[1][001] Настоящая заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США № 62/781226, поданной 18 декабря 2018 г., которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[2]ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[3][002] В настоящем изобретении предусмотрены, в частности, композиции, содержащие ингибиторы LEPR, GDF8 и активина А, и способы лечения для повышения веса тела и сухой мышечной массы.
[4]ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[5][003] Официальная копия перечня последовательностей подается одновременно с настоящим описанием в электронном виде через EFS-Web в виде перечня последовательностей в формате ASCII в файле с названием «10547WOseqlist_ST25.txt», дата создания 17 декабря 2019 г., имеющем размер приблизительно 26 кБ. Перечень последовательностей, содержащийся в данном документе в формате ASCII, является частью настоящего описания и включен в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.
[6]ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[7][004] Фактор роста и дифференцировки 8 (GDF8, также известный как миостатин) и активин А являются двумя важными регуляторами развития и поддержания скелетных мышц и мышечной массы.
[8][005] GDF8 представляет собой секретируемый лиганд, относящийся к факторам роста из суперсемейства трансформирующего фактора роста-β (TGF-β), который действует как отрицательный регулятор мышечной массы. Антагонисты GDF8 применялись у взрослых мышей со значительными положительными эффектами в отношении скелетно-мышечной массы. Рецептор, c которым связывается GDF8 и отрицательно регулирует мышечную массу, представляет собой рецептор активина типа IIB (ACVR2B). GDF8 не является единственным отрицательным регулятором мышечной массы, действующим через ACVR2B. Активин А (ActA) также отрицательно регулирует мышечную массу через этот рецептор (Latres et al., Activin A more prominently regulates muscle mass in primates than does GDF8, Nature Comm. 8:15153 (2017)). ActRIIB связывает лиганды, в том числе активин А, B, C и E, GDF11, костный морфогенетический белок 9 (BMP9) и BMP10. Данные свидетельствуют о том, что активин А действует согласованно с GDF8, регулируя скелетно-мышечную массу, и что комбинированное подавление GDF8 и активина А может быть эффективным для лечения атрофии мышц у пациентов с нарушениями по типу истощения мышц (Latres et al. (2017)).
[9][006] Лептин представляет собой полипептидный гормон, экспрессирующийся преимущественно в жировой ткани и скелетных мышцах, который участвует в регуляции метаболизма, энергетического баланса и потребления пищи. Активность лептина опосредуется взаимодействием с рецептором лептина и передачей через него сигналов. Рецептор лептина (также известный как "LEPR", "WSX", "рецептор OB", "OB-R" и "CD295") представляет собой однопроходный трансмембранный рецептор из семейства рецепторов цитокинов класса I с крупным внеклеточным доменом. LEPR регулирует вес тела с помощью сигнального пути JAK-STAT3. Измененная передача сигналов от лептина или LEPR или их обоих может способствовать множеству нарушений, включающих без ограничения анорексию или другие психические расстройства пищевого поведения, кахексию, аутоиммунные нарушения, сердечно-сосудистые заболевания и нейродегенеративные нарушения.
[10]КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[11][007] Настоящее изобретение относится к композициям, которые применимы не только для увеличения общей массы тела, но также для увеличения массы тела таким образом, который приводит к более желательному общему композиционному составу тела. Как упоминалось, введение антагонистических антител к LEPR, антител к GDF8 и антител к ActA (тройная комбинация) приводило к увеличению общего веса тела по сравнению с тем, что наблюдалось с антителами к LEPR в отдельности или антителами к GDF8 вместе с антителами к ActA. Дополнительные благоприятные эффекты наблюдались в отношении массы нежировых тканей субъектов, получавших тройную комбинацию. У этих субъектов увеличивалась общая масса нежировых тканей и уменьшалось соотношение жировой массы и массы нежировых тканей (по сравнению с антителами к LEPR в отдельности или антителами к GDF8 вместе с антителами к ActA). Например, это увеличение массы нежировых тканей подтверждалось в той степени, в которой субъекты, получающие тройную комбинацию, демонстрировали большую мышечную массу и размер (площадь) мышечных волокон в некоторых специфических анализируемых мышечных структурах.
[12][008] В настоящем изобретении предусмотрена комбинация, содержащая антагонист рецептора лептина (например, рецептора лептина человека) в сочетании с антагонистом GDF8 (например, GDF8 человека) в сочетании с антагонистом (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2) активина А (например, активина А человека) и необязательно фармацевтически приемлемый носитель. Например, такие комбинации могут включать в себя комбинированный состав, содержащий по меньшей мере два антагониста, выбранных из антагониста рецептора лептина, антагониста GDF8 и антагониста активина А, или антагонисты могут быть представлены в отдельных композициях. Антагонист рецептора лептина, антагонист GDF8 и/или антагонист активина А в варианте осуществления настоящего изобретения представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связываются соответственно с рецептором лептина, GDF8 и/или активином А. В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист рецептора лептина представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связываются с рецептором и не конкурируют с лептином за связывание с рецептором. В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист LEPR представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связываются с LEPR, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 вариабельной области тяжелой цепи, выбранной из H4H17322P2, H4H18437P2, H4H18439P2, H4H18440P2, H4H18457P2, H4H18462P2, H4H18464P2, H4H18466P2 и H4H18508P2; и CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 вариабельной области легкой цепи, выбранной из H4H17322P2, H4H18437P2, H4H18439P2, H4H18440P2, H4H18457P2, H4H18462P2, H4H18464P2, H4H18466P2 и H4H18508P2, или которые связываются с тем же эпитопом в LEPR, что и указанные антитело или фрагмент, и/или которые конкурируют за связывание с LEPR с указанными антителом или фрагментом. В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист GDF8 представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связываются с GDF8, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 вариабельной области тяжелой цепи, выбранной из 21-E5; 21-B9; 21-E9; 21-A2; 22-D3; 22-E6; 22-G10; 1A2; 20B12; 58C8; 19F2; 8D12-1; 4E3-7; 9B11-12; 4B9; 1H4-5; 9B4-3; 3E2-1; 4G3-25; 4B6-6; H4H1657N2 или H4H1669P и H4H18508P2; и CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 вариабельной области легкой цепи, выбранной из 21-E5; 21-B9; 21-E9; 21-A2; 22-D3; 22-E6; 22-G10; 1A2; 20B12; 58C8; 19F2; 8D12-1; 4E3-7; 9B11-12; 4B9; 1H4-5; 9B4-3; 3E2-1; 4G3-25; 4B6-6; H4H1657N2 или H4H1669P и H4H18508P2, или которые связываются с тем же эпитопом в GDF8, что и указанные антитело или фрагмент, и/или которые конкурируют за связывание с GDF8 с указанными антителом или фрагментом. В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист активина А представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфично связываются с активином А, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 вариабельной области тяжелой цепи, выбранной из H4H10423P, H4H10424P, H4H10426P, H4H10429P, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10433P2, H4H10436P2, H4H10437P2, H4H10438P2, H4H10440P2, H4H10442P2, H4H10445P2, H4H10446P22, H4H10447P2, H4H10448P2, H4H10452P2, H4H10468P2 и H2aM10965N, и CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 вариабельной области легкой цепи, выбранной из H4H10423P, H4H10424P, H4H10426P, H4H10429P, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10433P2, H4H10436P2, H4H10437P2, H4H10438P2, H4H10440P2, H4H10442P2, H4H10445P2, H4H10446P22, H4H10447P2, H4H10448P2, H4H10452P2, H4H10468P2 и H2aM10965N, или которые связываются с тем же эпитопом в активине А, что и указанные антитело или фрагмент, и/или которые конкурируют за связывание с активином А с указанными антителом или фрагментом. В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист LEPR представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из H4H17322P2, H4H18437P2, H4H18439P2, H4H18440P2, H4H18457P2, H4H18462P2, H4H18464P2, H4H18466P2 и H4H18508P2; и вариабельную область легкой цепи, выбранную из H4H17322P2, H4H18437P2, H4H18439P2, H4H18440P2, H4H18457P2, H4H18462P2, H4H18464P2, H4H18466P2 и H4H18508P2, или которые связываются с тем же эпитопом в LEPR, что и указанные антитело или фрагмент, и/или которые конкурируют за связывание с LEPR с указанными антителом или фрагментом. В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист GDF8 представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из 21-E5; 21-B9; 21-E9; 21-A2; 22-D3; 22-E6; 22-G10; 1A2; 20B12; 58C8; 19F2; 8D12-1; 4E3-7; 9B11-12; 4B9; 1H4-5; 9B4-3; 3E2-1; 4G3-25; 4B6-6; H4H1657N2 или H4H1669P и H4H18508P2; и вариабельную область легкой цепи, выбранную из 21-E5; 21-B9; 21-E9; 21-A2; 22-D3; 22-E6; 22-G10; 1A2; 20B12; 58C8; 19F2; 8D12-1; 4E3-7; 9B11-12; 4B9; 1H4-5; 9B4-3; 3E2-1; 4G3-25; 4B6-6; H4H1657N2 или H4H1669P и H4H18508P2, или которые связываются с тем же эпитопом в GDF8, что и указанные антитело или фрагмент, и/или которые конкурируют за связывание с GDF8 с указанными антителом или фрагментом. В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист активина А представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из H4H10423P, H4H10424P, H4H10426P, H4H10429P, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10433P2, H4H10436P2, H4H10437P2, H4H10438P2, H4H10440P2, H4H10442P2, H4H10445P2, H4H10446P22, H4H10447P2, H4H10448P2, H4H10452P2, H4H10468P2 и H2aM10965N; и вариабельную область легкой цепи, выбранную из H4H10423P, H4H10424P, H4H10426P, H4H10429P, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10433P2, H4H10436P2, H4H10437P2, H4H10438P2, H4H10440P2, H4H10442P2, H4H10445P2, H4H10446P22, H4H10447P2, H4H10448P2, H4H10452P2, H4H10468P2 и H2aM10965N, или которые связываются с тем же эпитопом в активине А, что и указанные антитело или фрагмент, и/или которые конкурируют за связывание с активином А с указанными антителом или фрагментом. Такие комбинации необязательно содержат одно или более дополнительных терапевтических средств (например, стимулятор аппетита, каннабиноид, ингибитор ангиотензинпревращающего фермента (ACE), блокатор рецепторов ангиотензина, релаксант гладкой мускулатуры, нитрат, диуретик, железо, бронходилататор, антихолинергическое средство, кортикостероид, антибиотик, нестероидное противовоспалительное лекарственное средство (NSAID), иммунодепрессант, ингибитор HMG-CoA-редуктазы, антидепрессант, средство противораковой терапии и/или средство для местного применения).
