МИКРОБНАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ВКЛЮЧАЮЩАЯ МОЛОЧНОКИСЛЫЕ БАКТЕРИИ, ДРОЖЖИ И МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ГРИБЫ, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ ПЕРЕРАБОТКИ ОРГАНИЧЕСКИХ ОТХОДОВ РАСТИТЕЛЬНОГО И ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Микробная композиция, включающая молочнокислые бактерии Lactobacillus parabuchneri ВКМ В-3553D, Lactobacillus plantarum ВКМ В-3552D, Lactobacillus acidophilus ВКМ В-3563D, Enterococcus faecium ВКМ В -3551D, дрожжи Brettanomyces bruxellensis ВКМ Y-3064D и микроскопические грибы Penicillium chrysogenum ВКМ F-4934D или Penicillium chrysogenum ВКМ F-4935D, используемая для переработки органических отходов животного и растительного происхождения.

Изобретение относится к промышленной и сельскохозяйственной микробиологии, биотехнологии. Данная разработка предназначена для утилизации отходов и перевода их в 3-й класс опасности, а также переработки органических отходов в компост и/или органические удобрения. Микробный консорциум подавляет болезнетворные микроорганизмы, как кишечные, так и фитопатогенные; снижает всхожесть семян сорных растений, находящихся в компостируемой массе; подавляет гельминты и яйца синантропных мух как в лагунах, так и компостах; повышает содержание элементов питания (NPK и микроэлементов) в компостируемой массе. Регулярное использование микробного консорциума на промышленных предприятиях приводит к уменьшению площадей для переработки твердых отходов и уменьшению количества или объема лагун для жидких отходов. Также, при использовании микробного консорциума устранение неприятного запаха органических отходов происходит в течение 3-10 дней. Применение микробного консорциума приводит к уменьшению срока переработки отходов животноводства до 40-60 дней, утилизация стерни возможна за период 30-45 дней даже при засушливых погодных условиях.

Таким образом, микробный консорциум находит свое применение для переработки жидких и твердых органических отходов:

• животноводства: навоза КРС, свиного навоза, птичьего помета,

• отходы переработки продуктов питания: мясо- и рыбоперерабатывающего производства, выжимки фруктов и ягод, остатки виноделия,

• коммунальных предприятий: осадков сточных вод, органической составляющей ТБО, опавшие листья, скошенная газонная трава,

• производственные отходы: деревоперерабатывающей промышленности, бумага, картон, опилки, кора,

• растительные остатки: сидерат, солома, сено, скорлупа различных видов орехов,

• отходы эфиромасличной промышленности (кориандр, шалфей, лаванда),

• пищевые отходы: колбасные и мясные изделия, пищевые продукты, вышедшие за сроки годности.

Известно, что при совместном культивировании молочнокислых бактерий с другими микроорганизмами, усиливается рост и повышается биохимическая активность консорциума. Описан усиленный биосинтез витамина В₁₂ пропионово-кислыми бактериями в присутствии молочнокислых бактерий. При хранении в лабораторных условиях некоторые актиномицеты теряют способность синтезировать антибиотики, но она может быть восстановлена при совместном их культивировании с микромицетами из рода Pénicillium. При совместном культивировании актиномицетов (Actinomyces violocinereus, Act. rimosus и др.) биосинтез протеолитических ферментов, в том числе и экзопротеаз тромболитического действия, увеличивается до 6 раз по сравнению с биосинтезом этих ферментов монокультурами.

Различные виды дрожжей селективно используют питательные компоненты среды. Правильным подбором культур, возможно создать устойчивую ассоциацию, которая более полно может использовать многокомпонентную по источнику углерода среду, усиливать скорость роста клеток и повышать продуктивность системы при непрерывном культивировании.

С помощью микробных ассоциаций дрожжей и молочнокислых бактерий, можно получать белково-витаминные препараты из молочной сыворотки, содержащей лактозу, причем оказалось возможным использовать такие дрожжевые культуры, которые в обычных условиях не ассимилируют лактозу.

