[1]Изобретение относится к интраназальному противовирусному средству, содержащему рекомбинантный интерферон альфа - 2b и природный индуктор интерферона из дрожжей Saccharomyces cerevisiae в виде лиофилизата для приготовления раствора для интраназального применения, обладающего противовирусными и иммуномодулирующими свойствами для целей профилактики и лечения гриппа и других острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) и может быть использовано в медицине и фармацевтике.
[2]Разработка эффективных противовирусных препаратов на основе веществ, стимулирующих систему естественной (неспецифической) противовирусной устойчивости, по-прежнему актуальна. Это связано с тем, что наряду с несомненными достоинствами применения специфических химиотерапевтических средств, к которым можно отнести направленность воздействия и как следствие, выраженность клинического эффекта, эти средства имеют и ряд недостатков, таких как разнообразные побочные эффекты, быстрое формирование толерантности к вирусным агентам. Поэтому понятен интерес к веществам-регуляторам неспецифической резистентности - интерферонам (ИФН) и их индукторам как потенциальным лекарственным средствам. Среди довольно разнородного класса индукторов ИФН особое место занимают полинуклеотидные комплексы - природные и синтетические двуспиральные РНК (дсРНК). Отличительной особенностью полинуклеотидных индукторов является усиление интерфероногенеза посредством запуска естественных, выработанных в процессе эволюции, механизмов. Эффект дсРНК на клетку осуществляется через Толл-лайк- подобные рецепторы (Toll-like receptors, TLR) 3 типа, расположенные на мембране клетки и в ее цитоплазматическом пространстве [1]. Интерфероны, в свою очередь, запускают экспрессию генов, реализующих противовирусный ответ. К ним относятся гены системы 2'-5'-олигоаденилатсинтетаза (OAS)/PHKa3a L, продукты которых вызывают деградацию вновь синтезируемой в клетке матричной РНК, в том числе вирусной [2], ген протеинкиназы R, которая ингибирует синтез любых (включая вирусные) белков [3], а также гены белков МхА и МхВ, блокирующих транскрипцию вирусной мРНК в клеточном ядре [4, 5]. Вышеперечисленные ферменты являются дсРНК-зависимыми [6], то есть дсРНК являются не только индукторами синтеза ИФН, но и регуляторами его действия.
[3]Встречаются сведения и о прямом воздействии дсРНК на активность противовирусных ферментов [7]. Установлено, что дсРНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae обладает способностью повышать экспрессию генов рецепторных (TLR3) и противовирусных белков (ИФН-α, ИФН-γ, OAS) в макрофагах мышей как в условиях in vitro, так и in vivo, а также доказано наличие у препарата дрожжевой дсРНК адъювантных свойств [8,9].
[4]На основе природных дсРНК создано несколько препаратов для лечения инфекционных заболеваний, таких как Ридостин и его аналоги (Россия), Ларифан (Латвия). В настоящее время разработана интраназальная форма препарата Ридостин, которая позволяет не только увеличить стабильность и биодоступность активного компонента, но и получить препарат, обладающий выраженными противовирусными свойствами в отношении вирусов гриппа A (Aichi/2/68 (H3N2), Bishkek/01/2009 (H1N1pdm09)) [10,11].
[5]Широким спектром действия среди противовирусных препаратов обладают интерфероны. ИФН представляют собой самостоятельную группу цитокинов, общим свойством которой является противовирусная активность. ИФН разных типов регулируют различные иммунные процессы, участвующие в формировании противовирусной защитной реакции: повышают активность естественных киллеров, экспрессию антигенов главного комплекса гистосовместимости, стимулируют фагоцитоз и т.д. [12,13].
[6]Отечественные и зарубежные препараты рекомбинантного интерферона альфа-2b (ИФН-α2b) прочно вошли в арсенал средств лечения инфекционных, онкологических и других заболеваний человека. При этом накоплен значительный клинический материал, свидетельствующий о том, что инъекционное введение ИФН вызывает ряд побочных эффектов: повышение температуры, озноб, головную боль, чувство разбитости, иногда диспептические расстройства, лейко- и тромбоцитопению. В то же время, как показывает клинический опыт, при пероральном и интраназальном применении ИФН можно избежать побочных реакций при сохранении выраженного лечебного эффекта [14].
[7]Среди лекарственных препаратов ИФН, применяемых в клинической практике в нашей стране, можно выделить ряд лекарственных средств для местного применения. Среди них препараты природных ИФН, такие как ИФН человеческий лейкоцитарный, Лейкинферон (смесь подтипов природного ИФН-α в суппозиториях), а также рекомбинантные аналоги: Генферон (ИФН человеческий рекомбинантный альфа-2b в виде интраназальных капель, спрея и свечей); Виферон (ИФН-α2b, мазевая и суппозиторная формы); Реколин (ИФН-α2b, суппозитории); Гриппферон (ИФН-α2b, интраназальные капли); Инфагель (ИФН-α2b, гель для наружного и местного применения) и др. Препараты ИФН в интраназальной форме используют для лечения и профилактики гриппа и ОРВИ [15-17]. Подавляющее большинство лекарственных препаратов для введения в полость носа представлено в виде растворов (капли, спреи) или мягких лекарственных форм, что имеет некоторые недостатки, такие как низкая стабильность раствора при хранении, возможность контаминации и сложность дозировки в случае использования мягких лекарственных форм [18,19].
