Способ получения над-зависимой алкогольдегидрогеназы

1

Изобретение относится к микробио логической промышленности, а именно , к способам получения НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы из дрожжей. Изобретение может найти применение в фармацевтической и медицинской промышленности , а также в научных исследованиях .

В последние годы было показано, что НАД-зависимая алкогольдегидрогеназа из печени человека, лошади и пекарских дрожжей обладает широкой субстратной специфичностью и катализирует наряду с окислением этанола и окисление метанола.

Способна окислять метанол и НАДзависимая дегидрогеназа из метанолокисляющих дрожжей 1.

Однако активность по метанолу НАДзависимой алкогольдегидрогеназы из названных источников очень низка.

Получение НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы с высокой активностью по метанолу имеет,кроме чисто научного , также практическое значение. Окисление метанола с помощью НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы может найти применение в процессах, в коTjoptix необходима регенерация кофактора , а именно НАДН. Это многие биохимические окислительные процессы, например получение аминокислот, модификация стероидов и т.д. Перспективным является также создание биоэлектрохи- Мичёских систем окисления различных органических соединений для создания топливных элементов, в - которых НАДН выполнял бы роль переносчика злектронов с органических соединений на электрод.

Наиболее близким к изобретению является способ получения НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы из дрожжей Pichia pinas, предусматривающий культивирование дрожжей при аэрации в периодическом режиме на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и 2% метилового спирта в качестве источника углерода, а также выделение:фермента 2.

Недостатки способа: низкая актив25 ность фермента по отношению к метанолу , составляквдая 402 нмоль/мг белка-мин; периодические условия культивирования , которые не позволяют поддерживать культуру в одном и том

