Рекомбинантная плазмидная ДНК @ 14, кодирующая полипептид, со свойствами лейкоцитарного интерферона @ 2 человека, и штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона @ 2 человека

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к генетической инженерии, и может быть использовано в медицине. Целью изобретения является повышение уровня синтеза интерферона. Получена плаз- мида pIF 14, кодирующая конститутивный синтез полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона человека. Рекомбинантная плазмида pIF 14 содержит тандем синтетических генов интерферона, экспрессия которых происходит путем трансляции по- лицистронной матричной РНК, в которой терминирующий кодон предшествующего цистрона ТАА является частью последовательности Шайн-Далыарно TAAGGA в участке инициации трансляции дистального цистрона. Экспрессия тандема генов интерферона контролируется тандемом конститутивных промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7.. Рекомбинантная плазмидная ДНК pIF 14 состоит из Hindlll/Kpnl- фрагмента ДНК плазмиды pTNF311 содержащего тандем промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7, ген/ -лак- тамазы и терминатор транскрипции фага Я, и Kpnl/Hindlll-фрагмента, содержащего синтетический сайт инициации трансляции и тандем двух искусственных генов лейкоцитарного интерферона человека. Получен штамм Escherichia coli, который обеспечивает высокий уровень биосинтеза лейкоцитарного интерферона а 2 человека (свыше 35% суммарного клеточного белка) при упрощенной технологии его выделения. 2 с.п. ф-лы. (Л С х| О со о ю

Изобретение относится к биотехнологии , в частности к генетической инженерии. и может быть использовано в медицине.

Целью изобретения является повышение уровня синтеза интерферона.

Получена рекомбинантная плазмидная ДНК plF14, кодирующая полипептид со свойствами интерферона человека и характеризующаяся следующими признаками: кодирует аминокислотную последовательность зрелого лейкоцитарного интерферона а 2 человека, имеет молекулярную массу 2,74 МД (4,21 т.п.о), состоит из Hindlll/Kpn - фрагмента ДНК плазмиды pTNF311 Л содержащего тандем промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7, ген /3 -лактамазы и терминатор транскрипции фага Я (3,4 т.п.о), Kpnl/Hindlll- фрагмента, содержащего синтетический сайт инициации трансляции и тандем двух

синтетических генов лейкоцитарного интер- ферона человека (1,05 т.п.о), и содержит тандем двух синтетических генов, в качестве генетического маркера ген / -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой plF14 клеток E.coli к пенициллиновым антибиотикам, уникальные сайты узнавания рестрикцион- ными эндонуклеазами, расположенными на следующих расстояниях вправо от сайта Kpnl:Safl-1041 нуклеотид, Hindlll-1059 нук- леотидов, Ncol-1375 нуклеотидов.

Рекомбинантная плазмида plF14 содержит тандем синтетических генов интерфе- рона, экспрессия которых происходит путем трансляции полицистронной матричной РНК, в которой терминирующий кодон предшествующего цистрона ТАА является частью последовательности Шайн-Дальгар- но TAAGGA в участке инициации трансляции дистального дистрона. Такая организация полицистронной мРНК приводит к сопряжению трансляции цистронов, что делает более эффективным биосинтез белка рибосомой.

Получен штамм - продуцент полипепти- да с биологической активностью лейкоцитарного интерферона человека путем трансформации компетентных клеток E.coli 0 путем плазмидой plF14.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки мелкие, утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные. .

Культуральные признаки. Клетки хорорастут на простых питательных средах. При росте на агаре Дифко колонии круглые , гладкие, прижаты, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте в жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при 4-40°С при оптимуме рН 6,8- 7,0. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме , так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин , углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием плаз- миды, а также к тетрациклину (до 500 мкг/мл) благодаря наличию транспозона.

Штамм E.coli SG20050/plF14 обусловливает конструктивный синтез полипептида

со свойствами интерферона а2 человека на уровне 1,5-2,5-10 МЕ/млклеточной суспензии, что составляет более 35% суммарного клеточного белка бактерий. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВНИИгенетика под номером ВКПМ В- 4788.

П р и м е р 1. Химический синтез олиго0 нуклеотидов.

Синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфорамидитным методом на ДНК-синтезаторе с наращиванием олиго- нуклеотидной цепи в направленииотЗ-кон5 ца к 5 -концу с помощью защищенных фосфамидитов-5 -диметркситоитил-М-ацил- 2 -дезоксинуклеозид-3 -0-(метоксидиизоп- ропиламино)-фосфитов. активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе

0 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 А, размер частиц 40-80 мкм), к которому через 3-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеотидное звено (нагрузка 205 30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл, при этом после реакции конденсации проводят промывку смолы смесью тегра- гидрофурана, пиридина и воды (5:3:2). После окончания синтеза защитные группы

0 удаляют последовательной обработкой тиофенолятом триэтиламмония и концентрированным аммиаком, При этом происходит отделение олигонуклеотида от носителя. 5х-Диметокситритильную груп5 пу удаляют кислотной обработкой и олиго- нуклеотид очищают электрофорезом в 20% ПААГ, содержащем 7 М мочевину. Выход 1-5 о.е.