[8]Известны аналоги [20-26], использующие в качестве основного компонента различные виды интерферонов:
[9]- патент RU 2140285, опубл. 27.10.1999 г. - противовирусное средство-капли в нос на основе интерферона альфа, бета или гамма;
[10]- патент RU 2108804, опубл. 20.04.1998 г. - препарат для лечения и профилактики вирусных заболеваний на основе человеческого лейкоцитарного интерферона;
[11]- патент RU 2201212, опубл. 27.03.2003 г. - суппозитории, обладающие иммуномодулирующим, противовирусным, противобактериальным, регенерирующим, репаративным, мембрано- и гепатопротекторным действием на основе природного интерферона или рекомбинантного интерферона α-, илиβ- и/или γ-типов;
[12]- патент RU 2381812, опубл. 20.02.2010 г. - стабилизированное иммунокорригирующее лекарственное средство для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний с высокой степенью биодоступности, характеризующееся тем, что выполнено в виде суппозиториев и содержит интерферон человеческий рекомбинантный альфа, и/или бета, и/или гамма типов;
[13]- патент RU 2277904, опубл. 20.06.2006 г. - интерферонсодержащая аэрозольная композиция, содержащая интерферон, растворитель и вспомогательные вещества;
[14]- патент RU 2523554, опубл. 20.07.2014 г. - способ защиты организма от инфекции, вызванной штаммами субтипа H1N1 вируса гриппа А, включающий введение в организм препарата альфа-2 интерферона человека, в качестве которого используют «Реаферон ЕС-Липинт»;
[15]- патент RU 2444372, опубл. 10.03.2012 г. - способ лечения острого герпетического стоматита у детей, включающий пероральное введение в организм противовирусного средства и местное нанесение противовирусного препарата в мазевой форме, в качестве которого используют «Реаферон EC - Липинт», полученный включением рекомбинантного альфа-2b интерферона в липосомы.
[16]Как было показано авторами работ [27,28], эффект индуктора интерферона может усиливаться при его сочетанном применении с интерферонами. Повышение интерферониндуцирующих и противовирусных свойств фаговой дсРНК в композиции с ИФН-α2b было продемонстрировано и в ходе исследования [29].
[17]Наиболее близким аналогом (прототипом) данного изобретения по предлагаемой сущности и достигаемому результату является интраназальное средство (патент RU № 2437676, МПК А61К 38/21, опубл. 27.07.2011 г. [30]). Предложенное интраназальное средство представляет собой противовирусное средство, содержащее генно-инженерный интерферон, поливинилпирролидон, предварительно смешанный с гидроксипропилметилцеллюлозой при массовом соотношении 1:1-500, или полиэтиленоксид, предварительно смешанный с гидроксипропилметилцеллюлозой при массовом соотношении 1:1-100, 2%-ный водный раствор L-лизин гидрохлорида, глицерин, антиоксидант и буферную смесь, при следующем содержании компонентов в 1 мл буферной смеси, г: генно-инженерный интерферон, 500-1000000 ME; смесь гидроксипропилметилцеллюлозы с поливинилпирролидоном или с полиэтиленоксидом 0,006-0,17; антиоксидант 0,0001-0,02; 2%-ный водный раствор L-лизин гидрохлорида 0,001-0,2; глицерин 0,001-0,09; буферная смесь - остальное. Кроме того, средство дополнительно содержит антигистаминные препараты, иммуномодуляторы, нестероидные или стероидные противовоспалительные препараты, противоотечные средства, бактерицидные препараты, антимикробные средства, антибиотики, антивирусные препараты, обезболивающие средства и витамины.
[18]Следует отметить, что предложенные в данном патенте композиции имеют ряд недостатков. Каждая описанная композиция представляет собой вязкую смесь сложного состава, которая состоит из смеси интерферонов, индукторов интерферонов в виде готовых лекарственных форм, а не субстанций, с добавлением препаратов с разным фармакологическим действием - противоаллергических, антибактериальных, противовоспалительных, обезболивающих и др.
[19]В составе композиций отсутствуют вещества, способные предотвращать гидролиз индукторов интерферона рибонуклеазами мукозальных поверхностей и обеспечивать ускоренное проникновение действующих веществ через слизистую, что важно для проявления максимального синергидного действия дсРНК и интерферонов [11].
[20]Наличие водой фазы в составе гелей, суспензий вязких растворов для интраназального применения, в том числе, содержащих интерферон, при длительном хранении может приводить к автолизу биологических компонентов противовирусного средства [31].
