патент
№ RU 2676160
МПК C12N1/15

Рекомбинантный штамм дрожжей Hansenula polymorpha - продуцент главного капсидного белка L1 вируса папилломы человека типа 11

Авторы:
Крымский Михаил Александрович Борисов Иван Андреевич Яковлев Михаил Симеонович
Все (15)
Номер заявки
2018105600
Дата подачи заявки
14.02.2018
Опубликовано
26.12.2018
Страна
RU
Дата приоритета
28.05.2024
Номер приоритета
Страна приоритета
Как управлять
интеллектуальной собственностью
Иллюстрации 
5
Реферат

Изобретение относится к биотехнологии, а именно генной инженерии. Предложен штамм дрожжей Hansenula polymorpha - продуцент рекомбинантного белка L1 вируса папилломы человека (HPV) типа 11. Штамм был получен путем введения в геном клетки дрожжей одной копии последовательности ДНК, кодирующей капсидный белок L1 HPV типа 11, под контролем промотора ДАК, и одной копии последовательности ДНК, кодирующей капсидный белок L1 HPV типа 11, под контролем промотора МОХ. Штамм обеспечивает высокий выход рекомбинантного белка L1 HPV, обладающего антигенными и иммуногенными свойствами природного антигена. Изобретение может быть использовано для микробиологического получения рекомбинантного белка L1 HPV типа 11. 2 ил., 1 табл., 9 пр.

Формула изобретения

Рекомбинантный штамм дрожжей Hansenula polymorpha КБТ17/pPV-112, содержащий интегрированный в геном фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим полипептид L1 HPV типа 11, под контролем промотора гена DAK H. polymorpha (SEQ ID NO: 1) и фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим полипептид L1 HPV типа 11, под контролем промотора гена МОХ H. polymorpha (SEQ ID NO: 2) - продуцент рекомбинантного капсидного белка L1 вируса папилломы человека (HPV) типа 11.

Описание

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно генной инженерии, и может быть использовано для создания микробиологического дрожжевого продуцента капсидного белка L1 вируса папилломы человека типа 11.

Вирус папилломы человека (HPV - Human Papilloma Virus), поражая эпителиальные клетки, вызывает различные заболевания у человека. На основании отличий в последовательности ДНК выделяют более 200 типов вируса папилломы. По данным ВОЗ более 630 миллионов человек являются носителями папилломавирусной инфекции, из них у 190 миллионов наблюдаются клинические проявления. Вирус папилломы человека типа 16 и 18 вызывает эпителиальную дисплазию слизистой половых органов, именно эти типы вируса папилломы ассоциированы с большей частью преинвазивных и инвазивных карцином аногенитальной сферы (рак шейки матки, влагалища, вульвы и анального канала), из которых рак шейки матки - один из самых распространенных и опасных видов новообразований у женщин. В исследовании, проведенном на территории РФ, показано, что у женщин с высокой степенью плоскоклеточного интраэпителиального поражения и раком шейки матки наряду с HPV типа 16 обнаруживается HPV типа 56, причем в случае мультиинфекции этот тип вируса преобладает (V11 Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010», Сб.трудов п/ред. Академика РАМН В.И. Покровского, т. 3, с. 373-409). Ежегодно раком шейки матки заболевают около 500 тысяч женщин во всем мире, причем более половины этих случаев заканчиваются летальным исходом. Вирус папилломы человека типов 6 и 11 не относятся к онкогенным: папилломавирусная инфекция в этом случае проявляется в виде образования доброкачественных бородавок, незлокачественных кондилом или папиллом на слизистой половых органов или дыхательных путей. В мире ежегодно регистрируется 30 миллионов новых случаев генитальных бородавок, связанных с папилломавирусной инфекцией. Клинические проявления инфекции не обнаруживаются длительное время, в то же время ранняя диагностика папилломавирусной инфекции довольно сложна. Именно поэтому в борьбе с распространением такого тяжелого заболевания предпочтение отдается профилактике папилломавирусной инфекции, в частности, путем индуцирования иммунного ответа у человека при вакцинации.