П р и м е р 2. Конструирование рекомби0 нантной плазмидной ДНК plF225.

Клетки бактерий E.coli HB101, содержащие плазмидную ДНК р6А23, выращивают при 37°С в LB-бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной

5 фазы. Плазмидную ДНК выделяют и высаживают этанолом. Осадок растворяют в ТЕ- буфере, содержащем 1 М NaCI, прибавляют полиэтиленгликоль ПЭГ-6000 до концентрации 1,5%, выдерживают 1 ч при 0°С, цент0 рифугируют 10 мин при 10000 об/мин, осадок промывают 70% этанолом, высушивают и растворяют в ТЕ-буфере.

Выделяют ДНК плазмиды pLeulFt17, содержащей синтетический ген а 2 интерфе5 рона в виде BgPll/Safl-фрагмента. 2 мкг плазмиды р6А23 инкубируют с эндонуклеа- зой рестрикции Hlndlll (10 ед.) в 30 мкл буфера В, содержащего 20 мм трис-HCI. рН 7,5, 50 мМ NaCI, 10 мМ MgCl2, 7 мМ меркаптоэтанол , в течение 1 ч при 37°С. После инкубации реакцию останавливают двухкратной экстракцией смесью фенола и хлороформа (1:1) и ДНК высаживают 70%-ным этанолом. К раствору 0,2 мкг полученного таким образом вектора в 20 мкл буфера А, содержащего 20 мМ трис-HCI, рН 7,5, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ гАТР и 5 мМ дитиотреит, при- бавляют 0,1 мкг олигонуклеотида AGCTTAAGTCGACTTA и 20 ед. Т4 ДНК-лига- зы. Смесь инкубируют 6 ч при 15°С, затем аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е.соМ.

Клетки высевают на агар, содержащий среду М9, 0,2% глюкозы и 2 мкг/мл тиами- на. Единичную колонию вносят в 50 мл питательного бульона LB и выращивают при 37°С до мутности 0,3-0,5. Клетки охлаждают , осаждают центрифугированием (10 мин, 5000 об/мин), промывают раствором 10 мМ MgClz, центрифугируют, суспендируют в 20 мл 0,1 М раствора CaCl2 и выдерживают при 0°С в течение 30 мин. После центрифугирования клетки ресуспендируют в 3 мл 0,1 М CaCla и через 3 ч используют для трансформации. С этой целью 5 мкл лигаз- ной смеси смешиваютс 50 мкл 0,05 М CaCl2, затем прибавляют 150 мкл суспензии компетентных клеток, выдерживают при 0°С, затем 2 мин при 42°С и снова 10 мин при 0°С, после чего прибавляют 1,4 мл LB-бульона, инкубируют 1 ч при 37°С и аликвоту высевают на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин (100 мкг-мл) и хлорамфени- кол (50 мкг/мл). Клоны бактерий, содержащие целевую плазмиду p6A23/SaO, идентифицируют гибридизацией с клонируемым оли- гонуклеотидом 32P-AGCTTAAGTCGACTTA. Из гибридизующихся с этой пробой клонов выделяют плазмидную ДНК, строение которой подтверждают рестриктным анализом с помощью рестриктаз Haflll, Mspl и НаИИ+Saft.

К раствору 10 мкг ДНК плазмиды P6A23/Saf1 в 80 мкл буфера В без NaCf прибавляют 20 ед. каждой из рестрикционных нуклеаз Safl и Kpnl и инкубируют 90 мин при 37°С. Анализ полноты гидролиза и выделение векторного Kpnl/Safl-фрагмента (3,4 т.п,о) проводят при помощи электрофореза в 1%-ном геле легкоплавкой агарозы. Одновременно 10 мкг ДНК плазмиды pLeulFt 17 в 100 мкл буфера В обрабатывают 1,5 ч при 37°С 20 ед. каждой из рестриктаз Bgftl и SaO, после чего фрагмент величиной около 500 п.о., содержащий синтетический ген а 2 интерферона, выделяют при помощи электрофореза в 5%-ном геле.