[21]Сложный состав требует углубленного исследования безопасности композиций. При этом в патенте не приводятся данные о результатах таких исследований, в частности, изучения аллергизирующих свойств; нет данных о побочных эффектах препаратов при их совместном применении. Изучение эффективности противовирусного средства проводились на очень маленькой группе лиц (5 человек) молодого возраста (20-30 лет). Для достижения лечебного эффекта представленных композиций при гриппе и других инфекционных заболеваниях, в соответствии с патентом, требуется его длительное применение (3-4 раза в день по 3 - 4 капли в каждый носовой ход в течение 10 дней).
[22]Технический результат заявляемого изобретения состоит в создании такого интраназального противовирусного средства, которое обеспечивает усиление синтеза интерферона и противовирусного действия препарата за счет синергидного действия индуктора интерферона дсРНК и интерферона в определенном соотношении, а также усиления пенетрации активных компонентов через клеточные мембраны за счет введения в состав средства активатора всасывания.
[23]Указанный технический результат достигается тем, что создана композиция для получения интраназального противовирусного средства в виде лиофилизата, характеризующаяся тем, что содержит диметилсульфоксид (ДМСО), индуктор интерферона, представляющий собой натриевую соль двуспиральной рибонуклеиновой кислоты в виде субстанции, рекомбинантный интерферон альфа-2Ь человека, Трилон Б (ЭДТА), полиэтиленоксид, изотонический раствор натрия хлорида, при соотношении диметилсульфоксида и двуспиральной рибонуклеиновой кислоты (дсРНК) 1:4,52, при следующим количественном содержании компонентов в 1 мл раствора:
[24]| рекомбинантный интерферон альфа-2b | 500-000 ME |
| натриевая соль двуспиральной | |
| рибонуклеиновой кислоты в количестве, | 0,0088-0,0113 г |
| обеспечивающем содержание дсРНК | 0,00226 г |
| диметилсульфоксид | 0,0005 г |
| Трилон Б (ЭДТА) | 0,0005 г |
| полиэтиленоксид | 0,0005 г |
| изотонический раствор натрия хлоридадо | хлоридадо 1 мл |
[25]Оптимальное содержание генно-инженерного интерферона составляет 2500 ME в 1 мл восстановленного раствора.
[26]Средство выполнено в лиофильно высушенном виде.
[27]Интерферон в противовирусном средстве представлен рекомбинантным интерфероном альфа-2b человека, отличающимся высоким уровнем противовирусной активности в отношении широкого спектра вирусов. В качестве индуктора интерферона выбрана субстанция - натриевая соль двуспиральной рибонуклеиновой кислоты киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae, характеризующаяся выраженной способностью усиливать синтез интерферонов первого и второго типов, а также активность ряда других факторов неспецифической устойчивости [32]. Количество субстанции в составе препарата выбрано таким образом, чтобы содержание активного компонента дсРНК составляло 0,00226 г на дозу с учетом содержания дсРНК в субстанции (18-22% в соответствии с ФСП Р № 002021/01-07 04 20090769-08).
[28]В качестве активатора всасывания противовирусное средство содержит диметилсульфоксид (ДМСО), который способен к пенетрации через клеточные мембраны и усиливает действие других, совместно апплицируемых лекарств, что позволяет снизить их концентрацию без потери эффективности. ДМСО обладает также анальгетическим и противовоспалительным действием, умеренным антисептическим и фибринолитическим эффектом, что позволяет заменить в составе лекарственного препарата несколько компонентов симптоматического действия [31,33]. Соотношение ДМСО и дсРНК (1:4,5) определено на основании литературных [34] и собственных экспериментальных данных как оптимальное для получения качественного продукта при лиофилизации.
[29]В качестве антиоксиданта противовирусное средство содержит этилендиаминтетрауксусную кислоту динатриевую соль, которая способна связывать следовые количества ионов двухвалентных металлов, в присутствии которых ускоряются процессы окисления, и тормозить процессы распада дсРНК [31].
[30]В качестве биологически совместимого полимера противовирусное средство содержит полиэтиленоксид, который за счет гидрофильных свойств способствует увеличению контакта лекарственного вещества со слизистой носовой полости и тем самым приводит к увеличению биодоступности и улучшению растворимости лекарства [31].
[31]В качестве стабилизатора средство содержит натрия хлорид 0,9%, который обеспечивает изотоничность раствора для предотвращения нарушения физиологического водно-солевого гомеостаза.
[32]Противовирусное средство обладает пролонгированным действием, за счет чего сокращаются сроки лечения. Кроме того, средство не требует ежедневного приема, как в прототипе, и применяется по 2-3 капли в каждый носовой ход 1 раз в сутки в течение 4-х дней по схеме: в первый, второй и четвертый дни.