Вирус папилломы относится к семейству паповирусов (Papoviridae), имеет диаметр 40-50 нм. Капсид вируса образован из 72 белковых капсомеров, состоящих из основного белка L1 и минорного белка L2. Геном вируса представлен в виде кольцевой двуцепочечной ДНК, которая содержит 8 ранних генов (Е1-Е7) и два поздних гена, кодирующих белки капсида L1 и L2. Главный белок L1 (55-60 кДа) способен сам собираться в вирусоподобные частицы (VLP - virus-like particle), сходные по строению с вирионами, но не содержащие вирусную ДНК. Белок L1 обладает высокой иммуногенностью и индуцирует образование антител, нейтрализующих инфекционный вирус.

В настоящее время рекомбинантные белки L1 HPV представляют собой перспективные иммуногенные компоненты для создания профилактических вакцин, направленных против опасных типов папилломавируса. Затруднения, препятствующие созданию эффективных папилломавирусных вакцин, прежде всего, связаны с разработкой оптимальных экспрессионных систем для продукции рекомбинантных белков HPV, обладающих иммуногенными свойствами природных белков HPV L1.

Известно получение белков L1 и L2 HPV типа 16 путем культивирования клеток CV-1 млекопитающих, инфицированных рекомбинантным вектором вируса коровьей оспы [Zhou J et al., Virology v. 185, p. 251-257, 1991]. Известна экспрессия папилломавирусного белка L1, в том числе типов 6 и 11, способного спонтанно собираться в вирусоподобные частицы и обладающего иммуногенностью, в эукариотической системе на основе культивируемых клеток насекомых (бакуловирусная система) [Kirnbauer R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, v. 89, p. 12180-12184, 1992], US 8,062,642, US 9,050,287, US 9,745,351, US 6,165,471. В научной и патентной литературе представлены примеры использования для получения рекомбинантных белков HPV системы экспрессии на основе дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которым отдается предпочтение благодаря международно признанной безопасности дрожжей, способности к наработке больших количеств белка в нативной конформации. Так, в патенте RU 2206608, 2003, C12N 7/00 описывается создание дрожжевого продуцента белка L1 HPV или L2 HPV разных типов, в том числе HPV 6 и 11, на примере Saccharomyces cerevisiae. Клонирование генов L1 и L2 HPV осуществляли с использованием геномной ДНК, экстрагированной из клеток Caski (ATCC № CRL 1550). Конструировали экспрессионный плазмидный дрожжевой вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую соответствующий полипептид, под контролем промотора GAL10 и трансформировали им клетки S. cerevisiae. Способность рекомбинантных клеток S. cerevisiae экспрессировать белки L1 или L2 HPV анализировали иммуноблотингом.

Петров Р.М. и др. [WO 2006/065166 A1, 2006] получали капсидные белки L1 вирусных серотипов 16, 18, 31 HPV, вызывающих наиболее агрессивные формы заболеваний у человека, из рекомбинантных штаммов дрожжей. Эти штаммы получали трансформацией дрожжевых клеток S. cerevisiae плазмидами с генами, кодирующими белки L1 указанных серотипов. Фрагменты ДНК, кодирующие эти белки, были выделены из клинического материала. Созданные дрожжевые продуценты при культивировании были способны экспрессировать белки L1 в виде вирусоподобных частиц. Белки L1 использовали для приготовления профилактических и терапевтических вакцин.

Известно использование метилотрофных дрожжей Pichia pastoris для получения основного капсидного белка HPV [Bazan S.B. et al., Arch. Virol. 2009, 154(10), 1609-17]. В геном P. pastoris был введен ген, кодирующий HPV-L1, под контролем регулируемого метанолом промотора. Этот ген имел оптимизированный кодоновый состав. Очистку белка L1 выполняли с использованием гепарин-сефарозной хроматографии с последующей стадией сборки вирусоподобных частиц. Образование биологически активных VLP подтверждали методами иммуноэлектронной микроскопии и гемагглютинации.