Молочнокислые бактерии обладают высокой антимикробной активностью по отношению к фитопатогенным и кишечным болезнетворным микроорганизмам, обусловленной биосинтезом низкомолекулярных веществ (перекиси водорода), органических кислот (преимущественно молочной и уксусной) и бактериоцинов. Также, молочнокислые бактерии и дрожжи колонизируя корни растений, перекрывают сайты адгезии для болезнетворных микроорганизмов, что является еще одним механизмом противостояния фитопатогенам. Молочнокислые бактерии и дрожжи, используя триптофан, содержащийся в экссудатах растений, синтезируют ауксинподобные вещества, которые стимулируют рост растений.

Микроскопические грибы обладают высокой ферментативной активностью, способны разлагать древесину, лигнин, хитин и другие биополимеры растений и животных, разлагать ароматические соединения, содержащиеся в промышленных отходах, углеводороды и их производные.

Известен биопрепарат из эффективных микроорганизмов для деградации органических отходов (патент РФ на изобретение №2347808, дата начала отсчета срока действия патента 06.08.2007), содержащий смесь суспензий бактерий родов Bacillus и смесь суспензий штаммов родов Pseudomonas, Enterobacter, Cellulomonas, Erwinia, Arthrobacter, Streptococcus, Propionibacterium при следующем эффективном составе и соотношении компонентов, мас. %:

Известен препарат для переработки органических отходов животноводства и птицеводства "ЭКОС" (патент РФ на изобретение №2425016, дата начала отсчета срока действия патента 28.03.2008), содержащий микроорганизмы, в качестве штаммов микроорганизмов он содержит Actinomyces fradiae-96, Bacillus subtilis-99 и физиологический раствор при следующем соотношении компонентов, об. %:

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является микробная композиция для переработки органических отходов быта человека, животноводства и птицеводства (патент РФ на изобретение №2609654, дата начала отсчета срока действия патента 12.05.2016), содержащая микроорганизмы Delftia lacustris BMCH-IB-C 142 ВКМ B-3032D, Cellulomonas persica BMCH-IB-C 35 ВКМ Ac-2727D, Rhodococcus qingshengii BMCH-IB-ONF 10 BKM Ac-2728D, Rhizobium nepotumBMCH-IB-ONF 5 BKM B-3028D, Bacillus subtilis BMCH-IB-ONF 14 BKM B-3029D, Paenibacillus endophyticus BMCH-IB-ONF 7 BKM B-3030D, Lactobacillus sp.BMCH-IB-M 3 BKM B-3031D, Bifidobacterium bifidum BMCH-IB-M 4 BKM Ac-2729D при следующем соотношении компонентов, мас. %:

Существенным недостатком перечисленных препаратов является небольшой срок годности и низкая эффективность.

Целью настоящего изобретения является получение микробной композиции, микроорганизмы которой способны к стабильному биосинтезу ферментов, органических кислот, спиртов, обеспечивая высокую скорость разложения органических остатков и подавление болезнетворных микроорганизмов и фитопатогенных бактерий и грибов.

Указанный технический результат достигается микробной композицией, содержащей следующие группы микроорганизмов: молочнокислые бактерии, дрожжевые и микроскопические грибы.

Lactobacillus parabuchneri 6 (регистрационный номер B-3553D),

Lactobacillus plantarum 20 (регистрационный номер ВКМ B-3552D),

Lactobacillus acidophilus 22 (регистрационный номер ВКМ B-3563D),

Enterococcus faecium 4/6 (регистрационный номер BKMB-3551D),

Brettanomyces bruxellensis 75 (регистрационный номер ВКМ -Y3064D),

Penicillium chrysogenum GR150323 (регистрационный номер ВКМ F-4935D),

Penicillium chrysogenum GR160323 (регистрационный номер BKM F-4934D).

Культурально-морфологические характеристики микроскопических грибов

Penicillium chrysogenum GR 150323 (регистрационный номер BKM F-4935D)

Штамм получен в результате многоступенчатого селекционного отбора из штамма Penicillium chrysogenum. Место выделения - хвойный лес, г. Севастополь.

При культивировании на среде Чапека (25°С, 7 суток): колонии плоские, приподнятые в центре; край колонии слабоволнистый; диаметром 2,5 см; субстратный и надсубстратный мицелии ярко выражены; воздушный мицелий в центре желтовато-кремового цвета, край - белый; оборот бесцветный; экссудат прозрачный, капли редкие и мелкие; пигмента нет; спороношение обильное, светлых оттенков от светло-бежевого до зеленоватого, по мере старения культуры темнеет до темных оттенков коричнево-зеленый.