[33]Изобретение поясняется следующими графическими материалами, представленными на фиг. 1-3. На фиг. 1 представлена электрофореграмма интраназальной формы препарата, содержащего дсРНК и ИФН-α2b до закладки на хранение (А) и после хранения в течение года при 4-8°С (Б). Электрофорез в 1% геле агарозы, окрашивание этидиум бромидом. Дорожки: 1 - ДНК маркер 1 Kb (ООО «СибЭнзим»); 2 - дсРНК- ИФН-α2b (2500 ME); 3 - субстанция дсРНК (контроль). На фиг. 2 представлены ИК-спектры интраназальной формы препарата, содержащего дсРНК и ИФН-α2b (2500 ME), в сравнении с компонентами препарата, записанные до закладки на хранение (А) и после хранения в течение года при 4-8°С (Б). Обозначения: 1 -композиция дсРНК- ИФН-α2b (2500 ME); 2 - ИФН-α2b; 3 - дсРНК. На фиг. 3 представлены экспериментальные данные, полученные в ходе изучения противовирусной активности препарата на экспериментальной модели гриппозной инфекции у мышей. Приведены графики выживаемости животных, построенные по методу Каплана-Мейера, при заражении штаммом ВГ A/Aichi/2/68 (H3N2) в дозе 10 ЛД50 в контрольной группе и при введении препаратов дсРНК-ИФНα2b (2,5 мг дсРНК и 2500 МЕ/кг) или препарата сравнения Тамифлю.
[34]Сущность изобретения поясняется, но не ограничивается, следующими примерами 1-4.
[35]Пример 1. Получение интраназальной формы препарата.
[36]Интраназальную форму противовирусного средства, содержащего дсРНК и ИФН-α2b, получают смешиванием водного раствора субстанции - натриевой соли дсРНК (ФСП Р № 002021/01-07 04 20090769-08), активатора всасывания ДМСО с раствором рекомбинантного ИФН-α2b человека и вспомогательными компонентами в ламинарной системе КОЧ «Ламинар «С» с соблюдением правил асептики. Раствор композиции стерилизуют фильтрацией, разливают по 1 мл во флаконы из медицинского стекла марки НС-3 по ТУ 64-2-10-87, замораживают при минус 72°С и лиофилизируют в течение 16 ч при (22±2)°С в камере лиофильной сушки «FreeZone» в автоматическом режиме с опцией пневматической укупорки.
[37]Для проведения исследования противовирусной эффективности получают композиции аналогичного состава, содержащие рекомбинантный ИФН-α2b в количестве 500 ME, или 2500МЕ, или 5000 ME на 1 мл.
[38]Пример 1.1. Предлагаемый состав заявляемого препарата при содержании рекомбинантного интерферона альфа - 2b 500 ME на 1 мл буферной смеси:
[39]Рекомбинантный интерферон альфа-2b, ME - 500
[40]Натриевая соль двуспиральной
[41]рибонуклеиновой кислоты, г - 0,0113 (дсРНК, г - 0,00226 г)
[42]Диметилсульфоксид, г - 0,0005
[43]Трилон Б (ЭДТА), г - 0,0005
[44]Полиэтиленоксид, г - 0,0005
[45]Изотонический раствор натрия хлорида - до 1 мл.
[46]Пример 1.2. Предлагаемый состав противовирусного средства при содержании рекомбинантного интерферона альфа - 2b 2500 ME на 1 мл буферной смеси:
[47]Рекомбинантный интерферон альфа-2b, ME - 2500
[48]Натриевая соль двуспиральной
[49]рибонуклеиновой кислоты, г - 0,0113 (дсРНК, г - 0,00226 г)
[50]Диметилсульфоксид, г - 0,0005
[51]Трилон Б (ЭДТА), г - 0,0005
[52]Полиэтиленоксид, г - 0,0005
[53]Изотонический раствор натрия хлорида - до 1 мл.
[54]Пример 1.3. Предлагаемый состав заявляемого препарата при содержании рекомбинантного интерферона альфа - 2b 5000 ME на 1 мл буферной смеси:
[55]Рекомбинантный интерферон альфа-2b, ME - 5000
[56]Натриевая соль двуспиральной
[57]рибонуклеиновой кислоты, г - 0,0113 (дсРНК, г - 0,00226 г)
[58]Диметилсульфоксид, г - 0,0005
[59]Трилон Б (ЭДТА), г - 0,0005
[60]Полиэтиленоксид, г - 0,0005
[61]Изотонический раствор натрия хлорида - до 1 мл.
[62]Пример 2. Оценка физико-химических свойств и стабильности препарата
[63]Подлинность и стабильность структуры дсРНК (наличие индивидуальных L- и М- форм) в композиционном препарате оценивают методом электрофореза в 1%-ном геле агарозы с окрашиванием этидиум бромидом в сравнении с исходным препаратом дсРНК.
[64]ИК-спектры регистрируют на Фурье-спектрофотометре Infralum FT-801 в диапазоне длин волн 4000-500 см-1. Для этого тонкоизмельченный образец тщательно перемешивают в агатовой ступке с порошком KBr (смесь 1% образца и 99% KBr), далее прессуют смеси в пресс-форме. В качестве контроля используют исходные компоненты: Na соль дсРНК, субстанцию ИФН-α2b.