[13][009] В настоящем изобретении предусмотрены устройство для инъекций (например, игла для подкожных инъекций и шприц, автоинъектор или предварительно заполненный шприц) или емкость (например, флакон), которые содержат комбинацию по настоящему изобретению (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2). В настоящем изобретении дополнительно предусмотрены способы введения комбинации по настоящему изобретению субъекту (например, человеку), включающие стадию введения компонентов комбинации в организм субъекта, например, парентерально, например, путем инъекции с применением устройства для инъекций в соответствии с настоящим изобретением. В варианте осуществления настоящего изобретения субъект страдает нарушением питания, отставанием в физическом развитии, недостаточным потреблением пищи, расстройством пищевого поведения, кахексией, атрофией или истощением мышц и повреждением мышц и/или проходит физиотерапию.
[14][0010] В настоящем изобретении также предусмотрен способ подавления LEPR, GDF8 и активина А в организме субъекта (например, человека), включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества комбинации по настоящему изобретению (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2), например, парентерально, например, путем инъекции с применением устройства для инъекций в соответствии с настоящим изобретением. В варианте осуществления настоящего изобретения субъект страдает нарушением питания, отставанием в физическом развитии, недостаточным потреблением пищи, расстройством пищевого поведения, кахексией, атрофией или истощением мышц и повреждением мышц и/или проходит физиотерапию.
[15][0011] В настоящем изобретении также предусмотрен способ увеличения потребления пищи, тучности, веса тела, мышечной силы, размера мышечных волокон или массы нежировых тканей (например, за счет жировой массы) у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту (например, человеку) терапевтически эффективного количества комбинации по настоящему изобретению (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2). В варианте осуществления настоящего изобретения субъект страдает нарушением питания, отставанием в физическом развитии, недостаточным потреблением пищи, расстройством пищевого поведения, кахексией, атрофией или истощением мышц и повреждением мышц и/или проходит физиотерапию.
[16][0012] В настоящем изобретении дополнительно предусмотрен способ увеличения спортивных способностей у субъекта, нуждающегося в этом (например, человека), включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества комбинации по настоящему изобретению (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2). В варианте осуществления настоящего изобретения субъект страдает нарушением питания, отставанием в физическом развитии, недостаточным потреблением пищи, расстройством пищевого поведения, кахексией, атрофией или истощением мышц и повреждением мышц и/или проходит физиотерапию (например, реабилитацию после инсульта).
[17][0013] В настоящем изобретении предусмотрен способ снижения увеличенного содержания триглицеридов в печени у субъекта, которому вводится антагонист рецептора лептина, включающий введение субъекту в сочетании с антагонистом рецептора лептина антагониста GDF8 в сочетании с антагонистом активина А (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2).
[18][0014] В настоящем изобретении также предусмотрен способ лечения или предупреждения нарушения питания, кахексии, отставания в физическом развитии, расстройства пищевого поведения, характеризующегося недостаточным потреблением калорий, атрофии мышц, возрастной саркопении или повреждения мышц у субъекта (например, человека), нуждающегося в этом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества комбинации по настоящему изобретению (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2). Например, в варианте осуществления настоящего изобретения (i) субъект с нарушением питания страдает нарушением питания, связанным с госпитализацией, отставанием в физическом развитии в детском возрасте, расстройством пищевого поведения, характеризующимся недостаточным потреблением калорий, анорексией и/или булимией; (ii) субъект с кахексией страдает анорексией, булимией, расстройством пищевого поведения, заболеванием легких, хроническим обструктивным заболеванием легких (COPD), хроническим заболеванием почек, инфекционным заболеванием, ВИЧ-инфекцией, синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), застойной сердечной недостаточностью, осложнениями лучевой терапии, раком, гепатоцеллюлярной карциномой, меланомой, раком молочной железы, аутоиммунным нарушением, воспалительным заболеванием кишечника, красной волчанкой, рассеянным склерозом, ревматоидным артритом, болезнью Крона, псориазом, муковисцидозом, сердечно-сосудистым заболеванием, повышенным кровяным давлением, депрессией и/или нейродегенеративными нарушениями или переносит их; и/или (iii) субъект с атрофией или истощением мышц страдает от сепсиса, СПИДа, почечной недостаточности, сердечной недостаточности, избытка глюкокортикоидов, синдрома Кушинга, травмы, бездействия мышц, иммобилизации, постельного режима, телесного повреждения, перелома бедра, замены тазобедренного сустава, замены коленного сустава и/или искусственной вентиляции легких или претерпевает их.
[19][0015] Способы получения комбинации по настоящему изобретению (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2), включающие совместное составление антагониста LEPR, антагониста GDF8 и антагониста активина А и фармацевтически приемлемого носителя, также являются частью настоящего изобретения.
[20][0016] В настоящем изобретении также предусмотрен способ получения устройства или емкости, которые содержат комбинацию по настоящему изобретению (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2), включающий введение компонентов комбинации в емкость или устройство.
[21]ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[22][0017] Комбинации антагонистов «LEPR/GDF8/ActA» по настоящему изобретению включают в себя композиции или наборы, например, фармацевтические композиции, содержащие фармацевтически приемлемый носитель и один или более антагонистов LEPR, один или более антагонистов GDF8 и один или более антагонистов активина А в сочетании друг с другом и необязательно в сочетании с одним или более дополнительными терапевтическими средствами. В варианте осуществления настоящего изобретения комбинация антагонистов LEPR/GDF8/ActA содержит антитело H4H18457P2 к LEPR или его антигенсвязывающий фрагмент (или его вариант), антитело H4H1657N2 к GDF8 или его антигенсвязывающий фрагмент (или его вариант) и антитело H4H10446P2 к ActA или его антигенсвязывающий фрагмент (или его вариант) (H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2).
[23][0018] Термин «в сочетании с» указывает на то, что компоненты комбинаций антагонистов LEPR/GDF8/ActA по настоящему изобретению (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2) размещены вместе. Например, антагонист LEPR, антагонист GDF8 и антагонист активина А могут быть составлены в одной композиции, например, для одновременной доставки, или составлены по отдельности в двух или более композициях (например, и включены в набор). Комбинация, например, может представлять собой первую композицию, которая содержит антагонист LEPR, составленный вместе с антагонистом GDF8, размещенную вместе со второй композицией, которая содержит составленный в отдельности антагонист активина А. В качестве альтернативы комбинация может представлять собой три составленные по отдельности композиции: первую композицию на основе антагониста LEPR, вторую композицию на основе антагониста GDF8 и третью композицию на основе антагониста активина А. Каждый компонент комбинации в случае составления в отдельности можно вводить субъекту в момент времени, отличающийся от момента времени введения другого компонента; например, каждое введение можно осуществлять неодновременно (например, по отдельности или последовательно) с определенными интервалами в течение заданного периода времени в рамках схемы лечения. Кроме того, отдельные компоненты можно вводить субъекту одним и тем же или разными путями.
[24][0019] В данном документе упоминаются антитела к LEPR, антитела к GDF8 и/или антитела к ActA или их антигенсвязывающие фрагменты, последовательности которых представлены в предыдущих публикациях. В варианте осуществления настоящего изобретения такие антитела или фрагменты содержат по меньшей мере один вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и/или по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи (VL), последовательности которых упоминаются в данном документе, за исключением того, что каждый из них может независимо иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 точечных мутаций и/или точечных делеций. Антитела к LEPR, антитела к GDF8 и/или антитела к ActA или фрагменты могут содержать CDR VH (HCDR) тяжелой цепи, последовательности которых упоминаются в данном документе, за исключением того, что каждая из них может независимо иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 точечных мутаций и/или точечных делеций; и/или антитела к LEPR, антитела к GDF8 и/или антитела к ActA или фрагменты могут содержать CDR VL (HCDR) легкой цепи, последовательности которых упоминаются в данном документе, за исключением того, что каждая из них может независимо иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 точечных мутаций и/или точечных делеций. Антитела или фрагменты, содержащие такие мутации, могут упоминаться в данном документе как «варианты». «Вариант» полипептида (например, VL, VH, HCR или LCDR) может содержать последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 70-99,9% (например, 70, 72, 74, 75, 76, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5, 99,9%) идентичностью или сходством с эталонной последовательностью, например, при выполнении сравнения с помощью алгоритма BLAST, где параметры алгоритма выбраны для получения наибольшего совпадения между соответствующими последовательностями по всей длине соответствующих эталонных последовательностей (например, порог значения ожидания: 10; длина слова: 3; максимальное количество совпадений в диапазоне запроса: 0; матрица BLOSUM 62; штрафы за гэп: наличие – 11, удлинение – 1; условная корректировка композиционной матрицы замен).