При культивировании на среде Чапека, 37°С, 7 суток: роста нет, при культивировании на среде Чапека, 5°С, 7 суток: формируются микроколонии; 14 суток - колонии диаметром 3 мм, спороношение присутствует.

При культивировании на среде Чапека с дрожжевым экстрактом (25°С, 7 суток) колонии плоские, бархатистые, в центре слабо выраженная выпуклость, с намеченной радиальной складчатостью; край колонии ровный, диаметр колоний 4,0-4,4 см; субстратный и надсубстратный мицелии ярко выражены; воздушный мицелий белый с бежевым оттенком, оборот от бесцветного до светло-коричневого; экссудат присутствует, редкие капли от прозрачного до светло-желтого цвета; спороношение обильное, голубовато-зеленого цвета, по мере старения культуры становится более темного зеленого цвета.

При культивировании на мальт-экстракт агаре (25°С, 7 суток): колонии, плоские немного приподнятые в центре, ровные, край колонии фестончато-волнистый; диаметр колонии 3 см; субстратный и надсубстратный мицелий хорошо выражены; мицелий белый в краевой зоне; оборот бесцветный, от прозрачного до светло-бежевого; спороношение обильное, голубо-зеленое, по мере старения культуры темнеет до темно-зеленого; эксудат и пигмент не образуется.

Среда Чапека с дрожжевым экстрактом (25°С, 7 суток): субстратный и надсубстратный мицелий хорошо развиты: конидиеносцы длиной 150-300 мкм, гладкие; кисточки преимущественно 2-х-ярусные с дополнительными веточками, реже встречаются 3-ярусные; веточки длиной 12-26 мкм, единичные до 30-42, часто растопыренные; метулы прижатые, 10-16 мкм; фиалиды кеглевидные с выраженным коротким носиком, плотно расположенные, длина 8-10 мкм; конидии гиалиновые, гладкие, субокруглой формы, диаметром 3,4-4,0 мкм, образуются в плотных колонках средней длины по стеригмам.

Молекулярные особенности штамма: Последовательность участка гена β-тубулина (BenA):

Penicillium chrysogenum GR160323 (регистрационный номер ВКМ F-4934D)

Штамм получен в результате многоступенчатого селекционного отбора из штамма Penicillium chrysogenum. Место выделения - хвойный лес, г. Севастополь.

При культивировании на среде Чапека (25°С, 7 суток) колонии плоские, приподнятые в центре, поверхность бархатистая; край колонии слабоволнистый, диаметр на 7 сутки 2,5-2,8 см, на 14 сутки до 3,5-4 см. Субстратный гиалиновый и надсубстратный мицелий хорошо выражены, цвет от белого до желтоватого, в центральной части от кремового до бледно-желтого; оборот прозрачный, бесцветный или бледно-желтого оттенка; спороношение обильное, светлых оттенков от светло-бежевого до зеленовато-голубого, по мере старения культуры темнеет до оливкового и пастельно-зеленого; в агар может выделяться бледно-желтый пигмент; эксудат прозрачный или желтоватый.

При культивировании на среде Чапека, 37°С, 7 суток: роста нет, при культивировании на среде Чапека, 5°С, 7 суток: формируются микроколонии; 14 суток - колонии диаметром 3 мм, спороношение присутствует.

При культивировании на среде Чапека с дрожжевым экстрактом, 25°С, 7 суток: колонии плоские, бархатистые, слабо выраженная выпуклость в центре, с намеченной радиальной складчатостью; оборот от бесцветного до светло-коричневого; диаметр 4,2-4,5 см, край колонии ровный, с выраженной зоной мицелия до 1,5-2 мм шириной, мицелий белый с бежево-золотистым оттенком; спороношение обильное, зеленого цвета; эксудата от прозрачного до ярко-желтого.

При культивировании на мальт-экстракт агаре, 25°С, 7 суток: колонии плоские, ровные, немного приподнятые в центре; диаметр до 3,0 см, край фестончато-волнистый, оборот бесцветный, просвечивающий, до карамельного; субстратный и надсубстратный мицелий хорошо выраженны; мицелий белый по краю колонии; спороношение обильное, голубо-зеленое, по мере старения культуры темнеет до темно-зеленого; эксудат и пигмент отсутствуют.