[65]На электрофореграммах, представленных на фиг. 1, на дорожках, соответствующих композиционному препарату (2) и контрольной субстанции (3), ясно визуализируются индивидуальные формы дсРНК (L-форма длиной 4500 п. н., М-форма-1500 п. н.), что подтверждает наличие в составе композиции активного компонента и его интактность. Сравнение электрофореграмм на фиг. 1.А и фиг. 1.Б показывает, что дсРНК в составе лиофилизированной интраназальной формы стабильна при хранении, по меньшей мере, в течение года.
[66]ИК-анализ композиционного препарата в сравнении с его компонентами показал, что спектр композиции имеет те же максимумы поглощения, что и исходные компоненты в области 500-4000 см-1 (фиг. 2А). Спектральные характеристики сохранялись после хранения препарата при 4-8°С в течение года (фиг. 2Б).
[67]Пример 3. Исследование противовирусной активности образцов композиций в культурах клеток
[68]Противовирусную активность заявляемого интраназального средства определяют биологическим микрометодом в 96-луночных планшетах в культуре клеток мышиных фибробластов L-929 и в культуре диплоидных клеток эмбриона легкого человека L-68 по подавлению цитопатического действия тест-вируса в соответствии с ГФ РФ XIV и [35].
[69]Клеточные культуры получены из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. В качестве тест-вируса используют вирус энцефаломиокардита мышей штамм «Колумбия» (вирус ЕМС) в дозе 100 ЦПД50. В качестве испытуемых препаратов используют: композиции, содержащие субстанцию дсРНК в количестве 0,0113 г (0,00226 г дсРНК) и ИФН-α2b в количестве 500 ME (противовирусное средство 1.1), либо 2500МЕ (противовирусное средство 1.2), либо 5000 ME (противовирусное средство 1.3), а также субстанцию Na соли дсРНК (производства ИМБТ ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», Россия) и ИФН-α2b с активностью 6,6×106 МЕ/мл восстановленного раствора (АО «Вектор-Медика», Россия).
[70]Для определения противовирусной активности ИФН на клетках линии L-68 готовят двукратные разведения исследуемых препаратов в среде 199 или Игла MEM, содержащей 2% по объему сыворотки крови плодов коров с добавлением антибиотиков. На каждое разведение используют не менее 4 лунок с клеточным монослоем. Из лунок удаляют среду и вносят по 0,1 мл приготовленных разведенных препаратов, 4 лунки с клеточным монослоем оставляют в качестве контрольных. Кроме того, 16 лунок оставляют для контроля дозы индикаторного вируса (вируса ЕМС). Содержимое лунок инкубируют в течение 1 суток при (37,0±1,0)°С в атмосфере (5,0±0,5) % СО2, после чего в каждую лунку с испытуемыми материалами вносят определенную заранее дозу вируса, соответствующую 100 ТЦД50 в 0,1 мл.
[71]Д ля контроля дозы вируса используют по 4 лунки на каждое разведение вируса, начиная с разведения, соответствующего 100 ТЦД50, до разведения, соответствующего 0,1 ТЦД50, с коэффициентом разведения, равным 10. После внесения индикаторного вируса и титрования его дозы культуру клеток инкубируют при температуре (37,0±1,0)°С в атмосфере с (5,0±0,5) % СО2 на протяжении 1 или 2 суток (срок, когда определена доза вируса для тестирования).
[72]Учет результатов определения противовирусной активности препарата проводят, когда доза внесенного вируса соответствует 100 ТЦД50/0,1 мл. За титр интерферона принимают величину, обратную разведению препарата, при котором клеточный монослой в 50% лунок оказался полностью защищенным от цитопатического действия вируса.
[73]Противовирусную (интерферониндуцирующую) активность дсРНК определяют в сыворотке крови мышей, полученной через 5 часов после введения композиционного препарата, титрованием на культуре клеток L929.
[74]В каждую лунку 96-луночных полистироловых планшетов с плоским дном вносят по 0,1 мл суспензии клеток в среде 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота в концентрации 300 000 клеток в 1 мл и инкубируют в СО2-инкубаторе при температуре 37°С в течение 24 ч. По завершении инкубации культуральную жидкость удаляют, а образовавшийся монослой клеток используют для определения цитопатической дозы (ЦПД50) вируса и титра интерферона. ЦПД50 соответствует дозе вируса, вызывающей деструкцию клеточных культур в 50% лунок. Для определения титра интерферона в лунки с клетками вносят двукратные разведения сывороток мышей. Планшеты инкубируют в течение 18 - 24 ч при температуре 37°С в CO2-инкубаторе. Затем сыворотки удаляют и в каждую лунку вносят по 100 ЦПД50 тест-вируса в 0,1 мл среды 199. Цитопатическое действие вируса на монослой клеток определяют спустя 24 ч инкубации при температуре 37°С в CO2-инкубаторе. За титр интерферона принимают величину, обратную наибольшему разведению сыворотки, обеспечивающему 50% защиту клеточных культур от цитопатического действия 100 ЦПД50тест-вируса.