[25][0020] Идентичность последовательностей относится к степени, в которой аминокислоты двух полипептидов являются одинаковыми в эквивалентных положениях при оптимальном выравнивании двух последовательностях. Сходство последовательностей охватывает идентичные остатки и неидентичные биохимически родственные аминокислоты. Биохимически родственные аминокислоты, которые обладают сходными свойствами и могут быть взаимозаменяемыми, обсуждаются выше.
[26][0021] Рецептор лептина (LEPR, рецептор OB, OB-R, CD295 или WSX) в варианте осуществления настоящего изобретения представляет собой рецептор лептина человека, содержащий аминокислотную последовательность, представленную под номером доступа в UniProtKB/Swiss-Prot P48357.
[27][0022] GDF8 (фактор роста и дифференцировки 8, MSTN или миостатин) включает в себя белок с аминокислотной последовательностью, представленной под номером доступа в UniProtKB/Swiss-Prot O14793.
[28][0023] Активины представляют собой гомо- и гетеродимерные молекулы, содержащие бета-субъединицы, т.е. ингибин βΑ, ингибин βΒ, ингибин βθ и/или ингибин βΕ. Активин А является гомодимером из двух субъединиц βΑ; активин В является гомодимером из двух субъединиц βΒ; активин АВ является гетеродимером из одной субъединицы βΑ и одной субъединицы βΒ; и активин АС является гетеродимером из одной субъединицы βΑ и одной субъединицы βθ. В варианте осуществления настоящего изобретения аминокислотная последовательность бета-А-цепи ингибина представлена под номером доступа в UniProtKB/Swiss-Prot P08476.
[29][0024] В варианте осуществления настоящего изобретения массу нежировых тканей определяют с помощью компьютерной микротомографии (μCT) или двухэнергетической рентгеновской абсорбциометрии (DXA).
[31][0025] Стандартные способы в молекулярной биологии описаны в Sambrook, Fritsch and Maniatis (1982 & 1989 2nd Edition, 2001 3rd Edition) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3.sup.rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, Calif.). Стандартные способы также представлены в Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, N.Y., в котором описываются клонирование в бактериальных клетках и мутагенез ДНК (том 1), клонирование в клетках млекопитающих и дрожжах (том 2), гликоконъюгаты и экспрессия белков (том 3), а также биоинформатика (том 4).
[32][0026] Описаны способы очистки белков, в том числе иммунопреципитация, хроматография, электрофорез, центрифугирование и кристаллизация (Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York). Описаны химический анализ, химическая модификация, посттрансляционная модификация, получение слитых белков, гликозилирование белков (см., например, Coligan, et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York; Ausubel, et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, NY, pp. 16.0.5-16.22.17; Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, Mo.; pp. 45-89; Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391). Описаны получение, очистка и фрагментация поликлональных и моноклональных антител (Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Harlow and Lane, выше). Доступны стандартные методики определения характеристик лиганд-рецепторных взаимодействий (см., например, Coligan, et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New York).
[33][0027] Можно получить моноклональные, поликлональные и гуманизированные антитела (см., например, Shepherd and Dean (eds.) (2000) Monoclonal Antibodies, Oxford Univ. Press, New York, N.Y.; Kontermann and Dubel (eds.) (2001) Antibody Engineering, Springer-Verlag, New York; Harlow and Lane (1988) Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., pp. 139-243; Carpenter, et al. (2000) J. Immunol. 165:6205; He, et al. (1998) J. Immunol. 160:1029; Tang et al. (1999) J. Biol. Chem. 274:27371-27378; Baca et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:10678-10684; Chothia et al. (1989) Nature 342:877-883; Foote and Winter (1992) J. Mol. Biol. 224:487-499; патент США №6329511).
[34][0028] Альтернативой гуманизации является применение библиотек человеческих антител, представленных на поверхности фагов, или библиотек человеческих антител в организмах трансгенных мышей (Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnol. 14:309-314; Barbas (1995) Nature Medicine 1:837-839; Mendez et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156; Hoogenboom and Chames (2000) Immunol. Today 21:371-377; Barbas et al. (2001) Phage Display: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Kay et al. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, Calif.; de Bruin et al. (1999) Nature Biotechnol. 17:397-399). Описаны одноцепочечные антитела и диатела (см., например, Malecki et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:213-218; Conrath et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:7346-7350; Desmyter et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:26285-26290; Hudson and Kortt (1999) J. Immunol. Methods 231:177-189; и патент США №4946778). Представлены бифункциональные антитела (см., например, Mack, et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7021-7025; Carter (2001) J. Immunol. Methods 248:7-15; Volkel, et al. (2001) Protein Engineering 14:815-823; Segal, et al. (2001) J. Immunol. Methods 248:1-6; Brennan, et al. (1985) Science 229:81-83; Raso, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272:27623; Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Traunecker, et al. (1991) EMBO J. 10:3655-3659; и патенты США №№5932448, 5532210 и 6129914). Полностью человеческие антитела также можно разрабатывать в организмах мышей, полученных методами генной инженерии, таких как VelociMouse. См., например, DeChiara et al., Producing fully ES cell-derived mice from eight-cell stage embryo injections, Methods Enzymol, 476:285-94 (2010); DeChiara et al., VelociMouse: fully ES cell-derived F0-generation mice obtained from the injection of ES cells into eight-cell-stage embryos. Methods Mol Biol, 530:311-24 (2009); патенты США №№7576259; 7659442 или 7294754 и US2008/0078000A1.
[35][0029] Очистка антигена обычно не является необходимой для создания антител. Животных можно иммунизировать клетками, несущими антиген, представляющий интерес. Затем спленоциты можно выделить из иммунизированных животных, и спленоциты можно слить с линией клеток миеломы для получения гибридомы (см., например, Meyaard et al. (1997) Immunity 7:283-290; Wright et al. (2000) Immunity 13:233-242; Preston et al., выше; Kaithamana et al. (1999) J. Immunol. 163:5157-5164).
[36][0030] Антитела можно конъюгировать, например, с низкомолекулярными лекарственными средствами, ферментами, липосомами, полиэтиленгликолем (PEG). Антитела применимы для терапевтических, диагностических целей, использования в наборе или других целей и включают антитела, связанные, например, с красителями, радиоактивными изотопами, ферментами или металлами, например, коллоидным золотом (см., например, Le Doussal et al. (1991) J. Immunol. 146:169-175; Gibellini et al. (1998) J. Immunol. 160:3891-3898; Hsing and Bishop (1999) J. Immunol. 162:2804-2811; Everts et al. (2002) J. Immunol. 168:883-889).
[37][0031] Доступны способы проточной цитометрии, в том числе сортировка клеток с активированной флуоресценцией (FACS) (см., например, Owens, et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J.; Givan (2001) Flow Cytometry, 2.sup.nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, N.J.; Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J.). Доступны флуоресцентные реагенты, подходящие для модификации нуклеиновых кислот, в том числе праймеров и зондов на основе нуклеиновых кислот, полипептидов и антител, для применения, например, в качестве диагностических реагентов (Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.; Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, Mo.).
[38][0032] Описаны стандартные способы гистологического исследования иммунной системы (см., например, Muller-Harmelink (ed.) (1986) Human Thymus: Histopathology and Pathology, Springer Verlag, New York, N.Y.; Hiatt, et al. (2000) Color Atlas of Histology, Lippincott, Williams, and Wilkins, Phila, Pa.; Louis, et al. (2002) Basic Histology: Text and Atlas, McGraw-Hill, New York, N.Y.).
[39][0033] Доступны пакеты программного обеспечения и базы данных для определения, например, антигенных фрагментов, лидерных последовательностей, укладки белков, функциональных доменов, сайтов гликозилирования и выравнивания последовательностей (см., например, GenBank, пакет программ Vector NTI.RTM. (Informax, Inc, Бетесда, Мэриленд); GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc., Сан-Диего, Калифорния); DeCypher.RTM. (TimeLogic Corp., Кристал-Бэй, Невада); Menne, et al. (2000) Bioinformatics 16: 741-742; Menne, et al. (2000) Bioinformatics Applications Note 16:741-742; Wren, et al. (2002) Comput. Methods Programs Biomed. 68:177-181; von Heijne (1983) Eur. J. Biochem. 133:17-21; von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683-4690).
[40]Антагонисты рецептора лептина
[41][0034] Настоящее изобретение включает комбинации антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2), которые содержат один или более антагонистов LEPR. В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист LEPR представляет собой антитело к LEPR или его антигенсвязывающий фрагмент, которые не конкурируют с лептином за связывание с LEPR.
