[2]Изобретение относится к биотехно-. логин, в частности к генетической инженерии
, и представляет собой pejcoM- бинантную плазмидную ДНК, обуславлит вающую синтез рестриктазы и метилазы
Есо RII, спрсрб конструирования данной рекомбинатной плазмидной ДНК и .
штамм, содержащий эту рекомбинантную плазмиду - продуцент рестриктазы и
[5]Рестрикциониая эНдонуклеаза (рест-
риктаза) Есо RII и ДНК-метиптрансфе-. раза (метилаза) Есо RII широко используются
в научно-исследовательской практике (генетическая инженерия, cтpyктypнo-JlгyнкциoнaльньIй анализ ДНК
[6]изучение белок-нукЛеинового взаимодействия и др.).
[7]Цель изобретения является увеличение содержания рестриктазы и метилазы Есо RII в клетках бактерий.
[8]1. Получена рекомбинантная плазми- да pVKll, обеспечивающая повышенный
синтез рестриктазы и метилазы Есо RI1. 2. Разработан способ конструирования
рекомбинантной плазмиды pVKI1, в которой гены рестриктазы и метнла-
зЫ Есо RII находятся под левым промотором фага лямбда (Р) то обеспечивает
эффективную экспрессию генов рестриктазы и метилазы Есо RII.
[9]3. Получен штамм Escherichig coli ВКМ CR-288D, имеющий более высокий.
[13]уровень синтеза рестриктаэы и мети- .лазы Есо RII по сравнению с нзвестны-
штаммами про дуцентами ферментов Есо RII.,
[14], А, Плазмида pVKII, крднрующая ре-
. стриктазу и метипазу Есо RII состоит из ДИК pLC 2833 (размер которого
2,8 ТПО), содержащего левый проКлетки ,прямые, палочковидной фор
мы (1,2-1,б)х(2,0-6,0) мкм, подвижные , с перитрихиальньми жгутиками, грамотрицатеяьные, неспороносные.
[15]Культуральные признаки.
[16]Кпеткн хорошо,растут на простых
питательных средах..,
[17]При росте на мясо-пептоином ага15
[21]Мотор фага лямбда (Рь); Pet I - фраг- ю Ре, питательном агаре Дифкр коло- мента ДНК плазмиды pVK 33, содержащего
гены рестриктазы н метилазы Есо RII Хрзэ| 1ер котррохп 5 ТПО), и имеет
. уникальные участки рестрикции для зн- . донуклеаз Есо RI, Sal I, Xba I, расположенные
на расстоянии 0,1 ТПО от промотора Р/,; селективные маркеры Ар 1шп J хозяин Escherichia coli.
[22]Б. Для достижения,цели используют способ конструирования плаэмидной
ШК кодирующей рестриктазу и ,мети- лазу Есо RII, заключающийся в том, что плазмидаую ДНК pLG 2833 и ДНК
pVK ЗЭ подвергают совместному гидролизу эндонуклеазой рест рикции Pst I.
Образовавшиеся фрагменты соединяют ДНК лигазой, затем по,лученной смесью
- |рекомбинантных молекул трансформируют клетки Е. coli СбОО (Л). ТрансФорман
ть высевают на среду с -ампи циллином и выросшие колонии проверяют на способность
рестрикзгировать и модифицировать фаг лямбда in vivo. Из отобранных трансформантов вьщеляют плаз-
мидную ДНК, обозначенную как pVK М.
[23]В. -Для достижения цели получен
также штамм бактерий Echerichia coli ВКМ CR-288D - продуцент рестриктазы
И метипазы Eeo.EII. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроор-
анизмов при ИБФМ АН СССР под номером В1да CR-288D,
[24]Штагф - продуцент рестриктазы-и
йетИлазы Е-СО RII получен трансформацией клеток Е. coli В834/рС1857 ппазмидной ДНК pVK 11. Выбор штамма
Е, coli В834(). обусловлен тем, , )что штамм не содержит инте1х11ерирую-
(цих с ферментами Есо RII примесей и |со;5 Р плазмид;у с геном термочувствительного
репрессора сI фага ляйбда. Содержание рестриктазы и метилазы Есо RII в сконструированном штамме
равно 500000 ед. калздЬго фермента на 1 г сырой биомассы клеток.
[25]Штамм Escherlchia coli ВКМ CR - 288D характеризуется следующими признакамиi
[26]1&)рфологические признаки.
[27]НИИ гладкие, круглые, прижатые, блестящие
, серые, с ровными крайми. При росте в жидких средах - мясо-пеп тонном бульоне, питательном бульоне
Дифко образует ровную интенсивную муть. .I
[28]Физиолого-биохимические признаки.