Среда Чапека с дрожжевым экстрактом (25°С, 7 суток): конидиеносцы развиты на субстратном и надсубстратном мицелии, длина 100-300 мкм, гладкие; Кисточки преимузественно 2-ярусные с дополнительными веточками изредко 3-ярусные; веточки длиной 12-26 мкм, редко - до 30-42 мкм, часто растопыренные; метулы прижатые, 10-16 мкм; фиалиды кеглевидные с выраженным коротким носиком, плотно расположенные, длина 8-10 мкм; конидии гиалиновые, гладкие, субокруглой формы, диаметр 3,4-4,0 мкм, образуются в плотных колонках средней длины по стеригмам. Молекулярные особенности штамма:

Последовательность участка гена β-тубулина (BenA):

Предлагаемая микробная композиция молочнокислых бактерий, дрожжевых и микроскопических грибов, в научной и патентной литературе не описана.

Микробная композиция представляет собой суспензию микроорганизмов желто-коричневого цвета с приятным силосным запахом; концентрация водородных ионов (рН) составляет 3,0-4,0; количество жизнеспособных клеток в 1 мл суспензии составляет, не менее 1×10⁶ КОЕ/мл.

Микробные композиции используются для внесения как в твердые, так и жидкие органические отходы. В жидкие органические отходы (лагуны с жидкими отходами животноводства, сточные воды и т.д.) необходимо вносить микробную композицию молочнокислых бактерий и дрожжей, а в твердые органические остатки (навоз, помет, осадки сточных вод и т.д.) – микробную композицию молочнокислых бактерий, дрожжевых и микроскопических грибов. Микромицеты (Penicillium chrysogenum GR150323 (регистрационный номер ВКМ F-4935D), Penicillium chrysogenum GR160323 (регистрационный номер ВКМ F-4934D)) активно разлагают твердые органические отходы

Получение бактериальной части микробной композиции.

Микробная композиция молочнокислых бактерий, дрожжевых и микроскопических грибов включает жизнеспособные микроорганизмы, их метаболиты и остатки культуральной среды (жидкая форма биопрепарата) или жизнеспособные микроорганизмы в концентрированной или адсорбированной форме препарата (сухая форма биопрепарата).

Культивирование молочнокислых бактерий и дрожжей осуществляют глубинным методом, что позволяет наиболее полно использовать компоненты питательной среды и получить биопрепарат с максимальным содержанием микробных клеток. Вторую часть биопрепарата, состоящую из спор микромицетов, получают отдельно от бактериальной части биопрепарата, а затем их смешивают. Микромицеты получать можно несколькими способами: глубинно (культивирование в жидкой питательной среде) или поверхностно (культивирование на твердой питательной среде).

Этапы получения бактериальной части консорциума биопрепарата:

- подготовка посевных культур молочнокислых бактерий и дрожжей из в лабораторных или производственных биореакторах объемом от 2 до 100 л;

- совместное культивирование молочнокислых бактерий и дрожжей в жидкой питательной среде.

Культивирование микробной ассоциации проводят в многотоннажном биореакторе (1-15 тонн) глубинным способом. Использование мелассы свекловичной или патоки кукурузной (10-20 мл/л) в процессе культивирования молочнокислых бактерий и дрожжей, позволяет исключить другие углеводы (глюкоза, сахароза) и снизить себестоимость питательной среды, применяемой при накоплении биомассы микроорганизмов. Питательная среда, помимо углеводов, содержит дрожжевой автолизат (1-2,5 г/л), соли калия (0,55-1,2 г/л), соли аммония (1-1,5 г/л), соли кальция и/или натрия (0,8-1,0 г/л). В качестве источника органического азота питательная среда содержит гидролизат и/или автолизат дрожжей и/или кукурузной или соевой муки.

