[2]Изобретение относится к способам получения наночастиц металлов и металлоидов из растворов и может применяться в различных отраслях промышленности (электронной), биотехнологии (биоремедиации), а также для целей фундаментальных научных исследований.
[4]Способность восстанавливать восстановленные соединения селена (селенит, селенат) с образованием элементного селена встречается среди микроорганизмов различных таксономических групп (Stolz et al., 2006). Это может быть как специфическим физиологическим процессом (например, дыханием с использованием оксианионов селена в качестве терминального акцептора электронов (Herbel et al., 2003)), так и неспецифическим процессом (обусловленным, например, сбросом избыточных электронов в процессе аноксигенного фотосинтеза (Moore & Kaplan, 1992)). В любом случае происходит переход токсичных форм селена (селенита и селената) в нетоксичную - элементный селен. Данное явление можно использовать для биоремедиации загрязненных промышленных сточных вод, а также для получения биогенного красного аморфного селена для целей научных исследований (биогенный красный аморфный селен более биодоступен, чем химически полученный (Herbel et al., 2003)).
[5]Из уровня техники известны ряд способов получения наночастиц аморфного элементного селена при помощи гетеротрофных микроорганизмов - бацилл (Bacillus sp., патент CN 102703513), лактобактерий (Pediococcus pentosaceus SP80, патент US 20070077238; Bifidobacterium sp., Lactobacillus sp., Streptococcus sp., патент US 8003071). В общем методы сводятся к культивированию указанных микроорганизмов на жидкой среде, содержащей селенит натрия, и последующей очистке частиц селена от клеток последовательными отмываниями в буферах различной кислотности; замораживанием; высушиванием; осмотическим воздействием; воздействием ультразвуком. Основными недостатками этих методов являются: высокая стоимость (среда для культивирования содержит большое количество дорогих органических субстратов - пептона, дрожжевого экстракта, глюкозы, ацетата); грубое воздействие на частицы селена при очистке, приводящие к потере красным селеном аморфной структуры и переходу в кристаллическую серую форму; неоднородность получаемых частиц по размеру (50-500 нм).
[6]Также известны способы получения наночастиц аморфного элементного селена при помощи фототрофных микроорганизмов - Rhodobacter sphaeroides 2.4.1, 2.4.7, 2.4.9, RS2, RS630, Si4, SWL, WS8, Rhodobacter capsulatus B10 (CA 2127976), Rhodopseudomonas palustris (патент CN 103361380). К недостаткам методов относятся: 1. высокая себестоимость среды культивирования (используются богатые среды Лурия-Бертани, пептонно-дрожжевая, SSM), 2. долгое время культивирования (3-10 суток), 3. неэффективная очистка полученного элементного селена от клеток и клеточных фрагментов.
[7]Наиболее близким к заявляемому является способ получения наночастиц элементного аморфного селена с помощью фототрофных бактерий, описанный в патенте CN 103361380 и выбранный нами в качестве прототипа. Он состоит из следующих стадий.
[8]1. Подготовка инокулята фототрофных бактерий Rhodopseudomonas palustris. Стерильная среда (состав: MgSO4⋅7H2O 100-300 мг, CaCl2⋅2H2O 50-100 мг, EDTA 10-30 мг, дрожжевой экстракт 500-1500 мг, K2HPO4 500-1500 мг, (NH4)2SO4 1000-2000 мг, FeSO4⋅7H2O 5-15 мг, KH2PO4 400-1000 мг, раствор микроэлементов 1-5 мл, деионизованная вода 1000-2000 мл, pH 5-9; раствор микроэлементов: H3BO3 200-300 мг, MnSO4⋅4H2O 150-250 мг, Na2MoO4⋅2H2O 50-100 мг, CuSO4 2-10 мг, ZnSO4⋅7H2O 20-30 мг, деионизованная вода 100-200 мл) инокулируется фототрофными бактериями Rhodopseudomonas palustris. Культура инкубируется в течение 3-10 дней в анаэробных условиях на свету (500-3000 люкс) при температуре 15-40°С.
[9]2. Внесение селенита натрия в культуру анаэробно фототрофно растущих бактерий Rhodopseudomonas palustris из расчета 0.5 мМ/л. Культура инкубируется с селенитом в течение 3-10 дней в анаэробных условиях на свету (500-3000 люкс) при температуре 15-40°С. При этом происходит восстановление селенита до элементного красного аморфного селена, представленного наночастицами размером 60-200 нм.
[10]3. Отделение селена от культуральной среды и бактерий. Культуральная среда, содержащая бактерии и элементный селен, подвергается центрифугированию 10 мин при 3000 g и 4°С. Далее осадок центрифугируется 60 мин. при 18000 g 4°С. Полученный осадок разбавляется 50 мМ TRIS-HCL буфером (pH 7.5), центрифугируется 60 мин при 18000 g три раза.
[11]4. Полученный осадок дважды промывается деионизованной водой и высушивается.