В патенте RU 2445357, 2012 раскрыт рекомбинантный штамм-продуцент капсидного белка L1 HPV типа 16 Pichia angusta (синоним Hansenula polymorpha) ВКМ Y-2988D, полученный путем интеграции в геном экспрессионной плазмиды, содержащей фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим L1 HPV типа 16, под контролем промотора DAK (ген дигидроксиацетон киназы) H. polymorpha и селективный маркер (ген LEU2 H. polymorpha). Описанный рекомбинантный штамм-продуцент, имея высокую продуктивность, тем не менее, не обеспечивает получение антигена, обладающего оптимальной для использования в вакцине иммуногенностью. Для повышения продуктивности штамма-продуцента экспрессионная кассета рекомбинантного белка вводится в геном реципиентного штамма в большом количестве копий. Однако в некоторых копиях экспрессионной кассеты в ходе получения и культивирования штамма могут возникать мутации, изменяющие свойства целевого белка. При этом контроль за возникновением мутаций в случае высокой копийности гена практически невозможен. Более того, при превышении определенного уровня синтеза может нарушаться процесс укладки целевого белка, что приводит к снижению его выхода, ухудшению биологической активности и усложняет процесс очистки.

Ближайшим аналогом является патент US 7,709,010, 04.05.2010, в котором описано создание поливалентной вакцины против папилломавирусной инфекции, включающей VLP L1 разных типов HPV, в том числе и типов 6, 11. VLP получены путем экспрессии капсидного белка L1 в рекомбинантных дрожжевых клетках S.cerevisiae. Выделенные и очищенные VLP адсорбировали на алюминиевом адъюванте и адъюванте ISCOM-типа. Преимущество системы экспрессии на основе дрожжей S.cerevisiae заключается в относительно низкой себестоимости и легкой адаптации к крупномасштабному росту в ферментерах.

К недостаткам использования системы экспрессии на основе Saccharomyces cerevisiae можно отнести нестабильность рекомбинантных клеток, связанную с относительно высокой частотой потерь автономной плазмиды при делении клеток. При культивировании штамма в неселективных для плазмиды условиях это приводит к накоплению клеток, не содержащих плазмиды и неспособных к синтезу целевого белка. Это существенно осложняет культивирование рекомбинантного штамма и увеличивает себестоимость целевого продукта. Для индукции экспрессии рекомбинантных белков используется достаточно дорогой реагент - галактоза, что увеличивает себестоимость целевого продукта.

Задачей изобретения является создание рекомбинантного штамма дрожжей H. polymorpha - стабильного эффективного микробиологического дрожжевого продуцента главного капсидного белка вируса папилломы человека типа 11, обладающего необходимыми биологическими свойствами (правильная конформация, иммуногенность, чистота) и низкой себестоимостью. Полученный дрожжевой продуцент должен обеспечивать возможность контролировать отсутствие мутаций в экспрессируемом чужеродном гене, иметь контролируемый уровень экспрессии рекомбинантного гена, чтобы обеспечить высокую эффективность укладки синтезируемого полипептида с образованием природной конформации получаемого продукта, иметь достаточно высокий выход целевого белка, обеспечивающий экономическую целесообразность использования продуцента.

