для стартапов
и инвесторов
Изобретение относится к биотехнологии, а именно генной инженерии. Предложен штамм дрожжей Hansenula polymorpha - продуцент рекомбинантного белка L1 вируса папилломы человека (HPV) типа 11. Штамм был получен путем введения в геном клетки дрожжей одной копии последовательности ДНК, кодирующей капсидный белок L1 HPV типа 11, под контролем промотора ДАК, и одной копии последовательности ДНК, кодирующей капсидный белок L1 HPV типа 11, под контролем промотора МОХ. Штамм обеспечивает высокий выход рекомбинантного белка L1 HPV, обладающего антигенными и иммуногенными свойствами природного антигена. Изобретение может быть использовано для микробиологического получения рекомбинантного белка L1 HPV типа 11. 2 ил., 1 табл., 9 пр.
Рекомбинантный штамм дрожжей Hansenula polymorpha КБТ17/pPV-112, содержащий интегрированный в геном фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим полипептид L1 HPV типа 11, под контролем промотора гена DAK H. polymorpha (SEQ ID NO: 1) и фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим полипептид L1 HPV типа 11, под контролем промотора гена МОХ H. polymorpha (SEQ ID NO: 2) - продуцент рекомбинантного капсидного белка L1 вируса папилломы человека (HPV) типа 11.
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно генной инженерии, и может быть использовано для создания микробиологического дрожжевого продуцента капсидного белка L1 вируса папилломы человека типа 11. Вирус папилломы человека (HPV - Human Papilloma Virus), поражая эпителиальные клетки, вызывает различные заболевания у человека. На основании отличий в последовательности ДНК выделяют более 200 типов вируса папилломы. По данным ВОЗ более 630 миллионов человек являются носителями папилломавирусной инфекции, из них у 190 миллионов наблюдаются клинические проявления. Вирус папилломы человека типа 16 и 18 вызывает эпителиальную дисплазию слизистой половых органов, именно эти типы вируса папилломы ассоциированы с большей частью преинвазивных и инвазивных карцином аногенитальной сферы (рак шейки матки, влагалища, вульвы и анального канала), из которых рак шейки матки - один из самых распространенных и опасных видов новообразований у женщин. В исследовании, проведенном на территории РФ, показано, что у женщин с высокой степенью плоскоклеточного интраэпителиального поражения и раком шейки матки наряду с HPV типа 16 обнаруживается HPV типа 56, причем в случае мультиинфекции этот тип вируса преобладает (V11 Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010», Сб.трудов п/ред. Академика РАМН В.И. Покровского, т. 3, с. 373-409). Ежегодно раком шейки матки заболевают около 500 тысяч женщин во всем мире, причем более половины этих случаев заканчиваются летальным исходом. Вирус папилломы человека типов 6 и 11 не относятся к онкогенным: папилломавирусная инфекция в этом случае проявляется в виде образования доброкачественных бородавок, незлокачественных кондилом или папиллом на слизистой половых органов или дыхательных путей. В мире ежегодно регистрируется 30 миллионов новых случаев генитальных бородавок, связанных с папилломавирусной инфекцией. Клинические проявления инфекции не обнаруживаются длительное время, в то же время ранняя диагностика папилломавирусной инфекции довольно сложна. Именно поэтому в борьбе с распространением такого тяжелого заболевания предпочтение отдается профилактике папилломавирусной инфекции, в частности, путем индуцирования иммунного ответа у человека при вакцинации. Вирус папилломы относится к семейству паповирусов (Papoviridae), имеет диаметр 40-50 нм. Капсид вируса образован из 72 белковых капсомеров, состоящих из основного белка L1 и минорного белка L2. Геном вируса представлен в виде кольцевой двуцепочечной ДНК, которая содержит 8 ранних генов (Е1-Е7) и два поздних гена, кодирующих белки капсида L1 и L2. Главный белок L1 (55-60 кДа) способен сам собираться в вирусоподобные частицы (VLP - virus-like particle), сходные по строению с вирионами, но