[75]Экспериментальные данные, полученные на культуре клеток L929, свидетельствуют о том, что все исследованные композиции проявляли способность индуцировать синтез интерферона, более выраженную, чем у препарата сравнения дсРНК. При этом активность композиций дозозависимо возрастала при увеличении в препарате дозы ИФН-α2b (таблица 1).
[76]В ходе исследования, проведенного на культуре клеток L-68, показано зависимое от дозы повышение противовирусной активности ИФН-α2b в составе композиций с дсРНК (таблица 1).
[77]Полученные данные подтверждают сохранность противовирусных свойств дсРНК и ИФН-α2b в составе интраназальных композиций, а также свидетельствуют о синергидном действии компонентов в составе композиционного препарата.
[78]
[79]Пример 4. Исследование противовирусной активности композиций на экспериментальной гриппозной модели
[80]Противовирусную активность in vivo оценивают на мышах аутбредной популяции ICR обоего пола, 5-недельного возраста, массой 14-17 г. Адаптированный к мышам вирус гриппа (ВГ) A/Aichi/2/68 (H3N2) вводят анестезированным мышам интраназально в дозе 10 ЛД50 в объеме 40 мкл суммарно в обе ноздри.
[81]Для оценки противовирусной активности препаратов животных распределяют на 9 экспериментальных групп случайным образом, по 10 особей в группе.
[82]Животным первой, второй и третьей опытных групп интраназально вводят заявляемое противовирусное средство 1 (пример 1.1), противовирусное средство 2 (пример 1.2), противовирусное средство 3 (пример 1.3), соответственно. Доза индуктора интерферона в составе заявляемых противовирусных средств составляет 2,5 мг/кг (50 мкг на мышь) по дсРНК; доза ИФН-α2b при введении в составе противовирусного средства 1 - 500 МЕ/кг, противовирусного средства 2 - 2500 МЕ/кг, противовирусного средства 3 - 5000 МЕ/кг (10 ME; 50 ME и 500 ME на мышь, соответственно). Животные четвертой группы (группа сравнения) получают интраназально раствор субстанции дсРНК в дозе 2,5 мг/кг (по дсРНК). Субстанцию ИФН-α2b вводят мышам пятой, шестой и седьмой групп сравнения в дозах 500 МЕ/кг, 2500 МЕ/кг или 5000 МЕ/кг, соответственно. Заявляемые противовирусные средства и препараты сравнения вводят интраназально за 3 ч до заражения ВГ, через 1 и 3 сут после заражения в объеме 20 мкл/мышь суммарно.
[83]Положительным контролем является противовирусный препарат Тамифлю (Ля Рош Лтд., Швейцария), который вводят мышам восьмой группы перорально в дозе 15 мг/кг через 1 ч после заражения ВГ и далее дважды в сутки в течение 4 сут после заражения. Животные, инфицированные ВГ и не получавшие препаратов, составляют группу отрицательного контроля (группа 9).
[84]Противовирусную активность препаратов оценивают по показателю гибели животных в течение 16 суток наблюдения после заражения ВГ, рассчитывают коэффициент защиты (КЗ) и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) мышей. За максимальное значение продолжительности жизни для выживших животных принимают 16 суток после заражения ВГ, то есть гарантированное время прекращения гибели инфицированных мышей.
[85]Статистическую обработку и сравнение данных, полученных при изучении противовирусной активности препаратов, осуществляют с помощью пакета компьютерных программ анализа данных «Statistica 12». Для проверки статистических гипотез о виде распределения показателей применяют критерий Колмогорова-Смирнова при вероятности ошибки р>0,10. СПЖ представляют в виде M±Sm, где М - среднее арифметическое значение и Sm -стандартное отклонение. Сравнение СПЖ мышей в разных группах проводят с использованием U-критерия Манна-Уитни. Для оценки межгрупповых различий доли выживших животных используют критерий χ2 с учетом поправки Йетса для малых выборок. Различия показателей выживаемости животных оценивают с помощью кривых Каплана-Мейера по логранговому критерию в компьютерной программе анализа данных «Statistica 12». Отличия считаются статистически значимыми при р≤0,05.
[86]
[87]Примечание:λ - доза индуктора интерферона представлена в дозе по двуспиральной РНК (дсРНК); n - число животных в каждой группе; и/н -интраназально; п/о - перорально; д/з - до заражения; п/з - после заражения; н/в - препараты не вводят; н/о - показатель не определяют; К3-коэффициент защиты (рассчитывают по формуле: К3 = % гибели в контроле - % гибели в опыте); СПЖ - средняя продолжительность жизни (за максимальный срок жизни выживших животных принимают 16 сут, эмпирически установленное, гарантированное время прекращения гибели инфицированных ВГ мышей); * - отличие от контроля по критерию χ2 при р≤0,05; 2 - отличие от Тамифлю по критерию χ2 при р≤0,05; ** - отличие от контроля по U-критерию Манна-Уитни при р≤0,05;## - отличие от Тамифлю по U-критерию Манна-Уитни при р≤0,05; М - среднее арифметическое значение, Sm -стандартное отклонение.