Задача решена тем, что, согласно изобретению, для получения рекомбинантного штамма-продуцента главного капсидного белка L1 HPV11 в геном реципиентного штамма DLT2 H. polymorpha последовательно интегрируют две экспрессионные кассеты, содержащие по одной копии нужного гена. Первая кассета содержит фрагмент ДНК с рекомбинантным геном, кодирующим HPV11-L1, под контролем промотора гена MOX (метанолоксидаза) и селективный маркер (ген TRP3H. polymorpha). Вторая экспрессионная кассета содержит аналогичный ген HPV11-L1, но под контролем промотора гена DAK (ген кодирует дигидроксиацетон киназу) дрожжей H. polymorpha и селективный маркер (ген LEU2S. cerevisiae). В результате трансформации получают рекомбинантный штамм, содержащий одну копию гена HPV11-L1 под контролем промотора MOX и одну копию гена HPV11-L1 под контролем промотора DAK. При этом искусственные гены интегрированы непосредственно в геном штамма-продуцента, т.е. находятся в составе хромосом дрожжей H. polymorpha. Это обеспечивает высокую митотическую стабильность штамма, давая возможность оптимизировать условия его культивирования без учета риска накопления клеток, потерявших способность синтезировать чужеродный белок. Кроме того, наличие только одной копии рекомбинантного гена в каждой экспрессионной кассете с уникальной промоторной и терминальной областью позволяет контролировать отсутствие мутаций этого гена в процессе его введения в геном и при культивировании штамма. Контроль за отсутствием мутаций осуществляют путем анализа нуклеотидной последовательности продуктов полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, уникальных к специфическим последовательностям в кодирующей области каждой экспрессионной кассеты.

Преимуществом предложенного изобретения также является возможность получения стабильно высокого уровня синтеза целевого белка без нарушения эффективности его укладки. Использование экспрессионных кассет с двумя разными промоторами (MOX и DAK), максимальная активность которых достигается при разных условиях культивирования, обеспечивает большую равномерность синтеза продукта в процессе культивирования штамма. При этом не превышается уровень синтеза белка, который может привести к возможному нарушению эффективности укладки и, как следствие, снижению продуктивности штамма.

В результате отбора клонов, способных синтезировать белок HPV11-L1, был выделен трансформант, наиболее отвечающий требуемым свойствам. Полученный рекомбинантный штамм позволяет добиваться более высоких уровней синтеза рекомбинантного белка при более простых способах получения культур высокой плотности, а также выделять белок HPV11-L1 в виде VLP с правильной конформацией, обладающий необходимыми антигенными и иммуногенными свойствами, с достаточно высоким выходом. Образование VLP подтверждали с использованием просвечивающей электронной микроскопии.

Штамм депонирован 21.11.2017 в коллекции ЗАО НПК «Комбиотех» под номером КБТ-17/pPV-112. Штамм является новым и ни в патентной, ни в научно-технической литературе не описан.

Технический результат предложенного изобретения заключается в создании рекомбинантного штамма, способного продуцировать белок L1 HPV типа 11, обладающий улучшенными биологическими свойствами: антигенность, иммуногенность, правильная сборка VLP, а также снижении себестоимости целевого продукта.

Изобретение может быть проиллюстрировано следующими примерами.

В приводимых примерах все генно-инженерные операции производили согласно стандартным методикам и инструкциям компаний производителей ферментов и наборов для манипуляций с ДНК in vitro. Трансформацию клеток Escherichia coli и Hansenula polymorpha осуществляли согласно ранее описанным методам (Inoue et al, 1990, Gene, 96:23-28. и Bogdanova et al., 1995, Yeast 11:343-353, соответственно). Синтез фрагментов ДНК, а также определение последовательности нуклеотидов производились ЗАО “Евроген” (Москва, Россия). Были использованы синтетические фрагменты ДНК, нуклеотидные последовательности которых приведены в Перечне последовательностей нуклеотидов и аминокислот.

Пример 1. Получение плазмидного вектора p11HPV3, содержащего рекомбинантный ген DAK-HPV11-L1 и селективный маркер ген LEU2S. cerevisiae.

Фрагмент ДНК DAK-HPV11 (SEQ ID NO: 1) и препарат плазмиды AMIpSL1 (Agaphonov et al., 1999, Yeast 15:541-551), содержащей ген LEU2S. cerevisiae в качестве дрожжевого селективного маркера, был гидролизован рестриктазами BsrGI и HindIII. Полученные препараты фрагмента ДНК с рекомбинантным геном и линеаризованной плазмиды AMIpSL1 внесли в реакционную смесь для проведения лигирования в концентрации 30 нг/мкл. После инкубации с Т4 ДНК лигазой в течение 2 часов, 2 мкл реакционной смеси использовали для трансформации штамма E. coli DH5α. Из нескольких выросших трансформантов выделили плазмидную ДНК. На основании рестрикционного анализа была отобрана плазмида, содержащая фрагмент DAK-HPV11. Определение последовательности нуклеотидов этой плазмиды подтвердило, что она содержит ген, кодирующий HPV11-L1 под контролем промотора DAK H. polymorpha. Полученную плазмиду обозначили p11HPV3.