[29]Клетки растут в пределах А - при оптимуме рН 6,8-7,5. В качестве
источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности d-глюкозу,
d-фруктозу, арабинозу, лактозу тре- галозу. Не усваивает ацетат, аданит,
галактозу. В качестве источника азота используют как минеральные соли в
аммонийной и нитратной формах, так и в органической в виде пептона, аминокислот
. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. Индол не образуют. Уреазная активг
ность не обнаруживается.
[30]Устойнивость к антибиотикам.
[31]Проявляют устойчивость к ампицил- лину, обусловпенную наличием плазми,-
ды pVK П, а также к канамицину, обусловленную наличием плазмиды рС 1857.
[32]1Йтамм Е. coli ВКМ CR-288D проявляет иммунитет к фагу лямбда. Продуктивность штамма составляет
500000 ед. каждого фермента на 1 г сырой биомассы.
[33]Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
[35]Клетки бактерий Е. coli, содержащие плазмидную ДНК, выращивают в бульоне Дифко до титра 2x10 кл/мл
Клетки -собирают центрифугированием и из них вьщеляют ДНК. Полученные препараты
ДНК плазмиды pLC 2833 и плаз- миды pVK 33 используют для конструирования плазмиды pVK 11. 2 мкг ДНК
плазмиды pLC 2833 инкубируют с эндог нуклеазой рестрикции Pst I (0,5 е).
Реакцию проводят при 1 ч. 3 мкг ДНК плазмвды pVK 33 расщепляю,т эндонуклеазой
рестрикции Pst I (5 е).
[40]Клетки,прямые, палочковидной фор
мы (1,2-1,б)х(2,0-6,0) мкм, подвижные , с перитрихиальньми жгутиками, грамотрицатеяьные, неспороносные.
[41]Культуральные признаки.
[42]Кпеткн хорошо,растут на простых
питательных средах..,
[43]При росте на мясо-пептоином агаРе , питательном агаре Дифкр коло-
[48]Ре, питательном агаре Дифкр коло-
[49]НИИ гладкие, круглые, прижатые, блестящие , серые, с ровными крайми.
При росте в жидких средах - мясо-пеп- тонном бульоне, питательном бульоне
Дифко образует ровную интенсивную муть. .I
[50]Физиолого-биохимические признаки.
[51]Клетки растут в пределах А - при оптимуме рН 6,8-7,5. В качестве
источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности d-глюкозу,
d-фруктозу, арабинозу, лактозу тре- галозу. Не усваивает ацетат, аданит,
галактозу. В качестве источника азота используют как минеральные соли в
аммонийной и нитратной формах, так и в органической в виде пептона, аминокислот
. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатину не разжижают. . Индол не образуют. Уреазная активг
ность не обнаруживается.
[52]Устойнивость к антибиотикам.
[53]Проявляют устойчивость к ампицил- лину, обусловпенную наличием плазми,-
ды pVK П, а также к канамицину, обусловленную наличием плазмиды рС 1857.
[54]1Йтамм Е. coli ВКМ CR-288D проявляет иммунитет к фагу лямбда. Продуктивность штамма составляет
500000 ед. каждого фермента на 1 г . сырой биомассы.
[55]Изобретение иллюстрируется следующими примерами.
[57]Клетки бактерий Е. coli, содержащие плазмидную ДНК, выращивают в бульоне Дифко до титра 2x10 кл/мл.
Клетки -собирают центрифугированием и из них вьщеляют ДНК. Полученные препараты
ДНК плазмиды pLC 2833 и плаз- миды pVK 33 используют для конструирования плазмиды pVK 11. 2 мкг ДНК
плазмиды pLC 2833 инкубируют с эндог нуклеазой рестрикции Pst I (0,5 е).
Реакцию проводят при 1 ч. 3 мкг ДНК плазмвды pVK 33 расщепляю,т эндонуклеазой
рестрикции Pst I (5 е).
[63]Пробы после инкубации Прогревают при ную как pVK Пи содержащу о в своем
[65]65 С 10 мии. Продукты гидролиза анализируют
электрофорезом в l - HOM ага- роэиом геле.
[66]Соединение фрагментов ДНК плазмид
проводят в буфере для рестрикции с добавлением АТФ и дитиотраитола до
конечной концеитрацииМ и 5 мМ соответственно и дак-лигйзы (10 е).
[67]Реакцию проводят 10-12 ч при IA - , Полученную смесь плазмид используют для трансформации клеток
Е, coli С600 (Л). Клетки Е. coli С600 () вносят в 10 мл питательного бульона и выращивают до титра 1х
х10 клТмл. Клетки собирают центрифугированием (5000 g, 10 мин, ), суспендируют в 10 мл 0,2 М р-ра СаС
и вьздерживают 1 ч при 0°С. Клетки повторно собирают центриЛугированием,
ресуспендируют в 0,3 мл 0,08 М СаС1г () и используют для трансформации.