не содержащие вирусную ДНК. Белок L1 обладает высокой иммуногенностью и индуцирует образование антител, нейтрализующих инфекционный вирус. В настоящее время рекомбинантные белки L1 HPV представляют собой перспективные иммуногенные компоненты для создания профилактических вакцин, направленных против опасных типов папилломавируса. Затруднения, препятствующие созданию эффективных папилломавирусных вакцин, прежде всего, связаны с разработкой оптимальных экспрессионных систем для продукции рекомбинантных белков HPV, обладающих иммуногенными свойствами природных белков HPV L1. Известно получение белков L1 и L2 HPV типа 16 путем культивирования клеток CV-1 млекопитающих, инфицированных рекомбинантным вектором вируса коровьей оспы [Zhou J et al., Virology v. 185, p. 251-257, 1991]. Известна экспрессия папилломавирусного белка L1, в том числе типов 6 и 11, способного спонтанно собираться в вирусоподобные частицы и обладающего иммуногенностью, в эукариотической системе на основе культивируемых клеток насекомых (бакуловирусная система) [Kirnbauer R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, v. 89, p. 12180-12184, 1992], US 8,062,642, US 9,050,287, US 9,745,351, US 6,165,471. В научной и патентной литературе представлены примеры использования для получения рекомбинантных белков HPV системы экспрессии на основе дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которым отдается предпочтение благодаря международно признанной безопасности дрожжей, способности к наработке больших количеств белка в нативной конформации. Так, в патенте RU 2206608, 2003, C12N 7/00 описывается создание дрожжевого продуцента белка L1 HPV или L2 HPV разных типов, в том числе HPV 6 и 11, на примере Saccharomyces cerevisiae. Клонирование генов L1 и L2 HPV осуществляли с использованием геномной ДНК, экстрагированной из клеток Caski (ATCC № CRL 1550). Конструировали экспрессионный плазмидный дрожжевой вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую соответствующий полипептид, под контролем промотора GAL10 и трансформировали им клетки S. cerevisiae. Способность рекомбинантных клеток S. cerevisiae экспрессировать белки L1 или L2 HPV анализировали иммуноблотингом. Петров Р.М. и др. [WO 2006/065166 A1, 2006] получали капсидные белки L1 вирусных серотипов 16, 18, 31 HPV, вызывающих наиболее агрессивные формы заболеваний у человека, из рекомбинантных штаммов дрожжей. Эти штаммы получали трансформацией дрожжевых клеток S. cerevisiae плазмидами с генами, кодирующими белки L1 указанных серотипов. Фрагменты ДНК, кодирующие эти белки, были выделены из клинического материала. Созданные дрожжевые продуценты при культивировании были способны экспрессировать белки L1 в виде вирусоподобных частиц. Белки L1 использовали для приготовления профилактических и терапевтических вакцин. Известно использование метилотрофных дрожжей Pichia pastoris для получения основного капсидного белка HPV [Bazan S.B. et al., В патенте RU 2445357, 2012 раскрыт рекомбинантный штамм-продуцент капсидного белка L1 HPV типа 16 Ближайшим аналогом является патент US 7,709,010, 04.05.2010, в котором описано создание поливалентной вакцины против папилломавирусной инфекции, включающей VLP L1 разных типов HPV, в том числе и типов 6, 11. VLP получены путем экспрессии капсидного белка L1 в рекомбинантных дрожжевых клетках S.cerevisiae. Выделенные и очищенные VLP адсорбировали на алюминиевом адъюванте и адъюванте ISCOM-типа. Преимущество системы экспрессии на основе дрожжей S.cerevisiae заключается в относительно низкой себестоимости и легкой адаптации к крупномасштабному росту в ферментерах. К недостаткам использования системы экспрессии на основе Saccharomyces cerevisiae можно отнести нестабильность рекомбинантных клеток, связанную с относительно высокой частотой потерь автономной плазмиды при делении клеток. При культивировании штамма в неселективных для плазмиды условиях это приводит к накоплению клеток, не содержащих плазмиды и неспособных к синтезу целевого