для стартапов
и инвесторов
Изобретение относится к биотехнологии и рыбоводству. Предложен способ изготовления эритроцитарного антигена для диагностики вибриоза рыб. Способ предусматривает приготовление
питательных сред, посевного материала и получение сенситина из штаммов Vibrio anguillarum №2 и VUR-19, с последующей сенсибилизацией эритроцитов барана. При этом используют 20% взвесь
формалинизированных эритроцитов на фосфатно-буферном растворе с pH 7,0-7,4. Сенсибилизацию проводят на водяной бане в два этапа. Эритроциты и сенситин берут в соотношении 1:0,3-1:0,35. Изобретение
может быть использовано в рыбоводстве.
Изобретение относится к биотехнологии,
в частности к рыбоводству, к способам получения эритроцитарного антигена для диагностики вибриоза рыб. Вибриоз рыб это опасное бактериальное заболевание. Встречается у 42 видов рыб и
гидробионтов в 16 странах мира в солоноватой, морской и пресной воде. Клиническими признаками заболевания являются покраснение кожных покровов, ерошение чешуи, язвы на поверхности тела рыбы,
воспаление анального отверстия. При патологоанатомическом вскрытии наблюдаются наличие гнойного эксудата в полости тела рыбы, увелечение и потемнение почек, точечные кровоизлияния в печени. Это
заболевание имеет несколько форм течения, от хронического - с покраснением участков наружных покровов и образованием язв на поверхности тела, до острого септического - характеризующегося внезапной
гибелью рыб без внешних признаков поражения. В настоящее время отсутствует специфическая профилактика заболевания, а борьба сводится к организационно-хозяйственным и ветеринарно-санитарным
мероприятиям. Технической задачей заявленного изобретения является получение антигена, предназначенного для диагностики вибриоза рыб. Поставленная задача достигается в
способе изготовления эритроцитарного антигена для диагностики вибриоза рыб, включающем приготовление питательных сред, посевного материала, получение сенситина из штаммов Vibrio anguillarum №2 и
VUR-19, с последующей сенсибилизацией эритроцитов барана, при этом используют 20% взвесь формалинизированных эритроцитов на фосфатно-буферном растворе с pH 7,0-7,4, сенсибилизацию проводят на водяной
бане в два этапа, на первом - в течение 60-65 мин при температуре 55-60°С, а на втором - в течение 120-130 мин при температуре 40-42°С, причем эритроциты и сенситин берут в соотношении
1:0,3-1:0,35, антиген расфасовывают во флаконы по 10-20 см3. Полученный антиген представляет собой жидкость коричневого цвета, которая при хранении расслаивается на прозрачную
часть и темно-коричневый осадок. Антиген должен давать четкую положительную реакцию с гомологичной сывороткой и не давать реакцию с гетерологичными сыворотками и физраствором. Срок
годности антигена 18 мес при условии хранения в темном сухом помещении при температуре 4-8°С. Использование разработанного антигена позволяет своевременно диагностировать вибриоз
рыб и успешно бороться с этим заболеванием. Способ осуществляют следующим образом. Основные стадии технологического процесса. Подготовка основного сырья
включает приготовление перевара Хоттингера, мясопептонного агара и затем приготовление питательных сред. Готовая питательная среда стерильна, прозрачна, pH 7,4-7,8 и содержит 160-180 мг% аминного
азота. Приготовление посевного материала включает выращивание культур штаммов Vibrio anguillarum №2 и VUR-19 вначале на пробирках с МПА, затем на производственной питательной среде во
флаконах емкостью 200-300 см3. Получение матровой расплодки 1-го пассажа: сухие штаммы, полученные из ВГНКИ, ресуспендируют путем внесения в ампулы по 1,0-1,5 мл стерильного МПБ и методом
капельного орошения высевают на пробирки с МПА, затем их оставляют на 2-е суток в темном месте при температуре 18-25°С. Затем проводят аналогично получение матровых расплодок 2-го и 3-го
пассажа. По окончании культивирования бакмассу охлаждают и подают на центрифугирование, а затем гомогенизируют в течение 5-6 мин. Процесс получения сенситина осуществляют
путем отделения бакмассы от питательной среды, экстракции антигенов с помощью, например, раствора ледяной уксусной кислоты, отделения экстракта от взвеси микробных клеток и дейтрита на суперцентрифуге,
концентрирования антигенов, отделения осадка и приготовления раствора сенситина в оптимальной концентрации для сенсибилизации эритроцитов. Кровь берут из яремной вены баранов-доноров с
последующим получением эритроцитов. Из осадка отмытых эритроцитов готовят 20% взвесь формалинизированных эритроцитов на фосфатно-буферном растворе с pH 7,0-7,4, а сенсибилизацию эритроцитов проводят
на водяной бане в два этапа, на первом - в течение 60-65 мин при температуре 55-60°С, а на втором - в течение 120-130 мин при температуре 40-42°С, причем эритроциты и сенситин берут в
соотношении 1:0,3-1:0,35. Антиген расфасовывают во флаконы по 10-20 см3. Пример 1. Для получения эритроцитарного антигена для диагностики вибриоза рыб
готовят питательную среду с pH 7,4 и содержанием 160 мг% аминного азота. Посевной материал готовят путем выращивания культур штаммов Vibrio anguillarum №2 и VUR-19 вначале на пробирках
с МПА, затем на производственной питательной среде во флаконах емкостью 300 см3. Затем получают матровые расплодки 1-го, 2-го и 3-го пассажа. По окончанию культивирования
бакмассу охлаждают и подают на центрифугирование, а затем гомогенизируют в течение 5 мин. Сенситин получают в процессе отделения бакмассы от питательной среды, экстракции антигенов с
помощью, например, раствора ледяной уксусной кислоты, отделения экстракта от взвеси микробных клеток и дейтрита на суперцентрифуге, концентрирования антигенов, отделения осадка и приготовления
раствора сенситина в оптимальной концентрации для сенсибилизации эритроцитов. Кровь берут из яремной вены баранов-доноров с последующим получением эритроцитов. Из осадка отмытых
эритроцитов готовят 20% взвесь формалинизированных эритроцитов на фосфатно-буферном растворе с pH 7,0, а сенсибилизацию эритроцитов проводят на водяной бане в два этапа, на первом - в течение 60 мин
при температуре 60°С, а на втором - в течение 130 мин при температуре 40°С, причем эритроциты и сенситин берут в соотношении 1:0,3. Антиген расфасовывают во флаконы по 10 см3
. Пример 2. Проводят аналогично примеру 1, а исключением является то, что сенсибилизацию эритроцитов проводят на водяной бане в два этапа, на первом - в течение 65 мин
при температуре 55°С, а на втором - в течение 120 мин при температуре 42°С, причем эритроциты и сенситин берут в соотношении 1:0,35. Антиген расфасовывают во флаконы по 20 см3
. Пример 3. Проводят аналогично примеру 1, а исключением является то, что сенсибилизацию эритроцитов проводят на водяной бане в два этапа, на первом - в течение 60 мин
при температуре 55°С, а на втором - в течение 125 мин при температуре 41°С, причем эритроциты и сенситин берут в соотношении 1:0,35. Антиген расфасовывают во флаконы по 20 см3
.