Достигаемый результат совместного культивирования молочнокислых бактерий и дрожжей, заключается в синергичном эффекте данных групп микроорганизмов и повышении его биологической активности. Метаболиты дрожжей (спирты) и молочнокислых бактерий (органических кислот), усиливают антибиотическое действие друг друга. Увеличение зоны подавления тест-организма консорциумом молочнокислых бактерий и дрожжей, по сравнению с их монокультурами, отмечено у всех тестируемых видов, т.е. антагонистическая активность монокультур выражена меньше чем у микробной композиции, состоящего из этих микроорганизмов.

Важным новшеством при производстве биопрепарата на основе молочнокислых бактерий и дрожжей является то, что культивирование микробной композиции в производственных условиях возможно без стерилизации питательной среды. Сущность новшества заключается в обязательном наличии следующих условий:

- соблюдение асептических условий в производственном цехе (предварительная дезинфекция поверхностей антибактериальными средствами и/или стерилизации воздуха УФ и/или обработки озоном);

- стерилизация биореакторов и/или ферментеров влажным паром и/или химическими методами стерилизации;

- вносимый источник углеводов (меласса свекловичная, патока кукурузная) должен стерилизоваться;

- химические реактивы вносятся в средоварку в виде сухих солей, после полного растворения которых, происходит их тщательное перемешивание;

- подача стерильной (обязательное условие) деминерализованной воды в биореактор из установки обратного осмоса (обеззараживание происходит за счет обработки воды ультрафиолетом);

- при подаче воды в биореактор она должна сразу нагреваться до 30-37°С;

- внесение посевной культуры каждого штамма микроорганизма в питательную среду, предназначенную для совместного их культивирования.

Достигаемый технический результат - культивирование микроорганизмов с высокой антагонистической активностью, по отношению к посторонней и болезнетворной микрофлоре без стерилизации.

В процессе глубинного культивирования необходимо перемешивание и аэрация микробной композиции при температуре 30-34°С, продолжительность культивирования составляет 24-60 часов, кислотность культуральной жидкости - 3,0-4,0. Смешивание бактериальных взвесей производят в соотношении, обеспечивающем содержание жизнеспособных бактерий каждого штамма в количестве не менее 10⁶ КОЕ/мл, а дрожжей - не менее 10⁵ КОЕ/мл, в получаемой микробной суспензии.

Получение культуры микромицетов.

Рабочие культуры микромицетов выращивают на сусло-агаре, среде Сабуро, среде Чапека, мальт-экстракт агаре. Чистая культура на сусло-агаре служит исходным материалом для размножения грибов на твердых или жидких средах.

Для поверхностного культивирования микромицетов возможно использовать среду Сабуро, Чапек, но использование агаризованной среды, включающей пшеничные отруби и/или другой источник белка, а также углеводы, снижает себестоимость биопрепарата. В стерильные пробирки с косым агаром засевают смывом с рабочей культуры, содержащей споры и частицы мицелия. Количество спор в 1 мл суспензии - не менее 1×10⁵ КОЕ. Культивирование проводят при температуре 28-30°С до максимального спороношения. Из спор, собранных в пробирке с косым агаром, готовят водную суспензию и затем вносят ее в микробный консорциум. Для равномерности распределения спор в бактериальной составляющей биопрепарата, в водную суспензию вносят поверхностно-активное вещество (алкилбензолсульфат, твин-80).

Культивирование микромицетов глубинно в жидкой питательной среде.

Отруби и углеводы вносят в воду и разливают по колбам. Колбы закрывают ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при 1,0 атм. 1 ч.. В охлажденные колбы с производственной питательной средой вносят суспензию гриба, содержащую споры и частицы мицелия, в количестве не менее 1×10⁵ КОЕ в 1 мл. Колбы культивируют на качалке. При больших объемах производства возможно культивирование в биореакторе объемом 100-200 л.

Контроль качества

В получаемой бактериальной композиции возможен раздельный учет КОЕ каждого штамма с помощью простых и общедоступных способов, благодаря выраженным межвидовым различиям. Количество КОЕ в 1 мл взвеси бактерий рода Lactobacillus определяют с помощью стандартного метода высева на твердые среды MRS, Rogosa и подсчета выросших колоний после инкубирования в аэробных условиях (поверхностный способ посева) или условиях ограниченного доступа воздуха (глубинный способ посева) [ГОСТ 31928]. Определение присутствия и подсчет количества энтерококков, проводят на плотных питательных средах (Агар Сланец - Бертли, среде Тернера, щелочная полимиксиновая среда, молочно-ингибиторная среда), на которых Enterococcus образуют колонии, в зависимости от среды - от черного и серого цвета, до красного цвета [ГОСТ 31928]. Определение присутствия и подсчет количества грибковых клеток исследуют по ГОСТ Р 57221 - 2016. Указанные методики, позволяют проводить раздельный учет бактериальных и грибковых клеток в смешанной культуре микроорганизмов как в суспензии, так и в сухой форме.