белка. Это существенно осложняет культивирование рекомбинантного штамма и увеличивает себестоимость целевого продукта. Для индукции экспрессии рекомбинантных белков используется достаточно дорогой реагент - галактоза, что увеличивает себестоимость целевого продукта. Задачей изобретения является создание рекомбинантного штамма дрожжей Задача решена тем, что, согласно изобретению, для получения рекомбинантного штамма-продуцента главного капсидного белка L1 HPV11 в геном реципиентного штамма DLT2 Преимуществом предложенного изобретения также является возможность получения стабильно высокого уровня синтеза целевого белка без нарушения эффективности его укладки. Использование экспрессионных кассет с двумя разными промоторами ( В результате отбора клонов, способных синтезировать белок HPV11-L1, был выделен трансформант, наиболее отвечающий требуемым свойствам. Полученный рекомбинантный штамм позволяет добиваться более высоких уровней синтеза рекомбинантного белка при более простых способах получения культур высокой плотности, а также выделять белок HPV11-L1 в виде VLP с правильной конформацией, обладающий необходимыми антигенными и иммуногенными свойствами, с достаточно высоким выходом. Образование VLP подтверждали с использованием просвечивающей электронной микроскопии. Штамм депонирован 21.11.2017 в коллекции ЗАО НПК «Комбиотех» под номером КБТ-17/pPV-112. Штамм является новым и ни в патентной, ни в научно-технической литературе не описан. Технический результат предложенного изобретения заключается в создании рекомбинантного штамма, способного продуцировать белок L1 HPV типа 11, обладающий улучшенными биологическими свойствами: антигенность, иммуногенность, правильная сборка VLP, а также снижении себестоимости целевого продукта. Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами. В приводимых примерах все генно-инженерные операции производили согласно стандартным методикам и инструкциям компаний производителей ферментов и наборов для манипуляций с ДНК in vitro. Трансформацию клеток Пример 1. Получение плазмидного вектора p11HPV3, содержащего рекомбинантный ген DAK-HPV11-L1 и селективный маркер ген Фрагмент ДНК DAK-HPV11 (SEQ ID NO: 1) и препарат плазмиды AMIpSL1 (Agaphonov et al., 1999, Yeast 15:541-551), содержащей ген Пример 2. Получение плазмидного вектора p11HPV2, содержащего рекомбинантный ген MOX-HPV11-L1 и неполный ген Фрагмент ДНК MOX-HPV11 (SEQ ID NO: 2) и препарат плазмиды pTZ-MOX (Agaphonov et al., 1995, Yeast, 11:1241-1247), содержащей неполный ген Пример 3. Получение штамма Штамм Пример 4. Получение штамма Штамм DLT2/p11HPV2 (пример 3) трансформировали плазмидой p11HPV3, гидролизованной рестриктазой BsrGI. Трансформантов отбирали на среде, содержащей 6.7 г/л смеси солей и витаминов "Yeast Nitrogen Base" (Difco), 20 г/л D-глюкозы и 20 г/л агара. Один из полученных трансформантов был обозначен КБТ17/pPV-112. У этого трансформанта было подтверждено наличие интактного гена MOX-HPV11 (см. пример 5) и интактного гена DAK-HPV11 (см. пример 6). Пример 5. Определение наличия интактного гена МОХ-HPV11 в геноме трансформантов Из анализируемых клонов получали препараты геномной ДНК и использовали в качестве матрицы для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с олигонуклеотидами MOX20 (SEQ ID NO: 3) и MOX3'TRP3 (SEQ ID NO: 4) в качестве праймеров. ПЦР проводили с использованием полимеразы Pfu (Fermentas). При наличии в геноме гена МОХ-HPV11 образовывался продукт ПЦР длиной 1696 п.н. Для подтверждения интактности этого гена, определяли последовательность нуклеотидов полученного продукта ПЦР. Пример 6. Определение наличия интактного гена DAK-HPV11 в геноме трансформантов Из анализируемых клонов получали препараты геномной ДНК и использовали в качестве матрицы для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с олигонуклеотидами dakFw1 (SEQ ID NO: 5) и AMI20 (SEQ ID NO: 6) в качестве праймеров. ПЦР проводили с использованием полимеразы Pfu (Fermentas). При наличии в геноме гена DAK-HPV11 образовывался продукт ПЦР длиной 1718 п.