мультиферментных комплексов карбогидраз и исследование их эффективности при осахаривании различных видов целлюлозосодержащих материалов. Диссертация на соискание ученой степени канд. хим. наук. М., МГУ, 2011, 147 c.] были одновременно трансформированы в реципиентный штамм P.verruculosum 537 (ΔniaD) совместно с трансформирующей плазмидой pSTA10 в соотношении 3:3:1 (мкг каждой ДНК) по стандартной методике [Sambrook, J., and Russell, D.W. (2001) Molecular cloning:a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.; A.Y. Aleksenko, N.A. Makarova, I.V. Nikolaev, A.J. Clutterbuck, Integrative and replicative transformation of Penicillium canescens with a heterologous nitrate-reductase gene, Curr. Genet. 28 (1995) 474-478]. В результате трансформации было получено более 150 рекомбинантных штаммов серии P.verruculosum EЕ, из которых в результате первичного скрининга при культивировании в качалочных колбах на стандартной среде культивирования были отобраны 10 клонов, общие ферментативные активности которых представлены в Таблице 1. Стандартная среда культивирования имела следующий состав (г/л): KH2PO4- 15, (NH4)2SO4- 5, MgSO4×7H2O- 0,3, CaCl2×2H2O- 0,3, дрожжевой экстракт- 10, МКЦ- 40, пшеничные отруби-10.

Анализ общих активностей в КЖ 10-ти рекомбинантных штаммов серии ЕЕ показал наличие клонов с различными комбинациями активностей, что позволило отобрать один штамм для дальнейших прикладных испытаний – P.verruculosum EЕ-105, который отличался наибольшей КМЦ-азной активностью по сравнению с исходным штаммом и другими рекомбинантными штаммами.

Пример 2. Культивирование штамма P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D).

Культивирование штамма P.verruculosum ЕЕ-105 проводили в ферментере объемом 3 л, оснащенном барботером для подачи воздуха в аппарат и турбинной мешалкой на среде 1 следующего состава:

Среда 1 (г/л):

Глюкоза – 40
МКЦ – 40
Дрожжевой экстракт– 10
Пшеничные отруби – 10
KH2PO4– 15
(NH4)2SO4– 5
CaCl2– 0,3
MgSO4*7H2O – 0,3

Культивирование проводили 144 ч, при рН не ниже 4,5 и 32оС. Образцы КЖ отбирали каждые сутки, начиная с 72 ч культивирования, центрифугировали и измеряли КМЦ-азную активность.

С началом биосинтеза эндоглюканаз (чему соответствует увеличение КМЦ-азной активности в КЖ) значительно снижается вязкость ферментационной среды (фиг.1). Это означает, что присутствующие в среде полисахаридные субстраты разрушаются под действием эндоглюканаз, тем самым снижая степень полимеризации субстрата и, как следствие, уменьшая вязкость среды. Это облегчает процесс перемешивания биомассы при культивировании рекомбинантного штамма P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D), снижая при этом энергозатраты.

По окончании ферментации грибную биомассу удаляют путём центрифугирования (4000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге Avanti JXN-26, «Beckman coulter», США), свободную от клеток КЖ концентрируют с помощью ультрафильтрации (с пределом отсечения 10 кДа), ультраконцентрат сушат на распылительной сушилке (Buchi MiniSpray Dryer B-290, условия: Твх=135оС, Твых=55-65оС, степень аспирации- 70%, скорость потока 0,5 л КЖ в час ) с получением сухого ФП, который представляет собой желто-коричневый легко растворимый в водной среде порошок.

Таким образом, получают сухой ФП EЕ-105 c ферментативными активностями по КМЦ – 46000 ед/г, по МКЦ – 90 ед/г, по ксилану березы- 5600 ед/г ФП и по п-НФ-β-глюкопиранозиду – 300 ед/г.