[42][0035] Антагонисты LEPR включают антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, а также другие вещества (например, пептиды и малые молекулы), которые специфично связываются с LEPR и проявляют антагонизм по отношению к одной или более формам биологической активности LEPR. Молекулы, которые специфично связываются с LEPR, могут упоминаться как «противодействующие LEPR». В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист LEPR подавляет передачу сигнала, опосредованную LEPR, например, путем связывания с LEPR человека и проявления антагонизма по отношению к активации LEPR-зависимого внутриклеточного сигнального каскада. Антагонизм в отношении LEPR в варианте осуществления настоящего изобретения может быть достигнут путем блокирования связывания LEPR/лептин, например, путем образования комплекса между антагонистом и лептином или LEPR или ими обоими. Антагонизм в отношении передачи сигнала, опосредованной LEPR, включает, например, снижение LEPR-зависимой транскрипционной активации STAT3. См., например, Villanueva & Myers, Int. J. Obes. 32(Suppl 7): S8-12 (2008) и Park & Ahima, F1000Prime Reports 6:73 (2014).
[43][0036] В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист LEPR представляет собой мутантный вариант лептина, например, пегилированный мутантный лептин. Например, в варианте осуществления настоящего изобретения антагонист LEPR представляет собой полипептид лептин млекопитающего (например, человека), в котором гидрофобный сайт связывания LDFI модифицирован так, что от двух до четырех аминокислотных остатков указанного гидрофобного сайта связывания заменены другими аминокислотными остатками так, что сайт становится менее гидрофобным, при этом указанный модифицированный полипептид лептин млекопитающего является антагонистом лептина; или фрагмент указанного модифицированного полипептида лептина млекопитающего содержит указанный измененный гидрофобный сайт связывания, где указанный фрагмент сам по себе является антагонистом лептина. Например, при этом две или более аминокислоты мотива LDFI заменены аланином, аргинином, аспарагиновой кислотой, глутаминовой кислотой, глицином, лизином или серином, например, характеризуются мутациями L39A/D40A/F41A/I42A. Такой мутантный вариант лептина может быть пегилированным, например, иметь одну или более молекул PEG массой 4000-6000 дальтонов. См. патент США №7307142.
[44][0037] В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист LEPR представляет собой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, выбранный из H4H17322P2, H4H18437P2, H4H18439P2, H4H18440P2, H4H18457P2, H4H18462P2, H4H18464P2, H4H18466P2 и H4H18508P2; или любые другие антитело или антигенсвязывающий фрагмент, представленные в WO2018/089532.
[45][0038] В варианте осуществления настоящего изобретения антитело к LEPR представляет собой H4H18457P2.
[46][0039] В варианте осуществления настоящего изобретения антитело к LEPR или фрагмент по настоящему изобретению содержат:
[47](i) HCDR (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) вариабельной области тяжелой цепи (или имеют варианты одной или более HCDR) и/или LCDR (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) вариабельной области легкой цепи (или имеют варианты одной или более LCDR) антитела, выбранного из H4H17322P2, H4H18437P2, H4H18439P2, H4H18440P2, H4H18457P2, H4H18462P2, H4H18464P2, H4H18466P2 и H4H18508P2; и/или
[48](ii) вариабельную область тяжелой цепи (или ее вариант) и/или вариабельную область легкой цепи (или ее вариант) антитела, выбранного из H4H17322P2, H4H18437P2, H4H18439P2, H4H18440P2, H4H18457P2, H4H18462P2, H4H18464P2, H4H18466P2 и H4H18508P2;
[49]и/или характеризуются как:
[50](iii) конкурирующие за связывание с LEPR (например, LEPR с С-концевой меткой myc-myc-His6) с H4H17322P2, H4H18437P2, H4H18439P2, H4H18440P2, H4H18457P2, H4H18462P2, H4H18464P2, H4H18466P2 и/или H4H18508P2;
[52](iv) связывающиеся с LEPR в том же эпитопе, что и H4H17322P2, H4H18437P2, H4H18439P2, H4H18440P2, H4H18457P2, H4H18462P2, H4H18464P2, H4H18466P2 и/или H4H18508P2, например, где эпитоп представляет собой внеклеточный домен LEPR, домен 2 CRH (гомологии рецепторов цитокинов) LEPR, домен CRH2, домен FNII (фибронектиновый III типа) или домен Ig(D3).
[53][0040] См. публикацию международной патентной заявки № WO2018/89532.
[54][0041] В варианте осуществления настоящего изобретения такие антитело или фрагмент содержат константный домен тяжелой цепи, выбранный из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и/или константный домен легкой цепи, выбранный из каппа- и лямбда-типа.
[55][0042] В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист LEPR представляет собой антитело H4H18457P2 или его антигенсвязывающий фрагмент.
[56][0043] В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист LEPR представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие:
[57](1) VH, содержащую аминокислотную последовательность:
[58]EVQLVESGGSVVRPGESLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGISWNGGITVYADSVKGRFTVSRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARARYGGADYWGQGTLVTVSS
[59](SEQ ID NO: 1 или ее вариант),
[61]VL, содержащую аминокислотную последовательность:
[62]DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 2 или ее вариант);
[65]VL, содержащую ее CDR-L, например:
[66]CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: Gln Ser Ile Ser Ser Tyr (SEQ ID NO: 3 или ее вариант);
[67]CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: Ala Ala Ser (SEQ ID NO: 4 или ее вариант); и
[68]CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr (SEQ ID NO: 5 или ее вариант); и/или
[69]VH, содержащую ее CDR-H, например:
[70]CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly (SEQ ID NO: 6 или ее вариант);
[71]CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ile Thr (SEQ ID NO: 7 или ее вариант); и
[72]CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: Ala Arg Ala Arg Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr (SEQ ID NO: 8 или ее вариант);
[75]тяжелую цепь иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность:
[76]EVQLVESGGSVVRPGESLRLSCAASGFTFDDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGISWNGGITVYADSVKGRFTVSRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYHCARARYGGADYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 25) (или ее вариант),
[78]легкую цепь иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность:
[79]DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPITFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 26) (или ее вариант).
[80]В варианте осуществления настоящего изобретения такая VL связана с константным доменом легкой каппа- или лямбда-цепи иммуноглобулина человека, и/или такая VH связана с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 (например, IgG4 с мутацией S228P)) человека.
[82][0045] Настоящее изобретение включает комбинации антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2), которые содержат один или более антагонистов GDF8.
[83][0046] Антагонисты GDF8 включают антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, а также другие вещества (например, пептиды и малые молекулы), которые специфично связываются с GDF8 и проявляют антагонизм по отношению к одной или более формам биологической активности GDF8. Молекулы, которые специфично связываются с GDF8, могут упоминаться как «противодействующие GDF8». Например, в варианте осуществления настоящего изобретения антагонист блокирует взаимодействие между GDF8 и активином RIIB (или его продуктом слияния с Fc) или подавляет SMAD-зависимую активацию клеток A204, стабильно экспрессирующих Smad-зависимую (CAGA12) люциферазу.
[84][0047] В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист GDF8 представляет собой малую молекулу, такую как дорсоморфин (Millipore Sigma; Сент-Луис, Миссури) или LDN-193189 (Millipore Sigma; Сент-Луис, Миссури).
[85][0048] В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист GDF8 специфично связывает GDF8, но, например, не связывает другие лиганды ActRIIB, такие как GDF3, BMP2, BMP4, BMP7, BMP9, BMP10, GDF11, активин А, активин B, активин AB и/или Nodal.
[86][0049] В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист GDF8 представляет собой антитело к GDF8 или его антигенcвязывающий фрагмент. Антитела к GDF8 упоминаются, например, в патентах США №№6096506; 7320789; 7261893; 7807159; 7888486; 7635760; 7632499; в публикациях заявок на патент США №№2007/0178095; 2010/0166764 и 2009/0148436; а также в публикации международной патентной заявки №WO2010/070094.
[87][0050] Антитела к GDF8 также описаны в заявке на патент США №13/115170, поданной 25 мая 2011 г. и опубликованной как US2011/0293630, теперь патент США №8840894, или международной патентной заявке №PCT/US2012/064911, поданной 14 ноября 2012 г. (WO2013/074557), включая антитела, обозначенные как 21-E5; 21-B9; 21-E9; 21-A2; 22-D3; 22-E6; 22-G10; 1A2; 20B12; 58C8; 19F2; 8D12-1 (или 8D12); 4E3-7; 9B11-12; 4B9; 1H4-5; 9B4-3; 3E2-1; 4G3-25; 4B6-6; H4H1657N2 или H4H1669P, или их антигенсвязывающий фрагмент.
[88][0051] В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист GDF8 представляет собой антитело к GDF8 или антигенcвязывающий фрагмент, выбранные из 21-E5; 21-B9; 21-E9; 21-A2; 22-D3; 22-E6; 22-G10; 1A2; 20B12; 58C8; 19F2; 8D12-1 (или 8D12); 4E3-7; 9B11-12; 4B9; 1H4-5; 9B4-3; 3E2-1; 4G3-25; 4B6-6; H4H1657N2 или H4H1669P; или любые антитело к GDF8 или антигенсвязывающий фрагмент, представленные в US2011/0293630.
[89][0052] В варианте осуществления настоящего изобретения антитело к GDF8 представляет собой H4H1657N2.