Далее этот фрагмент (0,2 мкг) соединяют в присутствии дуплекса:

CTAATTTAATTTAAGGATTATCGATATGTGT (I)

CATGGATTAAATTAAATTCCTAATAGCTATAC ACACTAG(II)

с векторной ДНК (1,5 мкг) с помощью 30 ед.

Т4 ДНК лигазы в 50 мкл буфера А в течение 6 ч при 15°С. Десятую часть реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli HB101. Трансформанты высевают на агаризованную среду.

содержащую ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (30 мкг/мл). Скрининг бактериальных клонов, содержащих рекомби- нантную плазмиду plF225, проводят гибридизацией колоний in situ с Р-меченным олигонуклеотидом (I). Из клонов, гибридизующихся с радиоактивной пробой, выделяют плазмидную ДНК plF225, строение которой подтверждают гидролизом ре- стриктазами Mspl и Haelll, а также определением нуклеотидной последовательности в районе вставки синтетического дуплекса

П р и м е р 3. Конструирование рекомби- нантной плазмидной ДНК .

ДНК плазмиды plNF311 Д(10 мкг) гидролизуют совместно эндонуклеазами рестрикции (по 20 ед. каждой) Kpnl и Hindlll в 100 мкл буфера В без NaCf в течение 1.5 ч при 37°С. После инкубации раствор экстрагируют дважды смесью фенола и хлороформа (1:1) и векторный фрагмент величиной 3,17 т.п.о. выделяют электрофорезом в 1%- номагарозном геле. Затем 20 мкг ДНК плазмиды plF225 гидролизуют в 150 мкл того же буфера 2 ч при 37 С смесью рестриктаз Kpnl

и Hindlll (по 30 ед. каждой), после чего выделяют электрофорезом в 5% ПААГ фрагмент величиной около 620 п.о., содержащий синтетические участок инициации трансляции и ген а2 интерферона. После этого лигируют 0,1 мкг этого фрагмента с 0,3 мкг векторного Hindlll/Kpnl-фрагмента в 25 мкл буфера А в присутствии 50 ед. Т4 ДНК-ли- газы. Через 3 ч при 15°С 5 мкл лигазной смеси используют для трансформации

компетентных клеток E.coli НВ 101. Трансформанты высевают на LB-arap. содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Из восьми ампициллиноустойчивых клонов выделяют ДНК и анализируют ее рестриктным анэлизом с помощью рестриктаз Haelll и Mspl. Из проанализированных шести препаратов ДНК показывают нужный набор рестрикт- ных фрагментов. Окончательно структуру рекомбинантной ДНК plF226 подтверждают определением нуклеотмдной последовательности в области сайтов клонирова- ния.

П р и м е р 4. Конструирование рекомби- нантной плазмидной ДНК plF14.

Для приготовления вектора ДНК плаз- ми ды plF226 (10 мкг) обрабатывают в 70 мкл буфера В рестриктазой Xhol (20 ед.) в течение 1 ч при 37°С. Смесь депротеинизируют двухкратной фенольной экстракцией, ДНК высаживают этанолом, промывают в 70%- ным этанолом, высушивают и растворяют в 50 мкл воды. Затем гидролизуют20 мкг ДНК плазмиды p280/21FN в 200 мкл буфера В рестриктазой Xhol (50 ед.) в течение 1 ч при 37°С. Реакцию останавливают прибавлением 0,5 М раствора ЕДТА до концентрации 25 мМ и прогреванием в течение 3 мин при 100°С. Малый Xhol-фрагмент величиной 510 п.о. выделяют при помощи электрофореза в 1,5%-ном геле легкоплавкой агарозы. 0,3 мкг полученного таким образом фрагмента ДНК лигируют в 25 мкл буфера А с 1 мкг векторной ДНК, полученной указанным образом из плазмиды pTN F311 Д с помощью 50 ед. Т4 ДН К-лигазы в течение 6 ч при 15°С. Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli. Трансформанты высевают на чащки с LB-агаром, содержащим ампициллин (100 мкг/мл). Скрининг реком- бинантов проводят, анализируя минипре- параты ДНК, выделенные из отдельных колоний, с помощью рестриктаз Mspl и Haelll по примеру 3. а также анализом клеточных лизатов на содержание интерферо- на по примеру 5.

П р и м е р 5. Получение штамма - продуцента полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферонаа2 человека.

Плазмидой plF14 трансформируют компетентные клетки E.coli SG20050 по методу примера 2 и получают штамм - продуцент полипептида со свойствами интерферона человека. Клетки выращивают при 37°С в 20 мл LB-бульона в течение 20 ч на качалке, отбирают пробу 2 мл и клетки центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин. Содержание рекомбинантного интерферона а 2 определяют тремя способами.

Радиоиммуноанализ.