Компонентный состав ФП ЕЕ-105 определялся денситометрическим методом по интенсивности полос с помощью программы LabWork 4.6 (Media Cybernetic Links, CША). Результаты определения находятся в Таблице 2. Данные из Табл.2 свидетельствуют о значительном увеличении содержания эндоглюканаз в ФП ЕЕ-105 по сравнению с содержанием аналогичных ферментов в ФП из исходного штамма.

Далее, сухой препарат ФП ЕЕ-105 был разбавлен кукурузной мукой до 3400 Ед/ по КМЦ –и 400 Ед/г по ксилану. Разбавленная форма сухого ФП ЕЕ-105 являлась конечной формой.

Пример 3. Исследовали термостабильность ФП на основе штамма P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) в условиях «термошока» при 80ºС (фиг.2). Проводили сравнение термостабильности нового ФП ЕЕ-105 на основе штамма по отношению к ФП на основе исходного штамма P.verruculosum 537 и к коммерческому ФП Ронозим VP – продуценту эндоглюканаз. Для этого аликвоту раствора препарата добавляли в пробирку с предварительно разогретым до 80ºС 0,1 М ацетатным буфером (рН 5,0), тщательно перемешивали. Через определенные промежутки времени отбирали пробы для измерения КМЦ-азной активности.

Новый ФП ЕЕ-105 сохранял более 80% КМЦ-азной активности в течение трех минут инкубации при 800С, контрольный ФП на основе исходного штамма сохранял около 40% КМЦ-азной активности, а Ронозим VP – 55%. Более 50% КМЦ-азной активности сохранял новый ФП ЕЕ-105 в течение 10 минут инкубации при 800С. Это на 30% больше по сравнению с коммерческим ФП Ронозим VP и на более, чем 40% – по сравнению с ФП на основе исходного штамма, соответственно.

Пример 4. Определение эффективности ФП, полученного на основе штамма P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) при откорме поросят.

Определение эффективности использования нового ФП ЕЕ-105 проводили в условиях вивария на помесных поросятах мясных пород, боровках (♂ датский йоркшир ×♀ датский ландрас) с живой массой 12-13 кг. Были сформированы три группы свиней по 10 голов в возрасте 45-47 суток с начальной живой массой – 15-16 кг. Эксперимент был разделен на этапы: доращивания до достижения живой массы поросят до 24-25 кг и выращивания до 47-50 кг каждому, из которых соответствовали разные по составу и питательной ценности комбикорма. Кормление свиней проводили 2 раза в сутки (9.00 и 16.00) на протяжении всего опыта с повышением на 5% от нормы «Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных. 2003». Доступ животных к воде свободный.

Поросята контрольной группы получали полнорационные комбикорма (ОР) в рассыпчатом виде. В состав премиксов ФП не вводили (Табл. 3).

Поросятам второй опытной группы дополнительно к (ОР) вводили ФП ЕЕ-105, полученный Примеру 2, в количестве 75 г/т корма, и третьей группе – в количестве 100 г на тонну корма.

ФП в рационы опытных групп вносили следующим образом. Комбикорма (в рассыпной форме) взвешивали в количестве 100 кг, отбирали из него 5 кг корма, помешивали в ёмкости на 10-15 литров и добавляли ФП в соответствии с их дозировкой, используемой в опыте, далее добавляли еще 5 кг корма и их снова перемешивали. В последующем полученную смесь добавляли к корму и перемешивали на смесителе минизавод «Прок» в течение 5-6 мин.

Во время опыта ежедневно проводили учет потребления комбикормов, расход на единицу прироста и его химический состав. В целях характеристики интенсивности роста и развития подопытных животных проводили взвешивание поросят в начале опыта, до достижения живой массы 24-25 кг, в возрасте 70 суток (перед началом балансового опыта) и в конце периода дорашивания.

Для определения переваримости питательных веществ корма и эффективности его использования свиньями провели два балансовых опыта в возрасте 70-76 и 76-81 суточного возраста по 3 животных с аналогичной живой массой из каждой группы. Поросята контрольной и опытных групп получали 1,5 кг комбикорма. Животные в период балансовых опытов находились в индивидуальных клетках, оборудованных кормушками для корма и воды, а также приспособлениями для сбора мочи и кала.