[90][0053] В варианте осуществления настоящего изобретения антитело к GDF8 или фрагмент по настоящему изобретению содержат:
[91](i) HCDR (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) вариабельной области тяжелой цепи (или имеют варианты одной или более HCDR) и/или LCDR (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) вариабельной области легкой цепи (или имеют варианты одной или более LCDR) антитела, выбранного из 21-E5; 21-B9; 21-E9; 21-A2; 22-D3; 22-E6; 22-G10; 1A2; 20B12; 58C8; 19F2; 8D12-1 (или 8D12); 4E3-7; 9B11-12; 4B9; 1H4-5; 9B4-3; 3E2-1; 4G3-25; 4B6-6; H4H1657N2 или H4H1669P; и/или
[92](ii) вариабельную область тяжелой цепи (или ее вариант) и/или вариабельную область легкой цепи (или ее вариант) антитела, выбранного из 21-E5; 21-B9; 21-E9; 21-A2; 22-D3; 22-E6; 22-G10; 1A2; 20B12; 58C8; 19F2; 8D12-1 (или 8D12); 4E3-7; 9B11-12; 4B9; 1H4-5; 9B4-3; 3E2-1; 4G3-25; 4B6-6; H4H1657N2 или H4H1669P;
[93]и/или характеризуются как:
[94](iii) конкурирующие за связывание с GDF8 с 21-E5; 21-B9; 21-E9; 21-A2; 22-D3; 22-E6; 22-G10; 1A2; 20B12; 58C8; 19F2; 8D12-1 (или 8D12); 4E3-7; 9B11-12; 4B9; 1H4-5; 9B4-3; 3E2-1; 4G3-25; 4B6-6; H4H1657N2 или H4H1669P;
[96](iv) связывающиеся с GDF8 в том же эпитопе, что и 21-E5; 21-B9; 21-E9; 21-A2; 22-D3; 22-E6; 22-G10; 1A2; 20B12; 58C8; 19F2; 8D12-1 (или 8D12); 4E3-7; 9B11-12; 4B9; 1H4-5; 9B4-3; 3E2-1; 4G3-25; 4B6-6; H4H1657N2 или H4H1669P, например, где эпитоп представляет собой аминокислоты 1-14, 48-65, 48-69, 48-72, 52-65, 52-72, 56-65, 56-72 и/или 73-90 GDF8 или пептид, состоящий из этих аминокислот (например, содержащий С-концевую метку, такую как биотин).
[97][0054] См. опубликованную заявку на патент США № US2011/0293630. В варианте осуществления настоящего изобретения такие антитело или фрагмент содержат константный домен тяжелой цепи, выбранный из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и/или константный домен легкой цепи, выбранный из каппа- и лямбда-типа.
[98][0055] Антитело H4H1657N2 может упоминаться как REGN1033 или тревогрумаб.
[99][0056] В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист GDF8 представляет собой антитело или его антигенcвязывающий фрагмент, содержащие:
[101]VH, содержащую аминокислотную последовательность:
[102]EVQVLESGGDLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYAMTWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSAYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGAWKMSGLDVWGQGTTVIVSS
[103](SEQ ID NO: 9 или ее вариант);
[105]VL, содержащую аминокислотную последовательность:
[106]DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCRASQDISDYLAWYQQKPGKIPRLLIYTTSTLQSGVPSRFRGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYDSAPLTFGGGTKVEIK
[107](SEQ ID NO: 10 или ее вариант),
[110]VL, содержащую ее CDR-L, например:
[111]CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: Gln Asp Ile Ser Asp Tyr (SEQ ID NO: 11 или ее вариант),
[112]CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: Thr Thr Ser (SEQ ID NO: 12 или ее вариант),
[113]CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Pro Leu Thr (SEQ ID NO: 13 или ее вариант),
[115]VH, содержащую ее CDR-H, например:
[116]CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr Ala (SEQ ID NO: 14 или ее вариант),
[117]CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Ala (SEQ ID NO: 15 или ее вариант),
[118]CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: Ala Lys Asp Gly Ala Trp Lys Met Ser Gly Leu Asp Val (SEQ ID NO: 16 или ее вариант); и/или
[120]тяжелую цепь иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность:
[121]EVQVLESGGDLVQPGGSLRLSCAASGFTFSAYAMTWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSAYYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGAWKMSGLDVWGQGTTVIVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 27) (или ее вариант),
[123]легкую цепь иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность:
[124]DIQMTQSPASLSASVGDRVTITCRASQDISDYLAWYQQKPGKIPRLLIYTTSTLQSGVPSRFRGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYDSAPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 28) (или ее вариант).
[125][0057] В варианте осуществления настоящего изобретения такая VL связана с константным доменом легкой каппа- или лямбда-цепи иммуноглобулина человека, и/или такая VH связана с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 (например, IgG4 с мутацией S228P)) человека.
[126]Антагонисты активина А
[127][0058] Настоящее изобретение включает комбинации антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2), которые содержат один или более антагонистов активина A.
[128][0059] Антагонисты активина А включают антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, а также другие вещества (например, пептиды и малые молекулы), которые специфично связываются с активином А и проявляют антагонизм по отношению к одной или более формам биологической активности активина А. Молекулы, которые специфично связываются с активином А, могут упоминаться как «противодействующие активину А» или «противодействующие ActA». В варианте осуществления настоящего изобретения такой антагонист ActA:
[129](i) препятствует взаимодействию между активином А и рецептором активина А (например, рецептором активина типа IIA, рецептором активина типа IIB, рецептором активина типа I и т.д.);
[130](ii) препятствует образованию комплексов активин/рецептор активина; и/или
[131](iii) приводит к подавлению по меньшей мере одной биологической функции активина А, такой как фосфорилирование или активация рецепторов активина типа I и фосфорилирование белков SMAD2 и 3.
[132][0060] Антагонисты активина А, такие как антитела и их антигенсвязывающие фрагменты и другие вещества (например, пептиды), специфично связываются с активином А или его βA-субъединицей. Антигенспецифичный связывающий белок, который специфично связывает βA-субъединицу, может распознавать как активин А (гомодимер βA/βA), так и активин АВ (гетеродимер βA/βB). В варианте осуществления настоящего изобретения активин-А-специфичный связывающий белок связывается как с активином А, так и с активином АВ (но не с активином В). Антитела к активину А и антигенсвязывающие фрагменты упоминаются, например, в US2009/0234106. Конкретное антитело к активину А обозначается как «MAB3381» и является коммерчески доступным от R&D Systems, Inc, Миннеаполис, Миннесота. MAB3381 специфично связывает активин А (гомодимер), а также активин АВ (гетеродимер).
[133][0061] В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист активина А представляет собой антитело или антигенcвязывающий фрагмент, выбранные из H4H10423P, H4H10424P, H4H10426P, H4H10429P, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10433P2, H4H10436P2, H4H10437P2, H4H10438P2, H4H10440P2, H4H10442P2, H4H10445P2, H4H10446P22, H4H10447P2, H4H10448P2, H4H10452P2, H4H10468P2 и H2aM10965N; или любые другие антитело или антигенсвязывающий фрагмент, представленные в WO2015/017576.
[134][0062] В варианте осуществления настоящего изобретения антитело к активину А представляет собой гаретосмаб.
[135][0063] В варианте осуществления настоящего изобретения антитело к активину А или фрагмент по настоящему изобретению содержат:
[136](i) HCDR (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) вариабельной области тяжелой цепи (или имеют варианты одной или более HCDR) и/или LCDR (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) вариабельной области легкой цепи (или имеют варианты одной или более LCDR) антитела, выбранного из H4H10423P, H4H10424P, H4H10426P, H4H10429P, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10433P2, H4H10436P2, H4H10437P2, H4H10438P2, H4H10440P2, H4H10442P2, H4H10445P2, H4H10446P22, H4H10447P2, H4H10448P2, H4H10452P2, H4H10468P2 и H2aM10965N; и/или
[137](ii) вариабельную область тяжелой цепи (или ее вариант) и/или вариабельную область легкой цепи (или ее вариант) антитела, выбранного из H4H10423P, H4H10424P, H4H10426P, H4H10429P, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10433P2, H4H10436P2, H4H10437P2, H4H10438P2, H4H10440P2, H4H10442P2, H4H10445P2, H4H10446P22, H4H10447P2, H4H10448P2, H4H10452P2, H4H10468P2 или H2aM10965N;
[138]и/или характеризуются как:
[139](iii) конкурирующие за связывание с активином А с H4H10423P, H4H10424P, H4H10426P, H4H10429P, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10433P2, H4H10436P2, H4H10437P2, H4H10438P2, H4H10440P2, H4H10442P2, H4H10445P2, H4H10446P22, H4H10447P2, H4H10448P2, H4H10452P2, H4H10468P2 и/или H2aM10965N;
[141](iv) связывающиеся с активином А в том же эпитопе, что и H4H10423P, H4H10424P, H4H10426P, H4H10429P, H4H10430P, H4H10432P2, H4H10433P2, H4H10436P2, H4H10437P2, H4H10438P2, H4H10440P2, H4H10442P2, H4H10445P2, H4H10446P22, H4H10447P2, H4H10448P2, H4H10452P2, H4H10468P2 и/или H2aM10965N.
[142][0064] См. опубликованную публикацию международной патентной заявки № WO2015/017576. В варианте осуществления настоящего изобретения такие антитело или фрагмент содержат константный домен тяжелой цепи, выбранный из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, и/или константный домен легкой цепи, выбранный из каппа- и лямбда-типа.
[143][0065] Антитело H4H10446P2 может упоминаться как REGN2477 или гаретосмаб.
