[2]Изобретение относится к области медицины, а именно к экспериментальной медицине, и может быть использовано в научных исследованиях в области лечения постнекротического цирроза печени, поиска новых эффективных способов его лечения, а также в ходе биомедицинских исследований лабораторных животных.
[4]В настоящее время достигнут значительный прогресс в изучении патогенеза, диагностики и лечения цирроза печени, однако проблема хронических диффузных заболеваний печени еще далека от разрешения, а многие ее аспекты требуют дальнейшего глубокого изучения. Одним из важных звеньев патогенеза цирроза печени является структурная перестройка долек печени с разобщением портального притока и кавального оттока крови, что приводит к прогрессирующей портальной гипертензии.
[5]Цирроз печени сопровождается нарушениями портального кровотока, развитием портальной гипертензии, приводящей к возникновению портосистемных анастомозов и гипердинамического типа кровообращения (Механизмы адаптации сосудистого русла к гемодинамическим нарушениям при портальной гипертензии / Д.В. Гарбузенко // Вестник РАМН. – 2013. – № 1. – С. 52-57).
[6]При этом портальная гипертензия в своем развитии обгоняет печеночную недостаточность, замыкая порочный круг: каждый эпизод кровотечения из варикозных вен пищевода через гипоксию и всасывание продуктов разложения крови усугубляет печеночную недостаточность. Купирование портальной гипертензии разрывает этот порочный круг, позволяет существенно продлить жизнь пациента и улучшить ее качество. В связи с чем, в настоящее время актуальными являются исследования способов коррекции портальной гипертензии при циррозе печени.
[7]Для лечения портальной гипертензии было предложено несколько методик. Метод снижения портальной гипертензии через создание рубцовых сращений печени, известный как гепатопексия, был предложен Chiari в 1921 году. В России эта методика получила широкую известность после выхода в свет монографии Г.Ф. Николаева (Г.Ф. Николаев. Закрытые повреждения печени. Государственное издательство медицинской литературы. – 1955. – 164 с.), хотя внедрение в практику связано с именем М.В. Алферова (в 1924 г). Авторы предложили использовать эту методику при травмах печени, однако сочли ее применение возможным для снижения портальной гипертензии.
[8]Однако клинический опыт показал недостаточную эффективность гепатопексии.
[9]На сегодняшний день имеются исследования на тему непрямой реваскуляризации различных анатомических областей и органов. К числу непрямых методов реваскуляризации конечностей при облитерирующих заболеваний артерий относят операцию Илизарова-Зусмановича (см. а.с. СССР № 1061803, МПК А61В17/00, опубл. 23.12.1983) и операцию Зусмановича (см. а.с. СССР № 1680092, МПК А61 В17/00, опубл. 30.09.1991). Особую привлекательность в последние годы приобрела операция Зусмановича, так как по её применению имеется наибольшее количество публикаций. Операция Илизарова-Зусмановича более сложна техническому исполнению и для её выполнения требуются аппарат Илизарова и хирургический опыт ортопеда-травматолога. Сосудистые же больные лечатся в общехирургических или специализированных сосудистых отделениях, где не всегда работают подобные специалисты.
[10]Известен способ лазерной реваскуляризации миокарда (см. патент на изобретение РФ №2195345, МПК A61N5/067, опубл. 27.12.2002), включающий подвод импульсов лазерного излучения к сердцу пациента, фокусировку указанного излучения на эпикардиальной поверхности миокарда и формирование канала в миокарде, при этом формируют несквозной канал с использованием импульсного лазерного излучения, генерируемого в областях длин волн 1,05-1,1 и 1,3-3 мкм с энергией в импульсе 0,1-0,2 Дж. Показанием к нему является наличие у пациента хронической ишемии миокарда с кардиосклерозом. Авторами методики было зафиксировано развитие неоангиогенеза в зоне лазерной фенестрации миокарда с улучшением его кровоснабжения.
[11]Известен способ лечения цирроза печени (см. а.с. СССР № 1789230, МПК А61В18/20, опубл. 1993.01.23) путем лазерной реваскуляризации печени и стимуляции регенераторных процессов, в котором для удлинения периода ремиссии обнажают цирротически измененную поверхность печени, создают микроканалы импульсным лазерным излучением мощностью 20 Дж и длительностью импульса 300-400 мс из 10 каналов на 1 см2, зону наружных отверстий лазерных микроканалов обрабатывают плазменным потоком при температуре 37-40°С мощностью 250-300 Вт, затем закрывают на всем протяжении большим сальником в первые трое суток и, начиная с девятых суток после операции, осуществляют лимфосорбцию до нормализации печеночных проб.
[12]Однако способ обеспечивает большую длительность и травматичность операции, и, соответственно, недостаточную эффективность гепатопексии.
[13]Наиболее близким к заявленному решению является способ лазерной фенестрации печени в эксперименте (см. Попова И. А., Изучение лазерной фенестрации печени в эксперименте, Бюллетень медицинских Интернет-конференций, 2011, том 1, №1, стр. 79) путем лазерной реваскуляризации печени, включающий формирование микроканалов в цирротически измененной поверхности печени излучением кварцевого твердотельного лазера с мощностью 7-8 Вт с длиной волны 1,06 мкм. Кварцевым световодом диаметром 600 мкм выполняют сквозные перфорации со снижением мощности.