30 же физиологическом состоянии с высокой феЕментативной активностью;, применение в качестве источника углерода метилового спирта усложняет культивирование в промышленных масштабах , так как он летуч и токсичен. В этом случае необходима очистка сточных вод от метанола. Цель изобретения - повышениеметанолокисляющей активности фермент и эффективности процесса. Указанная цель достигается тем, что в качестве продуцента используют дрожжи Candida methylica ИБФМ У-670 а культивирование ведут в проточных условиях, при этом в качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентрации 0,01-0,1 об.%. . Повышение эффективности процесса происходит за счет того, что культивирование в условиях Протока позволя ет получать большие количества биомассы , а также поддерживать культуру в одной и той же фазе роста при постоянной концентрации источника углерода в среде, что является необходимым условием для получения фермента с высокой метанолокисляющей активностью. Эффективность процесса повышается и за счет использования в качестве источника углерода этилового спирта, что упрощает технологию . Способ осуществляют следующим образом . Дрожжи Candida methylica ИБФМ ,670 культивируют да синтетической питательной среде следующего состава: ( NHjLHPO. 0,5 г/л; КНдНгРОд. 1,5 г/л; KN02,4,0 г/л; MgSO4 0,25 г/Л дрожжевой автолизат 0,01 г/л,-этиловый спирт 0,01-0,1 об, %. Культивирование проводят в ферментере в непрерывно-проточном режиме с коэффициентом разбавления 0,1-0,05 ч при аэрации, рН среды 6,0. Для выделения фермента биомассу разрушают путем растирания стеклянными бусами и центрифугируют, супернатант хроматографируют на ДЕАЕ-целпюлозе . Активность полученного препа рата по метанолу 7100 нм/мг белкаМи П р и м е р 1.В качестве продуцен га используют метило трофных дрожжей Candida-methyJica ИБФМ У670 ,который хранится в коллекции ин ститута биохимии и физиологии микро организмов АН СССР в г,Пущино-на.гЬк Штамм защищай авторским- свидетельством № 449933, кл. с 21 Q 11/18, Дрожжи культивируют на минеральной среде следующего состава,г/л: (NH4)HP04 0,5 NH4H2P04 1,5; KNO 4,0; МдЗОд 0,25; дрожжевой автолизат 0,01. Вода дистиллированная. Значение рН среды доводят соляной кислотой до 0,0. Стерилизацию среды проводят при 1 атм 20 мин, В качестве источника углерода используют эти новый спирт, который добавляют после Стерилизации в количеств.е 0,05 об. % Для выращивания -культуры используют ферментеры фирм LKB (Швеция) или B.Braun Melsunger (ФРГ), Культивирование проводят в непрерывно-проточном режиме по хёмостатному принципу . Для предотвращения вспенивания в среду добавляют силиконовое масло (0,01 %) , Подача среды осуществляется регулируемыми перистальтическими насосами. Коэффициент разбавления ,1-0,05 ч Аэрацию проводят воздухом из расчета один объем в минуту на один объем среды. Скорость вращения мешалки 400 об/мин. Температура среды культивирования . Значение рН среды поддерживают постоянным (6,0) при автоматической подаче И1елочи (0,5 % NaOH)-, Рост культуры измеряют по плотности суспензии. Выходящую из ферментера суспензию клеток охлаждают до 2°С и подвергают сепарирова ию на суперцентрифуге при 2800 об/мин, Отсепариро-. ванные клетки (20 г) суспендируют в 40 1Л 0,1.м фосфатного буфера. (KHjPO - NaOH, рИ-7,5), содержащего 1 мМ дитиотрейтола и разрушают на СР-дезинтеграторе (Швеция) при скорости вреицения мешалки 3000 об/мин в течение 25 мин, Гомогенат центрифугируют в течение 1 ч при 4000 д, Супернатант разводят 0,02 М фосфатным буфером с дитиотрейтолом (1мМ) до 100 мл и используют для ионообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ-г-целлюлозой, уравновешенной .тем же буфером. Элюирование проводят с помощью ступенчатого градиента, получаемого добавлением к исходному буферу NaCi, Препарат алкогольдегидЕхэззеназы элюируется 0,2 М NaCl, В результате ,ионооа 1енной хрсматографии на ДЕАЕ-целлюлозе получают препарат НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы , очищенный в 20 раз и обладающий высокой удельной активностью по метанолу (7100 нм/мг белка мин). П р .и -м ё р 2,Дрожжи Candida methyjica ИБФМ У-670 выращивают согласно примеру 1. В качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентрации 0,01 об. %, После выделения фермента, осуществленного способом , описанным в примере 1, получают препарат НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы , очищенный в 20 раз, с удельной активностью по метанолу 1200 нм/мгбелка-мин. Пример 3.Дрожжи Candida methyAica ИБФМ У-670 выращивают согласно примеру 1. В качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентрации 0,1 об, %, После выделения фермента, осуществленного способом, описанным в примере 1, получают препарат НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы , очищенный в 20 раз, с удельной активностью по метанолу 500 нм/мг белка-мин.

предлагаемый способ позволяет получить НАД-эависимую алкогольдегидрогеназу с высокой метанолокисляющей активностью (в 15 раз выше, чем в известном способе), а также повысить эффективность процесса за счет применения проточных условий культивирования и использования нетоксичного этилового спирта как ,источника углерода.

Формула изобретения Способ получения НАД-зависимой алкогольдегидрогеназы предусматривающий культивиррвание продуцирующих ее Дрожжей при аэрации на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, фосфата, минеральные соли и спирт в качестве источника

угледора, с последующим выделением

целевого продукта, о т л и чаю щ и и с я тем что, с целью повышения метанолокисляющей активности фермента , в качестве продуцента используют дрожжи Candida methyiica. У-670, а. культивирование ведут в проточных УСЛОВИЯХ, при этом в качестве источника углерода используют этиловый спирт в концентЕ ации 0,01-0,1 об. %.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Семискер Я.А., Микельсаар С.К., Хейнару Э,Х. СЯсислёние метанола НАДспецифичной дёгйдрогеназой метанол-. усваивающих дрожжей. - Микробиология ., 19J1, т.46, ВЫП.1, с. 169-171. 2.Metra R.J. Pyridine NucleotideLinked:0xidation of methano L in metanol-assimifating yeastsr Journal of Bacteriology, 1975, 124, № 3, 1165-1Г67.