[144][0066] В варианте осуществления настоящего изобретения антагонист активина A представляет собой антитело или его антигенcвязывающий фрагмент, содержащие:
[146]VH, содержащую аминокислотную последовательность:
[147]QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSFSSHFWSWIRQPPGKGLEWIGYILYTGGTSFNPSLKSRVSMSVGTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARSGITFTGIIVPGSFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 17 или ее вариант);
[149]VL, содержащую аминокислотную последовательность:
[150]EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 18 или ее вариант); и/или
[152]VL, содержащую ее CDR-L, например:
[153]CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность: Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr (SEQ ID NO: 19 или ее вариант);
[154]CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность: Gly Ala Ser (SEQ ID NO: 20 или ее вариант); и
[155]CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность: Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr (SEQ ID NO: 21 или ее вариант);
[157]VH, содержащую ее CDR-H, например:
[158]CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность: Gly Gly Ser Phe Ser Ser His Phe (SEQ ID NO: 22 или ее вариант);
[159]CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность: Ile Leu Tyr Thr Gly Gly Thr (SEQ ID NO: 23 или ее вариант); и
[160]CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность: Ala Arg Ala Arg Ser Gly Ile Thr Phe Thr Gly Ile Ile Val Pro Gly Ser Phe Asp Ile (SEQ ID NO: 24 или ее вариант);
[163]тяжелую цепь иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность:
[164]QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSFSSHFWSWIRQPPGKGLEWIGYILYTGGTSFNPSLKSRVSMSVGTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARARSGITFTGIIVPGSFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO: 29) (или ее вариант),
[166]легкую цепь иммуноглобулина, содержащую аминокислотную последовательность:
[167]EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 30) (или ее вариант).
[168][0067] В варианте осуществления настоящего изобретения такая VL связана с константным доменом легкой каппа- или лямбда-цепи иммуноглобулина человека, и/или такая VH связана с константным доменом тяжелой цепи иммуноглобулина IgG (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 (например, IgG4 с мутацией S228P)) человека.
[169]Фармацевтические композиции
[170][0068] Настоящее изобретение включает фрамацевтические составы на основе комбинаций антагонистов LEPR/GDF8/ActA по настоящему изобретению (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2), содержащих, например, или один или более (например, 3) их компонентов, смешанных с фармацевтически приемлемым носителем или вспомогательным веществом. См., например, Remington's Pharmaceutical Sciences и U.S. Pharmacopoeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1984). Способы получения такого фармацевтического состава, включающие смешивание фармацевтически приемлемого носителя или вспомогательного вещества с компонентом(компонентами), составляют часть настоящего изобретения, как и фармацевтические композиции, получаемые такими способами.
[171][0069] Объем настоящего изобретения включает высушенные, например, лиофилизированные, комбинации антагонистов LEPR/GDF8/ActA по настоящему изобретению (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2), или один или более их компонентов, или фармацевтическую композицию на их основе, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель, но по сути не содержит воду. В варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтический состав является водным (содержит воду). В варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтический состав является стерильным.
[172][0070] Фармацевтические составы на основе терапевтических средств можно получить путем смешивания с приемлемыми носителями, вспомогательными веществами или стабилизаторами в виде, например, лиофилизированных порошков, взвесей, водных растворов или суспензий (см., например, Hardman et al. (2001) Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York, N.Y.; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams, and Wilkins, New York, N.Y.; Avis, et al. (eds.) (1993) Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets, Marcel Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds.) (1990) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems, Marcel Dekker, NY; Weiner and Kotkoskie (2000) Excipient Toxicity and Safety, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.).
[173][0071] Способ введения комбинаций антагонистов LEPR/GDF8/ActA может варьироваться. Пути введения включают пероральный, ректальный, чресслизистый, внутрикишечный, парентеральный; внутримышечный, подкожный, внутрикожный, интрамедуллярный, интратекальный, прямой интравентрикулярный, внутривенный, внутрибрюшинный, интраназальный, внутриглазной, ингаляционный, инсуффляционный, местный, кожный, трансдермальный или внутриартериальный.
[174][0072] В настоящем изобретении предусмотрены способы введения фармацевтических составов, содержащих комбинацию антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2) субъекту (например, человеку), включающие введение состава в организм субъекта, например, в вену, подкожно-жировую клетчатку или мышечную ткань субъекта. Например, способ включает прокалывание тела субъекта иглой шприца и инъецирование состава в организм субъекта. Такой способ включает введение состава, содержащего все три компонента комбинации, которые составлены вместе, в организм субъекта или, например, введение трех составленных по отдельности компонентов комбинации в организм субъекта.
[175][0073] В настоящем изобретении предусмотрены одна или более емкостей (например, пластиковый или стеклянный флакон, например, с крышкой, или хроматографическая колонка, полая игла или цилиндрический шприц), содержащих комбинации антагонистов LEPR/GDF8/ActA по настоящему изобретению (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2) или фармацевтическую композицию на их основе, содержащую фармацевтически приемлемый носитель. Настоящее изобретение включает способы получения одной или более емкостей, содержащих комбинацию, включающие введение компонентов комбинации в одну или более емкостей, например, в одну емкость, содержащую комбинацию компонентов, которые составлены вместе. В варианте осуществления настоящего изобретения емкость(емкости) затем включают в набор.
[176][0074] В настоящем изобретении также предусмотрены устройство, например, устройство для инъекций, содержащее комбинации антагонистов LEPR/GDF8/ActA по настоящему изобретению (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2) или фармацевтическую композицию на их основе, и способы его применения. Устройство для инъекций представляет собой устройство, с помощью которого вещество вводят в организм пациента парентеральным путем, например, внутримышечно, подкожно или внутривенно. Например, устройство для инъекций может представлять собой шприц (например, предварительно заполненный фармацевтической композицией, такой как автоинъектор, или заполняемый в момент применения, например, пользователем или врачом), который, например, содержит цилиндр или корпус для удержания жидкости, подлежащей инъекции (например, содержащей антитело или фрагмент или фармацевтическую композицию на их основе), иглу для прокалывания кожи и/или кровеносных сосудов для инъекции жидкости; а также поршень для выталкивания жидкости из цилиндра через отверстие иглы.
[177][0075] Фармацевтические композиции, раскрытые в данном документе, можно также вводить с помощью безыгольного устройства для подкожных инъекций; такого как устройства, раскрытые в патентах США №№ 6620135; 6096002; 5399163; 5383851; 5312335; 5064413; 4941880; 4790824 или 4596556. Такие безыгольные устройства и способы их применения, предусматривающие фармацевтическую композицию, также являются частью настоящего изобретения.
[178][0076] Настоящее изобретение включает способы получения одного или более устройств для инъекций (например, предварительно заполненного шприца или автоинъектора), содержащих комбинацию антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2), включающие введение компонентов комбинации в одно или более таких устройств, например, в одно устройство, содержащее компоненты комбинации, которые составлены вместе. В варианте осуществления настоящего изобретения устройство(устройства) для инъекций затем включают в набор.
[179][0077] Настоящее изобретение также включает наборы, содержащие комбинацию антагонистов LEPR/GDF8/ActA по настоящему изобретению (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2). В варианте осуществления настоящего изобретения набор содержит каждый антагонист в отдельной емкости или устройстве для инъекций (например, предварительно заполненном шприце или автоинъекторе) или все три антагониста, составленные вместе в одной емкости или устройстве для инъекций. Набор может включать листок-вкладыш в упаковке, содержащий информацию относительно фармацевтических композиций и лекарственных форм в наборе. Как правило, такая информация помогает пациентам и врачам эффективно и безопасно применять содержащиеся там фармацевтические композиции. Например, любая из следующей информации, касающейся комбинации по настоящему изобретению, может предоставляться во вкладыше: фармакокинетические параметры, фармакодинамические параметры, клинические исследования, параметры эффективности, показания к применению, противопоказания, предупреждения, меры предосторожности, побочные реакции, передозировка, надлежащая дозировка и введение, форма выпуска, надлежащие условия хранения, ссылки, информация о производителе/распространителе и патентная информация.
[181][0078] Комбинация антагонистов LEPR/GDF8/ActA продемонстрировала исключительную способность обеспечивать увеличение массы нежировых тканей у субъектов, которым вводили комбинацию. Такое увеличение массы нежировых тканей, возможно, происходит за счет увеличения жировой массы. Комбинация антагонистов LEPR/GDF8/ActA обеспечивает большее увеличение массы нежировых тканей по сравнению с блокадой только GDF8 и ActA, и происходит меньшее увеличение жировой массы по сравнению с наблюдаемым с антагонистом LEPR в отдельности. Это может быть обусловлено тем, что калории из жира теперь используются для наращивания дополнительной мышечной ткани.
[182][0079] Способы введения комбинации антагонистов LEPR/GDF8/ActA по настоящему изобретению (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2) субъекту включают введение компонентов комбинации в сочетании друг с другом в организм субъекта. Такое введение может выполняться любым приемлемым путем, например, парентерально. Такие компоненты можно составлять вместе в одной композиции или составлять в отдельных композициях. Введение одного или более компонентов в отдельных композициях может быть разделено по времени, если такие введения выполняются в качестве части схемы. В варианте осуществления настоящего изобретения способ включает инъецирование субъекту всех трех компонентов одновременно; в другом варианте осуществления настоящего изобретения антагонист GDF8 и антагонист ActA составляются вместе и инъецируются одновременно наряду с антагонистом LEPR в отдельной инъекции; в другом варианте осуществления настоящего изобретения все три антагониста инъецируются по отдельности в трех отдельных инъекциях (например, подкожным, внутривенным или внутримышечным путем или с помощью комбинации двух или трех таких путей).