[12]Прототип обладает следующими существенными недостатками: 1. длительное время роста культуры (3-10 суток) и накопления в культуральной среде красного аморфного селена (3-10 суток); 2. получаемые наночастицы селена являются неоднородными по размеру (60-200 нм); 3. метод отделения частиц элементного селена от культуральной среды и бактерий не является эффективным, так как последовательное центрифугирование и разбавление в буфере не позволяет избавиться от значительного количества клеток и клеточных фрагментов, и как следствие, полученные частицы селена не очищены полностью.
[13]Раскрытие изобретения
[14]Техническим результатом, на который направлено изобретение, является ускорение способа получения однородных по размеру наночастиц (280±45 нм) аморфного красного селена, более полная мягкая очистка полученных наночастиц от клеток бактерий и клеточных фрагментов без нарушения аллотропной модификации селена.
[15]Технический результат достигается тем, что способ получения наночастиц элементного аморфного селена включает подготовку инокулята фототрофных бактерий, внесение селенита натрия в культуру фототрофных бактерий, отделение селена от культуральной среды и бактерий первичным центрифугированием, разбавлением осадка и последующим многостадийным центрифугированием, промывку наночастиц селена деионизированной водой, при этом используют фототрофные бактерии Rhodobacter capsulatus В10, осадок разбавляют лизирующим составом и инкубируют с последующим центрифугированием, после чего проводят центрифугирование осадка в градиенте водного раствора сахарозы.
[17]- градиент водного раствора сахарозы формируют из последовательных слоев 80%, 60% и 40% водных растворов сахарозы,
[18]- проводят центрифугирование после промывки наночастиц селена деионизированной водой,
[19]- осадок с лизирующим составом инкубируют в темноте 12-48 часов.
[20]Краткое описание чертежей
[21]На фигуре показаны однородные по размеру наночастицы элементного аморфного селена, полученного с помощью бактерий Rhodobacter capsulatus В10 предложенным способом.
[23]Способ осуществляется следующим образом.
[24]1. Подготовка инокулята фототрофных бактерий. Стерильная среда (состав: Na2SO4 330 мг, MgCl⋅6H2O 330 мг, KCl 330 мг, KH2PO4 330 мг, NH4Cl 330 мг, Na2S2O3 500 мг, CaCl2⋅2H2O 50 мг, дрожжевой экстракт 500 мг, Na ацетат 500 мг, раствор микроэлементов (Pfennig & Lippert, 1966) 1 мл, деионизованная вода 1000 мл, pH 7-7.5) инокулируется фототрофными бактериями Rhodobacter capsulatus В10. Культура инкубируется в течение 24 часов в анаэробных условиях на свету (2000 люкс) при температуре 20-25°С.
[25]2. Вносят селенит натрия в культуру анаэробно фототрофно растущих бактерий Rhodobacter capsulatus В10 из расчета 5 мМ/л. Культуру инкубируют с селенитом в течение 24 часов в анаэробных условиях на свету (2000 люкс) при температуре 20-25°С. При этом происходит восстановление селенита до элементного красного аморфного селена, представленного наночастицами размером 280±45 нм.
[26]3. Отделение селена от культуральной среды и бактерий. Культуральную среду центрифугируют при 8000 g 10 мин. Полученный осадок, состоящий из бактерий и наночастиц селена, разбавляют лизирующим составом для разрушения клеток бактерий (последовательно растворить 0.4 г TRIS и 0.37 г Na2EDTA в 50 мл воды; довести pH раствора до 6.4; растворить 28.7 г гуанидин гидрохлорида; перемешать) в соотношении 1:4, тщательно перемешивают и инкубируют при комнатной температуре 12-48 часов в темноте. Раствор центрифугируют при 5000 g 20 мин. Полученный осадок центрифугируют при 6000 g 30 мин в градиенте сахарозы (в центрифужную пробирку последовательно аккуратно, чтобы не допускать перемешивания, вносились друг на друга 80%, 60%, 40% растворы сахарозы в воде, сверху вносился осадок, содержащий разрушенные клетки и наночастицы селена) для избавления от остаточных клеток и клеточных фрагментов. После центрифугирования наночастицы селена оседают вниз, в слоях сахарозы остаются клетки, клеточные фрагменты и остаточное количество наночастиц селена. Верхние слои сахарозы сливаются.
[27]4. Осажденные наночастицы селена промывают 3 раза деионизированной водой, центрифугируют при 5000 g 15 мин и высушивают для последующего использования.
[28]Предлагаемый способ позволяет получить наночастицы красного аморфного селена в короткие сроки (24 часа вместо нескольких суток, как в аналогичных работах), при этом достигается большая размерная однородность частиц (в среднем размер составляет 280 нм, при этом разброс значений не превышает 45 нм) (см. фигуру), а метод очистки наночастиц позволяет практически полностью избавиться от клеток бактерий и клеточных фрагментов без нарушения аллотропной модификации полученного селена (таблица).
[29]