Биологическая безопасность при производстве микробной композиции заключается в том, что наличие мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), бактерий группы кишечных палочек (колиформы), патогенных микроорганизмов, в т.ч. сальмонеллы, не допускается.

Готовую и прошедшую контроль микробную композицию, можно использовать для производства сухих и жидких товарных форм препарата. Жидкая товарная форма биопрепарата - суспензия микробных клеток, полученная в биореакторе, которая может фасоваться в стеклянную или пластиковую тару. Сухая товарная форма биопрепарата может быть получена разными способами:

- концентрирование микробных клеток и прессование до 15-20% сухих веществ с дальнейшей фасовкой в ампулы;

- концентрирование микробных клеток (20-25% сухих веществ) и введение в них адсорбента (биочара) с дальнейшим высушиванием и фасовкой в бумажную упаковку, пластиковую тару;

- концентрирование микробных клеток (20-25% сухих веществ) и заморозки в т.ч. с использованием аудиочастот и дальнейшей фасовки в пластиковую, бумажную или стеклянную тару;

- лиофилизация.

Получение и свойства микробного консорциума иллюстрируется следующим примерами.

Пример 1. Приготовление микробной композиции молочнокислых бактерий и дрожжей (Lactobacillus parabuchneri 6 (регистрационный номер B-3553D), Lactobacillus plantarum 20 (регистрационный номер ВКМ B-3552D), Lactobacillus acidophilus 22 (регистрационный номер ВКМ B-3563D), Enterococcus faecium 4/6 (регистрационный номер ВКМ B-3551D), Brettanomyces bruxellensis BKM Y-3064D, Penicillium chrysogenum BKM F-4934D.

Получение посевного материала. Музейные жидкие культуры штаммов молочнокислых бактерий по 1 мл вносят в пробирки с 9 мл среды жидкой среды MRS. Наращивают штаммы в пробирках раздельно, 20-24 ч при 36°С. Культуру Brettanomyces bruxellensis ВКМ Y-3064D в количестве 1 мл вносят в 9 мл сусла, среду Сабуро, культивирование проводят в течение 24-26 часов при 28°С.

Приготовление культур 1 порядка. Выросшую культуру каждого из штаммов раздельно, в объеме 5% вносят в 1 л среды культивирования и раздельно культивируют: штаммы молочнокислых бактерий в течение 18 ч при 36°С, дрожжи - в течение 18 ч при 28°С.

Приготовление культур 2 порядка. Каждую выросшую культуру 1 порядка каждого из штаммов, раздельно вносят в 50 л среды культивирования и раздельно культивируют, используя лабораторные биореакторы: штаммы молочнокислых бактерий - в течение 24-30 ч при 36°С, дрожжи - в течение 48 ч при 28°С. Затем, культуры 2 порядка каждого из штаммов вносят в количестве 3-5% в производственную среду, изготовленную путем смешивания патоки кукурузной, минеральных солей аммония (1,1 г/л), калия фосфорнокислого одно замещенного (0,65 г/л), натрия (1,1 г/л), кальция (1,0 г/л) и воды. Культивирование осуществляют глубинным методом, в промышленном многотоннажном биореакторе с применением перемешивания и аэрации, при температуре 31-34°С в течение 72 часов. Содержание жизнеспособных клеток микроорганизмов, в полученном биопрепарате, не менее 1×10⁶ КОЕ в 1 мл, рН 3,0-4,0.

Выше полученная микробная композиция может фасоваться и использоваться для переработки жидких органических отходов, так же в него можно внести споры микромицетов, в частности Penicillium chrysogenum BKM F-4934D.