Пример 2. Получение плазмидного вектора p11HPV2, содержащего рекомбинантный ген MOX-HPV11-L1 и неполный ген TRP3H. polymorpha в качестве селективного маркера.

Фрагмент ДНК MOX-HPV11 (SEQ ID NO: 2) и препарат плазмиды pTZ-MOX (Agaphonov et al., 1995, Yeast, 11:1241-1247), содержащей неполный ген TRP3H. polymorpha в качестве дрожжевого селективного маркера, были гидролизованы рестриктазами BglII и XhoI. Продукт гидролиза фрагмента MOX-HPV11 и продукт гидролиза плазмиды pTZ-MOX длиной 4.3 т.п.н. были выделены после электрофоретического разделения в агарозном геле. Полученные препараты ДНК внесли в реакционную смесь для проведения лигирования в концентрации 30 нг/мкл. После инкубации с ДНК лигазой Т4 в течение 2 часов, 2 мкл реакционной смеси использовали для трансформации штамма E. coli DH5α. Из нескольких выросших трансформантов выделили плазмидную ДНК. На основании рестрикционного анализа была отобрана плазмида, содержащая фрагмент MOX-HPV11. Определение последовательности нуклеотидов этой плазмиды подтвердило, что она содержит ген, кодирующий HPV11-L1 под контролем промотора MOX H. polymorpha. Полученную плазмиду обозначили p11HPV2.

Пример 3. Получение штамма H. polymorpha, содержащего экспрессионную кассету HPV11-L1 с промотором МОХ.

Штамм H. polymorpha DLT2 [Agaphonov et al., 1994, Yeast v10, pp. 509-513; коллекция штаммов лаборатории молекулярной генетики РКНПК МЗ РФ] трансформировали плазмидой p11HPV2, гидролизованной рестриктазами Ecl136II и XhoI. Трансформантов отбирали на среде, содержащей 6.7 г/л смеси солей и витаминов "Yeast Nitrogen Base" (Difco), 20 г/л D-глюкозы, 20 г/л агара и 60 мг/л лейцина. Среди полученных трансформантов были отобраны клоны, способные продуцировать HPV11-L1. Один из таких трансформантов был обозначен DLT2/p11HPV2.

Пример 4. Получение штамма H. polymorpha, содержащего две экспрессионные кассеты HPV11-L1, одна из которых с промотором МОХ, а другая с промотором DAK.

Штамм DLT2/p11HPV2 (пример 3) трансформировали плазмидой p11HPV3, гидролизованной рестриктазой BsrGI. Трансформантов отбирали на среде, содержащей 6.7 г/л смеси солей и витаминов "Yeast Nitrogen Base" (Difco), 20 г/л D-глюкозы и 20 г/л агара. Один из полученных трансформантов был обозначен КБТ17/pPV-112. У этого трансформанта было подтверждено наличие интактного гена MOX-HPV11 (см. пример 5) и интактного гена DAK-HPV11 (см. пример 6).

Пример 5. Определение наличия интактного гена МОХ-HPV11 в геноме трансформантов H. polymorpha.

Из анализируемых клонов получали препараты геномной ДНК и использовали в качестве матрицы для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с олигонуклеотидами MOX20 (SEQ ID NO: 3) и MOX3'TRP3 (SEQ ID NO: 4) в качестве праймеров. ПЦР проводили с использованием полимеразы Pfu (Fermentas). При наличии в геноме гена МОХ-HPV11 образовывался продукт ПЦР длиной 1696 п.н. Для подтверждения интактности этого гена, определяли последовательность нуклеотидов полученного продукта ПЦР.