[14]Однако способ недостаточно эффективен.
[15]Раскрытие сущности изобретения
[16]Технической проблемой заявляемого решения является разработка безопасного способа лазерной непрямой реваскуляризации печени после моделирования цирроза.
[17]Технический результат заключается в увеличении неоангиогенеза при сохранении контуров долек печени.
[18]Технический результат достигается тем, в способе лечения синдрома портальной гипертензии при циррозе печени в эксперименте путем лазерной непрямой реваскуляризации, включающем формирование микроканалов в цирротически измененной печени контактной коагуляцией лазером ближнего инфракрасного диапазона длиной волны 1064 нм, мощьностью 7-8 Вт, согласно решению, под УЗИ контролем формируют несквозные микроканалы глубиной 3 - 4 мм, перекрывая всю пораженную долю печени, за исключением ее ворот, в которые вводят 10000 ед/кг Интерлейкина-2 путем инъекции инсулиновым шприцом.
[19]Краткое описание чертежей
[20]Изобретение поясняется чертежами, где на фиг. 1 - приведены результаты микроскопии препаратов печени после проведенного формирования цироза, окраска: гематоксилин-эозин (с разных ракурсов); на фиг. 2 - изучение лазеркоагуляции в эксперименте in vitro; на фиг. 3 - результаты микроскопии препаратов печени до введения препарата, окраска: гематоксилин-эозин; на фиг. 4 -5 - неоангиогенез сосудистой системы печени по результатам гистологического исследования, окраска по Ван-Гизону; на фиг. 6 - результаты микроскопии препаратов печени после проведенного эксперимента с препаратом интелейкин-2, окраска: гематоксилин-эозин.
[21]Позициями на фигуре 1 обозначены: 1 - здоровая ткань печени; 2 - демаркационная зона; 3 - зона цирроза.
[22]Осуществление изобретения
[23]Способ осуществляется следующим образом.
[24]Исследования проводились на 80 лабораторных крысах-самках породы «стандарт» массой 200±50 г. Все манипуляции и содержание животных было регламентировано этической комиссией ФГБОУ ВО «Саратовского государственного медицинского университета им. В.И. Разумовского» Министерства Здравоохранения Российской Федерации (протокол № 9, 15.09.2023). Условия содержания в виварии лабораторных животных регламентированы РД-АПК 3.10.07.02-09 «Методические рекомендации по содержанию лабораторных животных в вивариях научно-исследовательских институтов и учебных заведений», приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01.04.2016 г. № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики», ГОСТ 33216-2014 «Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными. Правила содержания и ухода за лабораторными грызунами и кроликами» (актуализированным от 01.01.2021).
[25]По стандартной методике проводили общую анестезию лабораторных животных. В асептических условиях выполняли микро-лапаротомию в правом подреберье для обеспечения хирургического доступа к правой доли печени. Моделирование цирроза печени заключалось в интраоперационном введении 0,3-0,5 мл 60 - 79% раствора этанола под глиссонову капсулу в паренхиму печени животного. В дальнейшем морфологическое исследование показало формирование выраженного фиброза паренхимы печени со структурной перестройкой печеночных долек, что является характерным признаком цирроза печени (фиг.1). Благодаря данной методике цирроз моделируется в срок 14 суток от проведения эксперимента у 100% животных и имеет выраженные морфологические (макро- и микроскопические) признаки.
[26]В дальнейшем осуществляли лазерную несквозную фенестрацию зоны цирроза печени под УЗИ контролем (ультразвуковым аппаратом экспертного класса Philips EpiQ7 (США) с линейными датчиками, работающими с частотой 7,5 МГц (Нидерланды). Для этого на измененную область печени воздействовали излучением твердотельного лазера (лазерный аппарат Lasermed 1-10 (Россия), ближнего инфракрасного диапазона) длиной волны 1064 нм, мощностью 7 - 8 Вт (экспериментально подобрана оптимальная мощность 7-8 Вт, до 6 Вт не обеспечивается гемостаз, свыше 10 Вт – происходит чрезмерное разрушение). Кварцевый световод вводили на глубину 3-4 мм (на всю глубину пораженного фрагмента печени). Микроканалы создавались на расстоянии друг от друга 3 мм, перекрывая всю пораженную долю печени, за исключением ее ворот (фиг. 2).
[27]Далее с целью торможения склероза и стимуляции репарации печени вводили рекомбинантный человеческий Интерлейкин-2 (Ронколейкин) в дозировке 10 000 ЕД на 1 кг (стандартная дозировка для крысы) путем инъекции инсулиновым шприцом в зонах лазерной фенестрации. Было проведено сравнение динамики ремоделирования тканей печени в зонах лазерной фенестрации.