Получение культуры микромицета на твердой питательной среде. Рабочие культуры микромицетов выращивают на сусло-агаре. Для поверхностного культивирования микромицетов, используют агаризованную среду Чапека. Для засева питательной среды, используют смыв рабочей культуры с косого агара, содержащий споры и частицы мицелия. Культивирование проводят при температуре 28-30°С, до максимального спороношения (10-12 суток). Сбор спор проводят в асептических условиях, возможно использование шпателя Дригальского: тщательно собрать споры с поверхностного мицелия гриба, затем в виде водной суспензии (в количестве - не менее 1×10⁶ КОЕ/ 1 мл) внести в микробную композицию в количестве 1-7 мл/л.

Пример 2. Получение микробной композиции: Lactobacillus parabuchneri B-3553D, Lactobacillus plantarum ВКМ B-3552D, Lactobacillus acidophilus ВКМ B-3563D, Enterococcus faecium ВКМ B-3551D, Brettanomyces bruxellensis ВКМ Y-3064D, Penicillium chrysogenum ВКМ F-4935D.

Получение посевного материала. Музейные жидкие культуры штаммов рода Lactobacillus в количестве 1 мл вносят в пробирки с 9 мл среды жидкой среды MRS, энтерококка в жидкую молочно-ингибиторную среду. Наращивают каждый штамм отдельно в пробирках, в течение 18-20 ч при 36°С. Культуру дрожжей в количестве 1 мл, вносят в 9 мл сусла или среду Сабуро, культивирование проводят в течение 20-24 часов при 28°С.

Приготовление культур 1 порядка. Выросшую культуру каждого из штаммов раздельно в объеме 5%, вносят в 1 л среды культивирования и раздельно культивируют: штаммы лактобактерий и энтеробактерий в течение 18 ч при 36°С, дрожжи - в течение 18 ч при 28°С.

Приготовление культур 2 порядка. Каждую выросшую культуру 1 порядка каждого из штаммов, раздельно вносят в 50 л среды культивирования и раздельно культивируют, используя лабораторные биореакторы: штаммы лактобактерий и энтеробактерий в течение 24-30 ч при 36°С, дрожжи - в течение 48 ч при 28°С.

Приготовление производственной питательной среды в промышленном биореакторе. В многотоннажный биореактор (обработан химическими стерилентами и тщательно промыт водой из установки обратного осмоса) поступает стерильная деминерализованная вода (одновременно происходит подогрев среды до 32-33°С), горячая стерильная меласса свекловичная, дрожжевой автолизат (1 г/л), растворенные в воде минеральные соли калия, натрия, кальция и аммония. Все манипуляции по внесению компонентов производственной питательной среды и культур 2-го порядка проводят в асептических условиях. Культивирование осуществляют с использованием перемешивания и аэрации до максимального накопления микробных клеток и снижения рН культуральной жидкости до значения менее 4,0.

Полученная микробная композиция может фасоваться и использоваться как в вышеописанном составе (молочнокислые бактерии и дрожжи), так и в него возможно внесение спор микромицетов, в частности Penicillium chrysogenum GR150323 (регистрационный номер ВКМ F-4935D).

Получение культуры микромицета на твердой питательной среде. Рабочие культуры микромицетов выращивают на сусло-агаре. Для поверхностного культивирования микромицетов, используют агаризованную среду Чапека. Для засева питательной среды, используют смыв рабочей культуры с косого агара, содержащий споры и частицы мицелия. Культивирование проводят при температуре 28-30°С, до максимального спороношения (10-14 суток). Сбор спор проводят в асептических условиях, возможно использование шпателя Дригальского: тщательно собрать споры с поверхностного мицелия гриба, затем в виде водной суспензии (в количестве - не менее 1×10⁶ КОЕ/ 1 мл) внести в микробную композицию в количестве 5-20 мл/л.

Пример 3. Полученный вышеописанным способом биопрепарат в виде суспензии можно применят для переработки органических отходов, а можно иммобилизировать на твердом носителе - биоугле. Для этого биопрепарат концентрируют до содержания сухих веществ 15% по массе и вводят биоуголь или другой пористый носитель, высушивают и фасуют в бумажные пакеты. Получают сухой биопрепарат для переработки органических отходов с содержанием жизнеспособных клеток микроорганизмов не менее 1×10¹⁰/1 г.

Пример 4. Разиливание твердого осадка лагуны со свиными стоками.