[88]Введение мышам заявляемого противовирусного средства 2 по примеру 1.2 по лечебно-профилактической схеме обеспечивало защиту 50% инфицированных животных при увеличении средней продолжительности жизни в 2 раза по сравнению с контрольной группой (таблица 2). Показатели выживаемости мышей этой группы статистически не отличались от показателей животных группы сравнения «Тамифлю».
[89]Количество выживших животных, которым вводили противовирусное средство 1, значимо не отличалось от показателей мышей с введением Тамифлю, однако средняя продолжительность жизни мышей этой группы была в 1,58 раза меньше, чем в группе «Тамифлю» (различия статистически значимы, р≤0,05) (таблица 2).
[90]В группе мышей, которым вводили противовирусное средство 3 к концу срока наблюдения выжило всего 1 животное из 10. Введение субстанции дсРНК или ИФН-альфа-2b не обеспечивало защиты инфицированных мышей.
[91]Анализ графиков выживаемости, построенных по методу Каплана-Мейера, представленных на фиг. 3, выявляет значимые отличия между контрольной группой мышей, инфицированных штаммом ВГ A/Aichi/2/68 (H3N2) в дозе 10 ЛД50, и группами инфицированных мышей, получавших Тамифлю (р=0,00039) и противовирусное средство 2 (пример 1.2) (р=0,00326).
[92]Таким образом, в результате экспериментального изучения на мышах показано, что противовирусное средство, содержащее индуктор интерферона дсРНК в виде субстанции в количестве 0,0113 г (0,00226 г по дсРНК) и ИФН-α2b в количестве 2500 ME на дозу, при трехкратном интраназальном введении мышам в дозе (2,5 мг дсРНК и 2500 ME ИФН-α2b)/кг проявляет выраженную противовирусную активность в отношении ВГ A/Aichi/2/68 (H3N2), чего не наблюдается после введения других противовирусных средств и компонентов композиции.
[93]Источники научно-технической и патентной информации
[94]1. Matsumoto М., Takeda Y., Tatematsu М., Seya Т. Toll-like receptor 3 signal in dendritic cells benefits cancer immunotherapy // Front. Immunol. - 2017. - Vol.8.-Article: 1897. doi: 10.3389/fimmu.2017.01897
[95]2. Silverman R.H. Viral encounters with 2', 5'-oligoadenylate synthetase and RNase L during the interferon antiviral response // J. Virol. - 2007. - Vol. 81, No. 23. - P. 12720-12729. doi: 10.1128/JVI.01471-07
[96]3. Zhang P., Samuel CE. The RNA-activated protein kinase enhances the induction of interferon-P and apoptosis mediated by cytoplasmic RNA sensors // J. Virol. - 2007. - Vol. 81. - P. 8192-8200. doi: 10.1074/jbc.M807888200
[97]4. Saxena A., Belwal K., Chauhan A., Pande A. Interferon induced Mx protein from Indian snow trout Schizothorax richardsonii (Gray) lacks critical functional features unlike its mammalian homologues // Comput. Biol. Chem. - 2018. - Vol. 73. - P. 31-40. doi: 10.1016/j.compbiolchem.2017.12.011
[98]5. Sasaki K., Yoneda A., Ninomiya A., Kawahara M., Watanabe T. Both antiviral activity and intracellular localization of chicken Mx protein depend on a polymorphism at amino acid position 631 // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2013.-Vol.430, No. 1. - P. 161-166. doi: 10.1016/j.bbrc.2012.11.053 6. Gantier M.P., Williams B.R. The response of mammalian cells to double-stranded RNA // Cytokine Growth Factor Rev. - 2007. - Vol. 18, No. 5-6. - P. 363-371. doi: 10.1016/j. cytogfr. 2007.06.016
[99]7. Calderon B.M., Conn G.L. A human cellular noncoding RNA activates the antiviral protein 2-5-oligoadenylate synthetase 1 // J. Biol. Chem. - 2018. - Vol. 293, No. 41. - P. 16115-16124. doi: 10.1074/jbc.RA1 18.004747
[100]8. Батенева A.B., Гамалей С.Г., Лебедев Л.Р. Даниленко Е.Д. Стимулирующее влияние дрожжевой двуспиральной РНК на активность генов белков системы интерферона // Медицинская иммунология. - 2020. - Т. 22, № 6. - С. 11555-1162. doi: 10.15789/1563-0625-SEO-2082
[101]9. Каплина О.Н., Гамалей С.Г., Иванова О.С., Даниленко Е.Д. Двуспиральные РНК - перспективные адъюванты для повышения иммуногенности вакцин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2022. - Т. 99, №6. - С. 661-668. doi: 10.36233/0372-9311-342
[102]10. Иванова О.С., Левагина Г.М., Батенева А.В., Гамалей С.Г., Богрянцева М.П., Даниленко Е.Д. Получение и исследование физико-химических и биологических свойств интраназальных форм аналога интерферона гамма человека // Цитокины и воспаление. - 2019. - Т. 18. №1-4. - С. 97-103.