[183][0080] Объем настоящего изобретения предусматривает способы увеличения потребления пищи, тучности, веса тела (например, за счет жировой массы), мышечной силы, размера мышечных волокон или массы нежировых тканей (например, за счет жировой массы) у субъекта, нуждающегося в этом, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества комбинаций антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2).
[184][0081] Кроме того, комбинации антагонистов LEPR/GDF8/ActA по настоящему изобретению (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2) можно применять для:
[185]- лечения или предупреждения заболевания или состояния, которое можно будет вылечить или интенсивность симптомов которого можно будет уменьшить до любой степени посредством антагонизма в отношении (i) LEPR (например, гиперлептинемии или повышенной экспрессии рецептора лептина OB-R, которая приводит к избыточной передаче сигнала, опосредованной LEPR), (ii) GDF8 (например, атрофии/истощения мышц) и/или (iii) ActA; и/или
[186]- лечения или предупреждения заболевания или состояния, которое можно будет вылечить или интенсивность симптомов которого можно будет уменьшить до любой степени, вызывая увеличение или обращая вспять уменьшение потребления пищи, тучности, веса тела (например, за счет жировой массы), размера мышечных волокон, мышечной силы или массы нежировых тканей (например, за счет жировой массы);
[187]путем введения субъекту терапевтически эффективного количества комбинаций антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2). Такие заболевания или состояния, которые можно лечить или предупреждать, включают, например, нарушение питания, отставание в физическом развитии, недостаточное потребление пищи/калорий, расстройства пищевого поведения, кахексию, атрофию/истощение мышц, возрастную саркопению и повреждение мышц. Такие состояния или заболевания подробно обсуждаются в данном документе.
[188][0082] Нарушение питания является примером состояния у субъекта, при котором может принести пользу терапия с помощью комбинации антагонистов LEPR/GDF8/ActA. Нарушение питания представляет собой термин, используемый для описания любого дисбаланса в питании от переедания до недоедания, например, наблюдаемого в больницах и учреждениях интернатного типа. Для целей настоящего изобретения нарушение питания относится к недоеданию (если не указано иное). Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрены способы лечения или предупреждения нарушения питания у субъекта, например, который находится в больнице или учреждении интернатного типа, посредством введения терапевтически эффективного количества комбинации антагонистов LEPR/GDF8/ActA субъекту, нуждающемуся в этом.
[189][0083] Нарушение питания может развиваться как следствие:
[190]- недостаточности пищевого рациона;
[191]- повышенных потребностей, связанных с болезненным состоянием (например, для ВИЧ-инфицированных субъектов и субъектов со СПИДом (синдромом приобретенного иммунодефицита) или муковисцидозом может требоваться увеличенный пищевой рацион для поддержания нормального веса тела), для компенсации которых увеличение пищевого рациона является недостаточным; и/или
[192]- осложнений первопричинного заболевания (например, пациенты, страдающие циррозом, хроническим панкреатитом, лактазной недостаточностью, раком поджелудочной железы, амилоидозом, целиакией, болезнью Крона, радиационным энтеритом и болезнью Аддисона, могут страдать мальабсорбцией вследствие недостаточного количества пищеварительных факторов; и у пациентов, страдающих раком или инфекционными заболеваниями (или другими заболеваниями), может развиваться кахексия на фоне первопричинного заболевания (см. ниже)), для компенсации которых увеличение пищевого рациона является недостаточным.
[193][0084] Таким образом, настоящее изобретение включает способы устранения или прекращения нарушения питания у субъекта, которое является следствием недостаточности пищевого рациона, повышенных потребностей, связанных с болезненным состоянием (например, ВИЧ или СПИДом), и/или осложнений первопричинного заболевания, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества комбинации антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2).
[194][0085] Нарушение питания ассоциировано с отрицательными исходами для пациентов, включающими более высокую частоту инфицирования и осложнений, увеличение потери мышечной массы, ухудшение заживления ран, более длительную продолжительность пребывания в больнице и увеличение заболеваемости и смертности. Таким образом, настоящее изобретение включает способы снижения частоты отрицательных исходов (например, снижения вероятности инфицирования или предупреждения ухудшения заживления ран) для субъекта, которые ассоциированы с нарушением питания, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества комбинаций антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2).
[195][0086] Существуют многочисленные инструменты скрининга и оценки питания для определения рисков нарушения питания и диагностики нарушения питания. Например, инструмент скрининга нарушения питания (MST) представляет собой простой инструмент из трех вопросов, оценивающий недавнюю потерю веса и аппетита, валидированный для применения у пациентов общемедицинского, хирургического и онкологического профиля (Anthony, Nutrition screening tools for hospitalized patients. Nutr. Clin. Pract. 2008;23:373-382; Ferguson et al., Validation of a malnutrition screening tool for patients receiving radiotherapy. Australas. Radiol. 1999;43:325-327). Мини-шкала оценки питания (MNA) была разработана специально для применения у пожилых пациентов (≥ 65 лет) в больницах, домах престарелых и сообществах и поэтому ограничена этой демографической группой (Anthony, Nutrition screening tools for hospitalized patients, Nutr. Clin. Pract. 2008;23:373-382; Gibson, Principles of Nutritional Assessment. 2nd ed. Oxford University Press, Inc; New York, NY, USA: 2005). При скрининге нутритивного риска (NRS-2002) используется недавняя потеря веса, сниженный BMI и уменьшенный пищевой рацион в комбинации с субъективной оценкой тяжести заболевания (на основании повышенных потребностей в питании и/или метаболического стресса) для генерирования балла нутритивного риска (Anthony, Nutrition screening tools for hospitalized patients, Nutr. Clin. Pract. 2008;23:373-382). Краткий опросник по оценке питания (SNAQ) из четырех пунктов был разработан для диагностики нарушения питания у госпитализированных пациентов и дает указание для направления к диетологу, а также составления плана лечебного питания (Anthony, Nutrition screening tools for hospitalized patients, Nutr. Clin. Pract. 2008;23:373-382; Kruizenga et al., Development and validation of a hospital screening tool for malnutriton: the short nutritional assessment questionnaire (SNAQ) Clin. Nutr. 2005;24:75-82). Он был валидирован для стационарного и амбулаторного применения в больницах, а также для пациентов в учреждениях интернатного типа и не требует расчета BMI (Kruizenga et al. The SNAQ(RC), an easy traffic light system as a first step in the recognition of undernutrition in residential care. J. Nutr. Health Aging. 2010;14:83-89; Neelemaat et al., Screening malnutrition in hospital outpatients. Can the SNAQ malnutrition screening tool also be applied to this population? Clin. Nutr. 2008;27:439-446). Субъективная глобальная оценка (SGA) является одним из наиболее часто применяемых инструментов оценки питания и позволяет оценить нутритивный статус путем заполнения вопросника, который включает данные об изменении веса, изменении пищевого рациона, симптомах со стороны желудочно-кишечного тракта, изменениях функциональной способности в связи с нарушением питания, а также оценке жировых запасов и мышечной массы и наличии отеков и асцита (Detsky et al., What is subjective global assessment of nutritional status? J Parenter Enteral Nutr. 1987;11:8-13).
[196][0087] Нарушение питания, связанное с госпитализацией, представляет собой состояние, которое испытывает субъект, поступивший в больницу. Состояние нарушения питания может быть уже существующим или развиться на протяжении пребывания субъекта в больнице. В настоящем изобретении предусмотрены способы лечения или предупреждения нарушения питания, связанного с госпитализацией, у субъекта, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества комбинаций антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2).
[197][0088] Нарушение питания также является распространенным состоянием, которым страдают субъекты с муковисцидозом. Множество сложных факторов, как связанных, так и несвязанных, могут вызывать энергетический дисбаланс у пациентов с муковисцидозом. Суммарный эффект в отношении потенциала роста значительно варьируется между пациентами в зависимости от различий в проявлении заболевания и прогрессировании заболевания. В настоящем изобретении предусмотрены способы лечения или предупреждения нарушения питания у субъекта, страдающего муковисцидозом, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества комбинаций антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2).