[68]Смесь лигированньк фрагментов ДНК инкубируют с кле.тками Е. coli В83А/рС1857, обработанными раствором
CaCl, 1 ч при и 10 мин при комнатной температуре (18-20 С). После .десятикратного разбавления суспензии
питательным бульоном трансфорКирован- 30 ныв клетки подращивают 2 ч при 28°С
и высевают на агаризованную среду с ампициллином (50 мкг/мл). Клетки,
[69]составе три фрагмента, кото.рые обра- ауются при гидролизе гшазмидной ДНК
эиДонуклеазой рестрикции Pet I.
[70]Выделенную ДНК pVK 11 трансформируют
в штамм Е. coli В83А/рС1857« Трансформанты отбирают на среде, содержащей ампициллин (50 ) -и
10 канамицин (25 мкг/мл). Плазмида
[71]рС1857 несет термочувствительную мутацию
в гене репрессора CI, Таким об разом можно увеличить транскрипцию, за счет температурных условий культи
|вирования.
[72]Клетки Е. coli В834/рС1857/р ГКП выращивают при 28 С до плотности 2-
4-10 кл/мл, резко повьппают темпера туру до и проводят инкубацию в
течение 4 ч. Клетки собирают центрифугированием , ресуспендируют в буфере
0,01 М калий-фосфат (рН 7,0), 1 мК ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптозтанал; 0,4 мМ Had, разрушают ультразвуком.
После разрушения центрифугируют (100000 Е. 1 ч, ). Бесклеточньй зкстракт используют для определения
ферментативной активности. Акти вност метилазы определяют в реакционтгой
смеси общим объемам 150 мкл, содержащей 40 мМ калий-фосфат (рН 7,8),
1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 20 мкг ДИК К. coli В834, 4 мМ S-аде-
нозила (метил- Н) метионина и 50 мкл
[75]Клетки Е. coli В834/рС1857/р ГКП выращивают при 28 С до плотности 2-
4-10 кл/мл, резко повьппают температуру до и проводят инкубацию в
течение 4 ч. Клетки собирают центрифугированием , ресуспендируют в буфере
0,01 М калий-фосфат (рН 7,0), 1 мК ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптозтанал; 0,4 мМ Had, разрушают ультразвуком.
После разрушения центрифугируют (100000 Е. 1 ч, ). Бесклеточньй зкстракт используют для определения
ферментативной активности. Акти вность метилазы определяют в реакционтгой
смеси общим объемам 150 мкл, содержащей 40 мМ калий-фосфат (рН 7,8),
1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 20 мкг ДИК К. coli В834, 4 мМ S-аде-
нозила (метил- Н) метионина и 50 мкл
[76]выросшие на среде с йнтибиотиками,
[77]проверяют на рестрикцию и модификацию gфермента в различных разведениях.
[78]фага Л системой Eco.RII.Реакцию проводят 1 ч при 37°С,,добавСтепень рестрикции фага Д vir, вы-ляют равный объем 0,75 N натриевой
[79]ращенного на штамме Е. coli СбОО, оп-щелочи, инкубируют 30 мин при 60 С.
[81]ределяют сравнением титра фага при посеве его на штаммы Е. coli СбОО
(А) и Е. coli C600/pVK33 и клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды.
При высеве фага на клоны, содержащие рекомбинантные плазмиды, несущие гены
рестриктазы и метилазы Есо RII, они ограничивают сост фага по сравнению
со штаммом , СбОО (А ) на два порядка , как и на штамме C600/pVK33. Фа-
|ги, выросшие на зтих клонах, содержащих рекомбинантные ДНК, высевают на штам-
мы СбОО () и СбОО/рУКЗЗ. Фаги, выросшие на клонах, содержащих рекомби- нантные плазмиды, aecymjie гены
Есо RII, дают одинаковый титр как на штамме СбОО (Д), так и на штамме C600/PVK33.
[82]Из клеток клонов, обеспечивающих рестрикцию и модификацию фага Лvir, вьщеляют плазмидную ДНК, обозначен
[85]составе три фрагмента, кото.рые обра- ауются при гидролизе гшазмидной ДНК
эиДонуклеазой рестрикции Pet I.
[86]Выделенную ДНК pVK 11 трансформируют
в штамм Е. coli В83А/рС1857« Трансформанты отбирают на среде, со- держащей ампициллин (50 ) -и
канамицин (25 мкг/мл). Плазмида
[87]рС1857 несет термочувствительную мутацию
в гене репрессора CI, Таким образом можно увеличить транскрипцию, за счет температурных условий культи-
|вирования.