[103]11. Иванова О.С., Левагина Г.М., Скарнович М.О., Скарнович М.А., Шишкина Л.Н., Гамалей С.Г., Даниленко Е.Д. Получение и характеристика препарата двуспиральной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae для интраназального применения // Биофарм. журн. - 2019. - Т. 11 №4. - С. 29-33. EDN: BZIJHI
[104]12. Казмирчук Е.В., Ковальчук Л.В., Мальцев Д.В. Клиническая иммунология и аллергология с возрастными особенностями. - Киев: ВСИ «Медицина», 2012. -519 с.
[105]13. Ярилин А.А. Иммунология. - М.: ГЭОТАР - Медиа, 2010. - 749 с.
[106]14. Шумилов В.И., Шевцов В.А., Лобов СП. // Лечащий врач. - 2000. - № 9. - С. 20-21.
[107]15. Ершов Ф.И., Наровлянский А.Н. // Вопр. вирусол. - 2018. - Т. 63, № 1. - С. 10-18.
[108]16. Рафальский В.В. Клиническое применение препаратов интерферона. - Смоленск, 2002. - 245 с.
[109]17. Киселев О.И., Ершов Ф.И., Деева Э.Г. Интерферон-гамма: новый цитокин в клинической практике. ИНГ АРОН. - М.: Димитрэйд График Групп, 2007. -348 с.
[110]18. Ищенко, В.И. Промышленная технология лекарственных средств: [учебное пособие] / В.И. Ищенко; Министерство здравоохранения Республики Беларусь, Витебский государственный медицинский университет.- 2-е изд. - Витебск: [ВГМУ], 2012. - 567 с.
[111]19. Nakamura F., Ohta R., Machida Y., Nagai T. In vitro and in vivo nasal mucoadhesion of some water-soluble polymers // Int. J.Pharm. - 1996. - Vol. 134. - P. 17-81.
[112]20. Патент RU 2140285 C1, 1999.10.27.
[113]21. Патент RU 2108804 C1, 1998.04.20.
[114]22. Патент RU 2201212 C1, 2003.03.27.
[115]23. Патент RU 2381812 С1, 2010.02.20.
[116]24. Патент RU 2277904 C1, 2004.05.05.
[117]25. Патент RU 2 523 554 CI, 2013.03.27.
[118]26. Патент RU 2444372 C1, 2010.02.10.
[119]27. Pantelic L., Sivakumaran H., Urosevic N. Differential induction of antiviral effects against West Nile virus in primary mouse macrophages derived from flavivirus-susceptible and congenic resistant mice by alpha/beta interferon and poly(i-c) // J. Virol. - 2005. - Vol. 79, No. 3. - P. 1753-1764. doi: 10.1128/JVI.79.3.1753-1764.2005
[120]28. Morrey J.D., Day C.W., Julander J.G., Wang H., Smee D.F., Christensen A.J., Furuta Y. Effect of interferon-alpha and interferon-inducers on West Nile virus in mouse and hamster animal models // Antivir. Chem. Chemother. - 2004. - Vol. 15, No. 2. - P. 101-109. doi: 10.1177/095632020401500202
[121]29. Сысоева Г.М., Батенева A.B., Гамалей С.Г., Лебедев Л.Р., Даниленко Е.Д. Исследование иммуномодулирующих свойств композиционного препарата дсРНК фага ϕ6 и ИФН-альфа-2b // Рос. иммунол. журн. - 2016. - Т. 10 (19), № 2(1).-С. 454-456.
[122]30. Патент RU 2437676 С1, 2011.07.27 (прототип).
[123]31.Мурашкина И.А, Гордеева В.В. / Вспомогательные вещества в фармацевтической технологии. - Иркутск: ИГМУ, 2018. - 64 с.
[124]32. Даниленко Е.Д., Белкина А.О., Сысоева Г.М. Создание лекарственных препаратов на основе высокополимерных двуспиральных РНК для противовирусной и противоопухолевой терапии // Биомед. химия. - 2019. - Т. 65, № 4. - С. 277-293. doi: 10.18097/РВМС20196504277
[125]33. Абрамова С.Принципы выбора назальных деконгестантов // Фармацевтический вестник. - 2015. - № 27. - [Электронный ресурс]. - Режим доступа: https://pharmvestnik.ru/articles/printsipy-vybora-nazaljnyx-dekongestantov.html
[126]34. Кукушкин Ю.Н. Диметилсульфоксид - важнейший апротонный растворитель // Соросовский образовательный журнал. - 1997. - Т. 3, № 9. - С. 54-59.
[127]35. Порываев В.Д., Рыжиков А.Б., Булычев Л.Е., Гончарова Е.П., Плясунов И.В., Алексеева А.Г., Карпышев Н.Н. Усиление катионными липосомами противовирусного и интерфероногенного действия индуктора интерферона ридостина in vitro и при интраназальном применении // Вопр. вирусологии. - 2003, № 4. - С. 45-47. EDN: OIWCYT.