Пример 6. Определение наличия интактного гена DAK-HPV11 в геноме трансформантов H. polymorpha.

Из анализируемых клонов получали препараты геномной ДНК и использовали в качестве матрицы для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с олигонуклеотидами dakFw1 (SEQ ID NO: 5) и AMI20 (SEQ ID NO: 6) в качестве праймеров. ПЦР проводили с использованием полимеразы Pfu (Fermentas). При наличии в геноме гена DAK-HPV11 образовывался продукт ПЦР длиной 1718 п.н. Для подтверждения интактности этого гена, определяли последовательность нуклеотидов полученного продукта ПЦР.

Пример 7. Культивирование штамма H. polymorpha КБТ17/pPV-112, содержащего две экспрессионные кассеты HPV11-L1, одна из которых с промотором МОХ, а другая с промотором DAK.

Ферментацию штамма-продуцента дрожжей H. polymorpha осуществляли в два этапа. На первом этапе в режиме фед-бэтч при температуре 30°С наращивали биомассу в культуральной среде, содержащей 4% дрожжевого экстракта, 2% бакто-пептона и 4% глицерина. Когда плотность сырой биомассы достигала 150 г/л (примерно через 28-32 часа ферментации), добавляли индуктор до концентрации 0.5-0.8 % и поддерживали на этом уровне в течение 48-72 часов.

Пример 8. Выделение и очистка рекомбинантного белка HPV11-L1 из клеток H. polymorpha.

После ферментации штамма-продуцента белок HPV11-L1 (аминокислотная последовательность - SEQ ID NO: 7) выделяли согласно опубликованной методике [Kim H.J. et al., Protein Expression and Purification, v. 70, p. 68-74, 2010] с небольшими изменениями. Клетки из культуральной жидкости осаждали центрифугированием при 4000g в течение 15 минут при 4°С. Осажденную биомассу ресуспендировали до концентрации 300 г влажных клеток на литр суспензии в буфере для экстракции: PBS (рН 7.2) с добавлением 1.7mM EDTA, 2mM PMSF, 0.01% Tween-80. Далее клетки разрушали в мельнице Dyno-Mill типа KDL, используя стеклянные шары диаметром 0.5-0.7 мм. Для удаления основной массы нецелевых белков полученный клеточный лизат насыщали сульфатом аммония до 35% от насыщения и осажденные белки отделяли центрифугированием при 12000g в течение 30 минут. Осадок ресуспендировали в 9 объемах буфера PBS (pH 7.2) + 0.01% Tween-80 для достижения 5% насыщения сульфатом аммония и инкубировали в течение 24 часов при комнатной температуре для полного растворения целевого белка и осаждения части примесных белков, которые затем отделяли центрифугированием при 12000g в течение 30 минут. Полученный супернатант диализовали в буфер для связывания: PBS (рН 6.2), содержащий 0.2 M NaCl и 0.01% Tween-80 с последующей адсорбцией на сорбент SP Sepharose FF (GE Healthcare, USA). После промывки сорбента тем же буфером для связывания, белок HPV11-L1 элюировали линейным градиентом от 0.2 M до 1.5 M NaCl. Объединенные фракции, содержащие антиген (по иммуноблоту и SDS-PAGE), концентрировали ультрафильтрацией в тангенциальном потоке на мембране Pellicon Biomax 300 KDa (Millipore, USA) и разделяли при помощи зонального ультрацентрифугирования (Beckman Coulter, USA) в градиенте глицерин / сахароза. Фракции, содержащие целевой белок, объединяли, а затем очищали от глицерина и сахарозы гельфильтрацией на сорбенте Toyopearl HW-65F (ToyoSoda Corp., Japan). Чистоту полученного таким образом рекомбинантного белка HPV11-L1 определяли методом SDS-PAGE электрофореза. Если чистота белка была недостаточна (менее 95%) производили дополнительную очистку при помощи анионообменной хроматографии на сорбенте Toyopearl DEAE-650M (ToyoSoda Corp., Japan).