[88]Клетки Е. coli В834/рС1857/р ГКП выращивают при 28 С до плотности 2-
4-10 кл/мл, резко повьппают температуру до и проводят инкубацию в
течение 4 ч. Клетки собирают центрифугированием , ресуспендируют в буфере
0,01 М калий-фосфат (рН 7,0), 1 мК ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптозтанал; 0,4 мМ Had, разрушают ультразвуком.
После разрушения центрифугируют (100000 Е. 1 ч, ). Бесклеточньй зкстракт используют для определения
ферментативной активности. Акти вность метилазы определяют в реакционтгой
смеси общим объемам 150 мкл, содержащей 40 мМ калий-фосфат (рН 7,8),
1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 20 мкг ДИК К. coli В834, 4 мМ S-аде-
нозила (метил- Н) метионина и 50 мкл
[91]щелочи, инкубируют 30 мин при 60 С.
[94]Затем к пробам добавляют 2 мл воды и 2 мл 10% трихлоруксусной кислоты.
Осажденную ДНК наносят на стеклово- локнистые фильтры, прбмьшают 0,01 М
НС1 и спиртом. После просушки фильтров считают радиаактивность. За еди-;
ницу активности метилазы Есо RII . - принимают то количество фермента, которое
в указанных условиях включает 1 пкМ CHj - групп в ДНК за 1 ч при . Активность рестриктазы Есо RII
определяют в смеси 20 мМ трис-НС1 (рН 7,5), 10 мМ MgCli, 50 мМ NaCl,
1 мкг ДНК плазмеды pBR 322 (из Е. coli B834/pBR322) и различные развёде-
НИЛ фермента. Реакцию ведут 15 мин . при 37°С. Продукты гидролиза ДНК анализируют
в 1% агаровом геле. За еди- ницу активности принимают то количество фермента рестриктазы Есо RII,
которое необхддимо для полного рас
[96]цепления. I мкг ДНК pBR 322 за 15 мни ог1 репликации плазмиды pBR 3221 се ,-- .. А «« .1- .. - l
[97]при . . Изобретение, no9Bcuuet получить шташ - продуцент pectpuRTadbi и ме- ,
типазы Есо. RII с уровнем синтеаа в этих е{ментов не менее 500000 ед.
каждого на 1 г сырой биомассы клетбк,) что в 10 раз выпю уровни синтеза этих
ферментов в сравйеннн с лучшими из fo .известных штаммов t
[98]Лектичные Маркеры; itran ; хозяин - Escherichia eelI.
[99]2, Способ конструирования плазмид- ной ДНК pVK 11, кодирующей ре стрикта-
зу и метилазу Есо RII, заключающийся в том, что ДНК плазмиды pLC 2833 и/
ДНК плазмиды pVK 33 подвергают гидролизу эндонуклеазой рестрикции Pst 1,
- полученйые Фрагменты смешивают и со- -. единяют ДНК-лигазой, затем смесью ре-
комбинантных мблекул трансформируют
[100]Ф о р мул а N и 3 о. б р е т ё ни я
[101]1,Ч екомбинантная плазмидная ДНК (ук II, кодирующая рестриктазу и ме- тилазу Есо RII, размером 7,8 т,п.о,
содержаща.я ДНК вектора pLC 2833, размером 2,8 т.п.о, с левым промотором
[102].фаги лямбда (Р) Pst Г - фрагмент ДНК плазмиды pVK 33 с геном рестрик- taзы и метнлазы Есо RII размером
5,0 т,п.о.{уникальные участки рестрикции для эндрнуклеаз Есо RI, ХЬа I, Sal 1, расп6Ь: женные на рдс
[103].стоянии О,.4 т,п.о от промотчзра Гц;
[104]ог1 репликации плазмиды pBR 3221 се 1-
.. - l
[105]Лектичные Маркеры; itran ; хозяин - Escherichia eelI.
[107]2, Способ конструирования плазмид- ной ДНК pVK 11, кодирующей ре стрикта-
зу и метилазу Есо RII, заключающийся в том, что ДНК плазмиды pLC 2833 и/
ДНК плазмиды pVK 33 подвергают гидролизу эндонуклеазой рестрикции Pst 1,
полученйые Фрагменты смешивают и со- единяют ДНК-лигазой, затем смесью ре-
комбинантных мблекул трансформируют
[108]1 летки Е. coll СбОО (Л), трансформанты
высевают На среду с амйицшши- ном и выросшие клоны проверяют на
способность рестриктировать и модифицировать фаг лямбда из Клонов, которые
рестриктировали и модифицировали фаг лямбда со специфичностью системы
Есо RII, вьщеляют плазмидную ДНК pVK 11. ,