Композицию молочнокислых бактерий и дрожжей: Lactobacillus parabuchneri B-3553D, Lactobacillus plantarum ВКМ B-3552D, Lactobacillus acidophilus ВКМ B-3563D, Enterococcus faecium ВКМ B-3551D, Brettanomyces bruxellensis ВКМ Y-3064D вносили в осадок навозных стоков равномерно по всей площади лагуны в количеств 50 л микробного консорциума/10 тонн воды. Применение композиции молочнокислых бактерий и дрожжей привело к увеличению объема откачиваемого мертвого остатка в 4 раза, по сравнению с контрольным вариантом. Помимо уменьшения мертвого осадка, микробная композиция молочнокислых бактерий и дрожжей обеззаразила его от патогенных микроорганизмов, гельминтов и куколок синантропных мух.

Пример 5. Переработка навоза КРС в органические удобрения с использованием микробной композиции: Lactobacillus parabuchneri 6 B-3553D, Lactobacillus plantarum ВКМ B-3552D, Lactobacillus acidophilus ВКМ B-3563D, Enterococcus faecium ВКМ B-3551D), Brettanomyces bruxellensis ВКМ Y-3064D, Penicillium chrysogenum ВКМ F-4934D.

Навоз КРС обрабатывали микробной композицией в виде суспензии из расчета 1 л на 10 тонн помета, микробной композицией, иммобилизованной на биоугле в количестве 100 г/10 тонн - опытные кагаты, в контрольный кагат ничего не вносили.

Навоз КРС имеет специфический запах, обусловленный наличием аммиака и сероводорода. В контрольном бурте через 1.5 месяца запах навоза остался, а в опытных буртах - на третьи сутки значительно уменьшился. По окончании процесса компостирования отмечен характерный земельный запах. Изменение внешнего вида навоза КРС представлено: на Фиг. 1 - Внешний вид навоза в день закладки опыта (1 день эксперимента), Фиг. 2 - Внешний вид навоза через на 45 день эксперимента - контрольный вариант, Фиг. 3 - Внешний вид навоза через на 45 день эксперимента - вариант внесения суспензии микроорганизмов, Фиг. 4. - Внешний вид навоза через на 45 день эксперимента - вариант с внесением микробного консорциума иммобилизованного на биоугле.

ГОСТ 33830-2016 Удобрения органические на основе отходов животноводства

Пример 6. Ускоренное разложение соломы и стимуляция ростовых процессов растений микробной композицией Lactobacillus parabuchneri B-3553D, Lactobacillus plantarum ВКМ B-3552D, Lactobacillus acidophilus ВКМ B-3563D, Enterococcus faecium ВКМ B-3551D, Brettanomyces bruxellensis ВКМ Y-3064D, Penicillium chrysogenum ВКМ F-4935D.

Рационально использование пожнивных остатков (соломы) для повышения содержания органического вещества в почвах. В естественных природных условиях солома долго разлагается, данный процесс сопровождается дефицитом минерального азота в почве, выделяются фитотоксичные соединения, накапливаются фитопатогенные микроорганизмы.

Внесение микробной композиции в количестве 1 л/га показало, что через 27 суток в соломине видны тяжи мощной склеренхимы проводящих пучков (на Фиг. 5 представлен край соломины, находившейся 1 месяц в почве (х4): контроль (почва без обработки)., на Фиг. 6 - край соломины, находившейся 1 месяц в почве (х4): опытный вариант (почва, обработанная микробной композицией), а паренхима и склеренхима перецикла значительно тоньше и просвечиваются в проходящем свете микроскопа. В контрольном варианте (без внесения микробной композиции) сохраняется структура соломины: она желтого цвета, склеренхимные обкладки пучков слиты со склеренхимой перицикла, механическая ткань образует плотное кольцо.

В результате изучения морфометрических показателей и биологической продуктивности растений пшеницы сорта Безостая 100, спустя 2 недели после листовой подкормки микроэлементами, получена значительная разница по морфометрическим показателям растений опытного и контрольного вариантов (на Фиг. 7 представлен внешний вид растений пшеницы: контрольный вариант, на Фиг. 8 - внешний вид растений пшеницы: опытный вариант (Микробный консорциум), Табл. 2).