В результате этих операций удается выделить около 15-20% белка L1, присутствующего в клеточном лизате (таблица 1). Выход очищенного HPV11-L1 составлял не менее 50 мг / кг влажной биомассы дрожжей.

Таблица 1. Типичный баланс выделения и очистки HPV11-L1. Концентрация общего белка на первых стадиях определялась по Биуретовому методу. На остальных стадиях - по методу Лоури. Содержание и чистота HPV11-L1 определялась при помощи иммуноблотинга и SDS-PAGE электрофореза.

HPV11-L1 (мг/мл)HPV11-L1 (мг)Общий белок (г)Чистота %Выход %
Клеточный лизат0.21930245.10.4100
5-35% SA экстракт0.1164022.42.969
SP Sepharose FF0.563500.8441.738
Toyopearl HW-65F0.84171-> 9518

Пример 9. Анализ рекомбинантного HPV11-L1.

1) Чистота рекомбинантного целевого белка определяется электрофорезом в полиакриламидном геле в восстанавливающих условиях (SDS-PAGE) путем окрашивания c Coomassie Brilliant Blue R-250 и анализа интенсивности полос отсканированных гелей посредством компьютерной программы NIH Image. Чистота выделенного рекомбинантного белка HPV11-L1 составляет не менее 95% (фиг. 1.А).

2) Иммуноспецифичность рекомбинантного HPV11-L1 определяют методом иммуноблотинга. Первичными антителами к белку HPV11-L1 (cat# CABT-B8787, Creative Diagnostics, USA) окрашивают иммуноблот с последующей визуализацией при помощи специфических антител к иммуноглобулинам мыши, коньюгированными с пероксидазой хрена, по методике улучшенной хемилюминисценции ECL (Amersham, UK). Рекомбинантный антиген HPV11-L1 представлен в виде полосы мономера белка в районе 55 кДа (фиг. 1Б).

3) Образование VLP рекомбинантного белка HPV11-L1 подтверждали методом просвечивающей электронной микроскопии. Представленные образцы были исследованы методом негативного контраста (в качестве контрастера использовали водный раствор фосфорно-вольфрамовой кислотой) с отмывкой дистиллированной водой, в трансмиссионном электронном микроскопе JEOL 100B (Japan) при ускоряющем напряжении 80 kV, съемка производилась при инструментальных увеличениях от 15000 до 59000. Средний размер вирусоподобных частиц составил ~50нм.

4) Иммуногенность рекомбинантного HPV11-L1 определяли в тесте на мышах линии Balb/c с массой 12-14 г после однократной вакцинации белком HPV11-L1, сорбированном на гидроокиси алюминия. Значение ED/50 (ED/50 - доза антигена, вызывающая сероконверсию у 50% мышей) составляет менее 100 нг, что является хорошим показателем иммуногенных свойств рекомбинантного белка.

Культурально-морфологические особенности штамма: клетки округлой формы, небольшие по размеру, на агаризованной среде YPD образуют крупные круглые колонии с выраженной выпуклой серединой.

Хранение - при -70°С в виде суспензии клеток в стерильном 30-50%-ном растворе глицерина.

Генетические особенности: Штамм не является зоопатогенным или фитопатогенным.

Способ, условия и состав сред для размножения штамма: инкубирование прокачиванием при 30°С в питательной среде состава: 2% пептона, 1% дрожжевого экстракта, 2% глюкозы.

Условия и состав среды для ферментации: прокачивание при 30°С и рН 5.0-5.5 в питательной среде, содержащей до 4 % глицерина.

Активность штамма определяли в осветленном гомогенизате клеток методом иммуноблотинга или иммуноферментного анализа. Активность штамма - не менее 15 мг/л культуральной жидкости.

Выделенный белок L1 HPV типа 11 может быть использован в тест-системах, а также для создания на его основе вакцин для профилактики заболеваний, ассоциированных с вирусом папилломы человека.

Как компенсировать расходы
на инновационную разработку
Похожие патенты