[28]При морфологических исследованиях, выполненных на разных сроках течения эксперимента наблюдали формирование микроканалов глубиной 3-4 мм с коагуляционным некрозом – сразу после лазерной фенестрации и затем – в течение первых двух-трех суток. При этом ни в одном наблюдении не наблюдали кровоизлияния в паренхиму печени, что свидетельствовало о безопасности методики. При дальнейшем наблюдении в течение 10-14 дней наблюдали развитие грануляционной ткани в созданных лазером микроканалах с выраженным неоангиогенезом и появлением молодых гепатоцитов в зоне повреждения вне печеночных долек. При сроке наблюдения в течение трех недель и более наблюдали морфологические признаки регенерации печени с восстановлением ее долек.
[29]Для проведения гистологического исследования кусочки печени предварительно фиксировали в 12% формалине, парафинизировали, после чего нарезали на микротоме. Срезы толщиной 6 мкм окрашивались гематоксилином и эозином, а также по Ван-Гизону, для оценки общей гистологической картины цирроза печени, и впоследствии исследовали под микроскопом «Olympus» «BX43F» (Япония).
[30]В ходе гистологического исследования обращало на себя внимание сужение и укорочение соединительнотканных септ и уменьшение функциональных волокон в портальных трактах. Неоангиогенез, обусловленный существенной перестройкой внутриорганной сосудистой системы печени при циррозе в портальных трактах и септах у лабораторных животных, достоверно (p<0,05) увеличился с 7,22±0,15 до 9,23±0,18 в течение 14 дней. Во всех препаратах среди вновь сформированных сосудов регистрировались мелкие артерии (12,9%), вены (30,2%), сосуды микроциркуляторного русла, на долю которых пришлось 62,5%. Также было отмечено сохранение контуров долек печени, которые также можно определить по положению двух структур: триад междолькового уровня, которые находятся на стыке долек, и центральной вены, расположенной в центре каждой дольки. Стенка центральных вен образована одним слоем плоских эндотелиальных клеток и тонкой прослойкой соединительной ткани, в просвете которой отмечается стабильный уровень ферментов, в отличие от предыдущих препаратов, присланных ранее (фиг. 3-5).
[31]В ходе гистологического исследования препаратов при сроке до 21 суток и более – отмечалась регенерация печени с восстановлением долек, формирование хорошей дольчатой структуры ткани, что свидетельствует о восстановлении тканей печени (фиг. 4).
[32]В последствии, с целью торможения склероза и стимуляции репарации печени зон лазерного воздействия с помощью препарата интерлейкин-2, было проведено сравнение динамики ремоделирования тканей печени в зонах лазерной фенестрации.
[33]Животные были разделены на 2 группы: крысам 1-й группы после формирования микроканалов непосредственно в сами микроканалы инсулиновым шприцом в вводили 10.000 ME Интерлейкина-2. Животные 2-й группы – инъекцию не получали.
[34]При дальнейшем наблюдении по истечению 10 суток наблюдали, что у животных 1-й группы, введение препарата приводило к существенной перестройке внутриорганной сосудистой системы печени и следствие - регрессии зоны цирроза (вплоть до полной), сопровождавшееся замещением ее соединительной тканью; отмечалась интенсивная макрофагальная, плазмоцитарная и лимфоцитарная инфильтрация соединительнотканной каймы. Скопление иммунокомпетентных клеток в полости микроканалов и вокруг них предполагает развитие грануляционной ткани в созданных микроканалах с выраженным неоангиогенезом и появлением молодых гепатоцитов в зоне повреждения вне печеночных долек, что позволяет судить об интенсивных межклеточных взаимодействиях в ходе иммунного ответа (фиг. 6).
[35]Преобразование зон лазерного воздействия в печени лабораторных животных через 14 суток (а при введении интерлейкина-2 через 10 суток) в зрелую соединительную ткань с новообразованными мелкими артериями (12,9%), венами (30,2%), и сосудами микроциркуляторного русла, на долю которых пришлось 62,5%, в нашем эксперименте обусловлено комплексным взаимодействием факторов роста и протеолитических ферментов, которые создают необходимые условия для пролиферации и миграции эндотелиальных и гладкомышечных клеток сосудистой стенки и ремоделирования тканей в зонах лазерной фенестрации. Данный факт является отражением повышения уровня активности синтетических процессов в печени после стимуляции регенерации лазерной фенестрации.
[36]Таким образом, при воздействии лазерной фенестрации на цирротически изменённую печень в течение 14 суток (а при использовании препарата Интерлейкин-2 в течение 10 суток) достоверно нарастали проявления обменно-синтетической и пролиферативной активности в паренхиматозных клетках печени, прослеживалась инволюция склеротических изменений в печени к 21-ым суткам после осуществления лазерной реваскуляризации, и, соответственно, достоверно нарастал процесс неоангиогенеза.
[37]Изучение морфологии микроканалов на различных сроках показало, что на ранних сроках – сутки-двое – происходит формирование канала под УЗИ контролем с коагуляционным некрозом и отсутствием кровоизлияния в паренхиму (главное достоинство – безопасность метода); на сроке 10 (при введении препарата Интерлейкин-2) и 14 дней (без введения препарата) – достоверно происходит неоангиогенез и появление молодых гепатоцитов в микроканалах вне печеночных долек; и при сроке 21 сутки и более – регенерация печени с восстановлением долек.