н. Для подтверждения интактности этого гена, определяли последовательность нуклеотидов полученного продукта ПЦР. Пример 7. Культивирование штамма Ферментацию штамма-продуцента дрожжей Пример 8. Выделение и очистка рекомбинантного белка HPV11-L1 из клеток После ферментации штамма-продуцента белок HPV11-L1 (аминокислотная последовательность - SEQ ID NO: 7) выделяли согласно опубликованной методике [Kim H.J. et al., В результате этих операций удается выделить около 15-20% белка L1, присутствующего в клеточном лизате (таблица 1). Выход очищенного HPV11-L1 составлял не менее 50 мг / кг влажной биомассы дрожжей. Таблица 1. Типичный баланс выделения и очистки HPV11-L1. Концентрация общего белка на первых стадиях определялась по Биуретовому методу. На остальных стадиях - по методу Лоури. Содержание и чистота HPV11-L1 определялась при помощи иммуноблотинга и SDS-PAGE электрофореза. Пример 9. Анализ рекомбинантного HPV11-L1. 1) Чистота рекомбинантного целевого белка определяется электрофорезом в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях (SDS-PAGE) путем окрашивания c Coomassie Brilliant Blue R-250 и анализа интенсивности полос отсканированных гелей посредством компьютерной программы NIH Image. Чистота выделенного рекомбинантного белка HPV11-L1 составляет не менее 95% (фиг. 1.А). 2) Иммуноспецифичность рекомбинантного HPV11-L1 определяют методом иммуноблотинга. Первичными антителами к белку HPV11-L1 (cat# CABT-B8787, Creative Diagnostics, USA) окрашивают иммуноблот с последующей визуализацией при помощи специфических антител к иммуноглобулинам мыши, коньюгированными с пероксидазой хрена, по методике улучшенной хемилюминисценции ECL (Amersham, UK). Рекомбинантный антиген HPV11-L1 представлен в виде полосы мономера белка в районе 55 кДа (фиг. 1Б). 3) Образование VLP рекомбинантного белка HPV11-L1 подтверждали методом просвечивающей электронной микроскопии. Представленные образцы были исследованы методом негативного контраста (в качестве контрастера использовали водный раствор фосфорно-вольфрамовой кислотой) с отмывкой дистиллированной водой, в трансмиссионном электронном микроскопе JEOL 100B (Japan) при ускоряющем напряжении 80 kV, съемка производилась при инструментальных увеличениях от 15000 до 59000. Средний размер вирусоподобных частиц составил ~50нм. 4) Иммуногенность рекомбинантного HPV11-L1 определяли в тесте на мышах линии Balb/c с массой 12-14 г после однократной вакцинации белком HPV11-L1, сорбированном на гидроокиси алюминия. Значение ED/50 (ED/50 - доза антигена, вызывающая сероконверсию у 50% мышей) составляет менее 100 нг, что является хорошим показателем иммуногенных свойств рекомбинантного белка. Культурально-морфологические особенности штамма: клетки округлой формы, небольшие по размеру, на агаризованной среде YPD образуют крупные круглые колонии с выраженной выпуклой серединой. Хранение - при -70°С в виде суспензии клеток в стерильном 30-50%-ном растворе глицерина. Генетические особенности: Штамм не является зоопатогенным или фитопатогенным. Способ, условия и состав сред для размножения штамма: инкубирование прокачиванием при 30°С в питательной среде состава: 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы. Условия и состав среды для ферментации: прокачивание при 30°С и рН 5.0-5.5 в питательной среде, содержащей до 4 % глицерина. Активность штамма определяли в осветленном гомогенизате клеток методом иммуноблотинга или иммуноферментного анализа. Активность штамма - не менее 15 мг/л культуральной жидкости. Выделенный белок L1 HPV типа 11 может быть использован в тест-системах, а также для создания на его основе вакцин для профилактики заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека.HPV11-L1 (мг/мл) HPV11-L1 (мг) Общий белок (г) Чистота % Выход % Клеточный лизат 0.21 930 245.1 0.4 100 5-35% SA экстракт 0.11 640 22.4 2.9 69 SP Sepharose FF 0.56 350 0.84 41.7 38 Toyopearl HW-65F 0.84 171 - > 95 18