Клеточный осадок растворяют в 200 мкл раствора 8 М мочевины в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 20 мкг/мл п- метилсульфонилфторида. Перед внесением в лунки пробы центрифугируют в течение 2 мин при 12000 об/мин. Сначала в лунки полистирольного планшета вносят 50 мкл раствора кроличьих антител

(0,2 мкг/мл) против интерферона а 2 в буфере С, содержащем 0,02 М фосфат натрия рН 7.5, 0,15 М NaCC 1 мМ EDTA и 0.1% и инкубируют 1 ч при 20°С. Раствор удаляют из лунок, прибавляют 200 мкл 0,4%-ного раствора бычьего сывороточного альбумина в буфере С (буфер Б) и инкубируют 1 ч при 20°С. После этого лунки тщательно промывак буфером С, затем вносят исследуемые и

0 калибровочные образцы и инкубируют 18 ч при 4°С. После трехкратной промывки 200 мкл буфера Б в лунки вносят раствор меченных J моноклональных антител NK-2 в буфере Ь и инкубируют 6 ч при . Лунки

5 промывают несколько раз буфером С, разрезают и просчитывают на гамма-счетчике. Для построения калибровочных кривых используют высокоочищенный препарат интерферона «2с удельной активностью

0 1.6-10 МЕ/мг. Поданным радиоиммуноа- нализа продуктивность штамма составляет 3.810 МЕ/мл культуры клеток.

Определение биологической активности .

5Клетки суспендируют в 200 мкл буфера, содержащего 0,1 М трис-HCf. рН 7,0, 30 мМ NaCf, 1% SDS, 1% меркаптоэтанола и 5 М мочевины, нагревают 3 мин на кипящей водяной бане и центрифугируют 10 мин при

0 12000 об/мин. Из супернатантов готовят образцы путем последовательных двукратных разбавлений в среде Эрла (начиная с разбавления 1/100). Активность интерферона определяют стандартным способом

5 по ингибированию цитопатического действия вируса везикулярного стоматита надип- лоидные фибробласты человека. В качестве стандарта используют препараты лейкоцитарного интерферона человека, охарактери0 зеванные относительно международного стандарта В 69/19.

По данным определения биологической активности продуктивность штамма E.coli составляет 2,5-10 МЕ/мл культуры клеток.

5 Определение по отношению к суммарному клеточному белку.

Клетки суспендируют 120 мкл буфера, содержащего 125 мМ трис-HCI, рН 6,8, 20% глицерин, 3% SDS, 3% меркаптоэтанол.

0 0,005% бромфеноловый синий, нагревают 10 мин на кипящей водяной бане и охлаждают во льду. Образцы 2,5 и 10 мкл подвергают электрофорезу в 12,5% SDS - ПААГ. По окончании электрофореза гель промывают

5 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты и прокрашивают при помощи кумлсси R-250. После отмывки избытка красителя гель сканируют при 550 нм, используя лазерный сканиметр. По данным сканирования рекомбинантный интерферон а 2 составляет всего белка E.coli.

Таким образом, изобретение позволяет получить полипелтид со свойствами лейкоцитарного интерферона человека, причем уровень его биосинтеза составляет 2,5- 3,8 -107 МЕ/мл культуры клеток, что составляет свыше 35% суммарного клеточного белка E.coli (или 150-200 мг полипептида со свойствами интерферона а2 на 1 л культуры клеток), при этом возможно упрощение технологии его получения за счет исключения стадии индукции биосинтеза белка.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК plF14, кодирующая полипептид со свойствами лейкоцитарного интерферона «2 человека размером 4,21 т.п.о. и молекулярной массой 2.74МД. содержащая:

- Kpnl/Bgftl-Satl/HindIll-фрагмент ДНК плазмиды pLeulFtl с синтетическим геном интерферона размером 0,62 т.п.о.;

- Kpnl-Hindlll-фрагмент ДНК плазмиды pTNF 311 Дразмером 3,17 т.п.о., включающий тандем промоторов А2 и A3 ранней области бактериофага Т7. ген/3 -лактамазы и терминатор транскрипции фага Я;

- Xhol-Xhol-фрагмент ДНК плазмиды, P280/2IFN размером 0,51 т.п.о.;

-уникальные сайты рестрикции, расположенные на следующих расстояниях

вправо от сайта Kpnl:Safl-1041 нуклеотид,

Hlndlll - 1059 нуклеотидов, Ncol - 1375 нуклеотидов;

- ген / -лактамазы, определяющий ус- тойчивость к пенициллиновым антибиотикам;

- тандем двух синтетических генов лейкоцитарного интерферона человека.

2. Штамм бактерий Escherlchla coli ВКПМ В-4788 - продуцент полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона а 2 человека.