В ходе опыта проведен анализ кормов и кала на содержание сухого вещества, сырого протеина, жира, сырой клетчатки, сырой золы, БЭВ расчетным методом, крахмала, НПС, кальция и фосфора по общепринятым методам, азота по Къельдалю на приборе Къельтек. Валовую энергию в корме, кале и моче определяли в калориметрической бомбе.

В конце периода доращивания провели убой по 3 головы с характерной живой массой в опыте из каждой группы. При оценке качества туш и мяса были определены следующие показатели: убойный выход, морфологический состав, площадь «мышечного глазка», толщина шпика на уровне 6-7 позвонка спины данных животных.

Результаты экспериментов были обработаны методом регрессионного и корреляционного анализа и вариационной статистики (Плохинский Н.А., 1980). Для выявления статистически значимых различий использован критерий Стьюдента-Фишера по Н.А. Плохинскому (1980).

Показатели эффективности роста поросят при содержании их на рационах с экспериментальным ФП свидетельствуют о том, что добавка его в состав комбикорма оказывала положительное влияние на приросты живой массы, эффективность использования и усвоение питательных веществ корма и на конверсию корма.

Отмечено, что скармливание комбикорма с дополнительным включением ФП на основе штамма P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) в дозе 100 г на тонну корма оказалось более эффективным по сравнению с вводом 75 г на тонну. Установлено, что у животных третьей опытной группы среднесуточные приросты живой массы, в первый период выращивания, были выше на 20% и расход корма на единицу продукцию меньше на 6,1% по сравнению с аналогами контрольной группы табл.3.

За весь период доращивания у животных третьей опытной группы живая масса составляла 50,05±2,75 кг, а в контрольной – 47,80±1,59 кг (это на 7,7% выше по сравнению с контролем). Среднесуточные приросты у поросят третьей опытной и контрольной группы были на уровне 513±31 и 477±17г, или на 7,5% выше (Р<0,05). При этом затраты корма на 1 кг прироста у поросят этих групп были на 5,0% ниже по сравнению с контрольной группой. Поросята этой группы меньше затрачивали сырого протеина и обменной энергии на приросты живой массы на 7,8 и 8,7% по сравнению контрольной. Поросята этой группы потребляли на 2,3 кг больше по сравнению с контрольной группой.

Исследования показали, что при вводе в комбикорма свиней ФП на основе штамма P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) в количестве 100 г на тонну произошло улучшение переваримости питательных веществ. Так, поросята третьей группы, лучше переваривали сухое вещество – на 1,31 абс. %, органическое вещество – на 1,3, сырой протеин – на 5,43, сырой жир – на 2,08, клетчатку – на 4,73, БЭВ – на 1,44, валовую энергию – на 1,63, крахмал – на 1,11, некрахмалистые полисахариды – на 2,55 абс. % по сравнению с контрольными животными. Добавка этого ферментного препарата в рационы поросят способствует лучшему усвоению кальция и фосфора.

Таким образом, включение в состав комбикормов для растущих свиней ферментного на основе штамма P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) активностью целлюлазы 3400 Ед/г и ксиланазы 400 Ед/г в количестве 100 г на тонну, способствует повышению среднесуточных приростов, снижает расход корма на единицу прироста, улучшает переваримость и усвояемость питательных веществ корма по сравнению с поросятами, получавшими стандартные комбикорма, что говорит о потенциальной эффективности применения нового ферментного препарата в рационах кормления с/х животных.

Таблица 1- Ферментативная активность по отношению к различным субстратам и концентрация белка в КЖ полученных рекомбинантных штаммов по сравнению с контрольным образцом при культивировании в колбах (нетрансформированный штамм, Контроль).

№ штаммаКонцентрация белка в колбах, мг/млАктивность по КМЦ, ед/мл,
рН 5,0, 50оС
Активность по ксилану березы, ед/мл,
рН 5,0, 50оС
Активность по п-НФ-β-глюкопиранозиду, ед/мл
рН 5,0, 50оС
86,6±0,2282±8223±766±2,0
496,2±0,19393±12268±833±1,0
666,4±0,19202±6232±739±1,2
845,9±0,18194±6230±738±1,1
1055,7±0,17480±14260±852±1,6
1124,7±0,14221±7220±733±1,0
1294,5±0,14216±6216±762±1,9
1386,6±0,2199±6225±759±1,8
1406,2±0,19215±6227±762±1,9
1444,9±0,15223±7190±636±1,1
Контроль6,2±0,19105±5225±751±1,5

Таблица 2- Компонентный состав ФП ЕЕ-105 и ФП исходного штамма P.verruculosum 537 (ФПисх), % от общего секретируемого комплекса ферментов

ФерментCостав ФП ЕЕ-105Состав ФПисх
Целлобиогидролаза I и II, 63 и 55 кДа2334
Эндоглюканаза I, 57 кДа45,6нет
Эндоглюканаза II, 39 кДа23,36
β-глюкозидаза, 108 кДа0,61
Другие (в том числе ксиланазы)7,576

Таблица 3- Состав и питательность комбикорма для свиней, %

Компоненты До 25 кг Период выращивания
Ячмень33,6546,9
Пшеница20,020,0
Кукуруза20,010,0
Соя полножирная экструд.8,0-
Шрот соевый8,512,0
Шрот подсолнечный2,06,0
Рыбная мука 3,5-
Масло подсолнечное1,51,7
Поваренная соль0,450,4
Монокальцийфосфат0,50,8
Мука известковая0,91,2
Премикс КС-31,0
КС- 41,0
В 1 кг содержится:
ЭКЕ1,361,33
Обменной энергии, МДж13,6113,28
Сырого протеина, г170,2155,6
Переваримого протеина, г140123,0
Лизина, г1,2611,20
Метионина+цистина, г7,77,15
Треонина, г8,87,90
Триптофан, г2,12,1
Сырой жир, г52,637,2
Сырой клетчатки, г 38,646,4
Соль поваренная, г4,54,0
Кальция, г7,507,94
Фосфор, г5,86,69

Таблица 4- Продуктивность подопытных свиней при использовании в рационах ФП на основе штамма P.verruculosum ЕЕ-105 (ВКМ F-4812D) (n=10, M±m).

ПоказателиГруппа
1-я2-я3-я
Первый период выращивания
Живая масса в начале периода, кг15,8±0,4415,65±0.6515.65±0.67
Живая масса в конце периода, кг24,15±0,6524,45±0,7125,70±0,89
Прирост живой массы, кг8,35± 0,458,80±0,1710,05±0,32*
Среднесуточный прирост, г363±22382±7437±14*
Потреблено корма на 1 гол., кг24,625,027,3
Затрачено на 1 кг прироста: корма, кг2,952,842,77
Второй период выращивания
Живая масса в начале периода, кг24,15±0,6524,45±0,7125,70±0,89
Живая масса в конце периода, кг47,80±1,5948,45±2,2451,05±1,75*
Прирост живой массы, кг23,65±1,1624,0±1,5525,35±1,51
Среднесуточный прирост, г537±31545±35579±36*
Потреблено корма на 1 гол., кг78,078,279,6
Затрачено на 1 кг прироста: корма, кг3,303,263,14
За весь период выращивания
Живая масса в начале периода, кг15,8±0,4415,65±0.6515.65±0.67
Живая масса в конце периода, кг47,80±1,5948,45±2,2451,05±1,75*
Прирост живой массы, кг32,0±1,1832,8±2,6535,4±1,68
Среднесуточный прирост, г477±17489±40528±21*
Потреблено корма на 1 гол., кг102,6103,2104,9
Затрачено на 1 кг прироста: корма, кг3,213,142,96
сырого протеина, г522500481
обменной энергии, МДж42,8442,0139,1

Как компенсировать расходы
на инновационную разработку
Похожие патенты