[198][0089] Отставание в физическом развитии в детском возрасте представляет собой состояние недоедания вследствие недостаточного потребления калорий, недостаточного поглощения калорий или чрезмерного расхода калорий. У новорожденных отставание в физическом развитии может быть ассоциировано с распространенными первопричинными заболеваниями, такими как синдром короткой кишки после некротизирующего энтероколита, заворота петли кишки и резекций кишечника, врожденные дефекты всасывания и пороки развития тонкой кишки, а также недостаточным потреблением пищи. У младенцев (в возрасте 2-8 месяцев) отставание в физическом развитии может быть ассоциировано с распространенными первопричинными заболеваниями, такими как недостаточное потребление пищи, отсутствие заботы, кишечная аллергия на белок коровьего молока, гастроэзофагеальный рефлюкс с эзофагитом, муковисцидоз, расстройства пищевого поведения и/или повышенные энергетические потребности в случае первопричинного сердечного, неврологического, онкологического или почечного заболевания, целиакия, хроническая диарея в случае дефектов иммунной системы, аутоиммунная энтеропатия, постэнтеритный синдром и формы синдрома мальабсорбции, а также делегированный синдром Мюнхгаузена. У маленьких детей (9-36 месяцев) отставание в физическом развитии может быть ассоциировано с распространенными первопричинными заболеваниями, такими как недостаточное потребление пищи, отсутствие заботы, целиакия, муковисцидоз, расстройства пищевого поведения и/или повышенные энергетические потребности в случае первопричинного сердечного, неврологического, онкологического или почечного заболевания, хроническая диарея в случае дефектов иммунной системы и делегированный синдром Мюнхгаузена. У детей (3-16 лет) отставание в физическом развитии может быть ассоциировано с распространенными первопричинными заболеваниями, такими как недостаточное потребление пищи, отсутствие заботы, психические расстройства, такие как нервная анорексия, хронические воспалительные кишечные нарушения, целиакия, муковисцидоз, расстройства пищевого поведения и/или повышенные энергетические потребности в случае первопричинного сердечного, неврологического, онкологического или почечного заболевания, хроническая диарея в случае дефектов иммунной системы и лямблиоза и другие хронические кишечные инфекции. В настоящем изобретении предусмотрены способы лечения или предупреждения отставания в физическом развитии в детском возрасте у субъекта (например, у новорожденного, младенца, маленького ребенка или ребенка), например, которое характеризуется наличием любого одного или более заболеваний или состояний, обсуждаемых в данном документе, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества комбинаций антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2).
[199][0090] Недостаточное потребление пищи может быть ассоциировано со следующими симптомами: потерей аппетита, хронической рвотой, нарушениями глотания и жевания, пищеводной дискинезией и одышкой, например, ассоциированной с нарушениями со стороны сердца и легких. В настоящем изобретении предусмотрены способы лечения или предупреждения недостаточного потребления пищи, например, ассоциированного с симптомами, обсуждаемыми в данном документе, у субъекта, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества комбинаций антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2).
[200][0091] Расстройства пищевого поведения, характеризующиеся недостаточным потреблением калорий, включают анорексию и/или булимию. В настоящем изобретении предусмотрены способы лечения или предупреждения анорексии и/или булимии у субъекта, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества комбинаций антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2). В варианте осуществления настоящего изобретения анорексия представляет собой нервную анорексию, старческую анорексию, анорексию у пациента, получающего гемодиализ.
[201][0092] Кахексия является сложным метаболическим синдромом, зачастую ассоциированным с первопричинным заболеванием и характеризующимся потерей мышечной массы с потерей или без потери жировой массы. Выраженным клиническим признаком кахексии является потеря веса у взрослых (с поправкой на задержку жидкости) или отставание в росте у детей (за исключением эндокринных нарушений). Анорексия, воспаление, инсулинорезистентность и повышенное расщепление мышечных белков являются симптомами, часто ассоциированными с кахексией. В настоящем изобретении предусмотрены способы лечения или предупреждения кахексии (или любых симптомов кахексии), например, на любой стадии, представленной в данном документе (например, рефрактерной кахексии) и/или определенной любым критерием, представленным в данном документе или в уровне техники, у субъекта, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества комбинаций антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2).
[202][0093] Кахексия на фоне других заболеваний, состояний или процедур лечения включает кахексию на фоне анорексии или других психических расстройств пищевого поведения, заболевания легких (например, хронического обструктивного заболевания легких (COPD)), хронического заболевания почек, инфекционного заболевания (например, ВИЧ-инфекции или синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД)), застойной сердечной недостаточности, осложнений лучевой терапии, рака (например, гепатоцеллюлярной карциномы, меланомы и/или рака молочной железы), хронической сердечной недостаточности, аутоиммунных нарушений (например, воспалительного заболевания кишечника, красной волчанки, рассеянного склероза, ревматоидного артрита, болезни Крона или псориаза), муковисцидоза, сердечно-сосудистых заболеваний, повышенного кровяного давления, депрессии и/или нейродегенеративных нарушений. В настоящем изобретении предусмотрены способы лечения или предупреждения кахексии, которая развивается на фоне любого заболевания или состояния, например, любого из заболеваний или состояний, представленных в данном документе (например, рака), у субъекта, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества комбинаций антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2).
[203][0094] В международном консенсусном заявлении по определению и классификации раковой кахексии, опубликованном в мае 2011 года в Lancet Oncology, установлены такие критерии для диагностики кахексии у пациентов с раком:
[204](i) потеря веса более чем на 5 процентов за последние 6 месяцев; или
[205](ii) BMI менее 20 и любая степень потери веса более чем на 2 процента; или
[206](iii) индекс аппендикулярной скелетной мускулатуры, соответствующий саркопении (другому синдрому истощения), и потеря веса более чем на 2 процента. Fearon et al., Lancet Oncol. 2011 May;12(5):489-95.
[207][0095] Стадиями раковой кахексии, согласованными группой, являются:
[208]прекахексия: потеря веса менее чем на 5 процентов наряду с другими симптомами, такими как нарушение толерантности к глюкозе или анорексия;
[209]кахексия: потеря веса более чем на 5 процентов или другие симптомы и состояния, соответствующие диагностическим критериям кахексии; и
[210]рефрактерная кахексия: пациенты, испытывающие кахексию, которые больше не отвечают на лечение рака, имеют низкий балл функционального статуса, и ожидаемая продолжительность жизни которых составляет менее 3 месяцев.
[211][0096] Атрофия или истощение мышц происходит в мышцах при денервации или бездеятельности, но также является системным ответом на голодание и различные заболевания и состояния. Атрофия мышц может проявляться в форме миопении, представляющей собой снижение мышечной массы, и/или динапении, представляющей собой снижение мышечной силы. Эти заболевания и состояния включают сепсис, СПИД, почечную и сердечную недостаточность, избыток глюкокортикоидов (например, синдром Кушинга) и травму, и атрофия мышц также встречается у 80% пациентов с раком. В дополнение, атрофия или истощение мышц могут быть вызваны бездействием, иммобилизацией, постельным режимом, телесным повреждением (например, переломом бедра), нейродегенеративными заболеваниями, ассоциированными с потерей двигательных нейронов, медицинским лечением или хирургическим вмешательством (например, заменой тазобедренного сустава, заменой коленного сустава и т.д.) или необходимостью искусственной вентиляции легких или ассоциированы с ними. В настоящем изобретении предусмотрены способы лечения или предупреждения атрофии или истощения мышц (например, развивающихся на фоне заболевания или состояния, такого как, например, СПИД или рак) у субъекта, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества комбинаций антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2). В варианте осуществления настоящего изобретения атрофия мышц представляет собой саркопению, такую как возрастная саркопения или саркопения у субъекта, получающего гемодиализ и/или страдающего кахексией при хроническом заболевании почек. Возрастная саркопения представляет собой дегенеративную потерю массы (например, потерю на приблизительно 0,5-1% в год после достижения возраста 50 лет), качества и силы скелетных мышц, ассоциированную со старением. Таким образом, настоящее изобретение включает способы лечения или предупреждения атрофии мышц вследствие возрастной саркопении.
[212][0097] Повреждение мышц может быть вызвано растяжением от перенапряжения или внезапным скручиванием, например, растяжением или разрывом. Разрыв мышцы может вызывать набухание, боль и сильное кровотечение, которое может приводить к образованию тромба. Серьезные разрывы могут требовать хирургического вмешательства. Свойства стимуляции мышц, присущие комбинациям антагонистов LEPR/GDF8/ActA, делают их применимыми для лечения или предупреждения повреждения мышц. В настоящем изобретении предусмотрены способы лечения или предупреждения повреждения мышц у субъекта, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества комбинаций антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2).
[213][0098] Другие состояния, которые можно лечить или предупреждать, применяя комбинации антагонистов LEPR/GDF8/ActA по настоящему изобретению, включают боковой амиотрофический склероз, артрит, аутоиммунные нарушения, доброкачественную и злокачественную феохромоцитому, рак молочной железы, рак, сердечно-сосудистые заболевания, хроническую сердечную недостаточность, хроническое обструктивное заболевание легких, депрессию, сахарный диабет, повышенное кровяное давление, миопатию, индуцированную глюкокортикоидами, гепатоцеллюлярную карциному, воспалительное заболевание кишечника, келоидные и гипертрофические рубцы, красную волчанку, меланому, формы метаболического синдрома, рассеянный склероз, мышечную дистрофию (например, миотоническую, Дюшенна, Беккера, конечностно-поясную, плече-лопаточно-лицевую (FSHD, также известную как болезнь Ландузи-Дежерина), врожденную, окулофарингеальную, дистальную, Эмери-Дрейфуса и т.д.), нейродегенеративные нарушения, атрофию органов, остеоартрит, остеопению, остеопороз, болезнь Паркинсона, преэклампсию, псориаз, легочную артериальную гипертензию, саркопению, сепсис и маточные фиброиды/лейомиомы матки.
[214][0099] Комбинации антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2) по настоящему изобретению являются эффективными для увеличения сухой мышечной массы и мышечной силы и, таким образом, являются эффективными для повышения спортивных способностей. Таким образом, в настоящем изобретении предусмотрены способы повышения спортивных способностей у субъекта, нуждающегося в этом, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества комбинаций антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2). Спортивные способности включают скорость ходьбы, скорость бега, способность садиться и вставать за единицу времени (например, за 30 секунд), проходимое расстояние за единицу времени (например, за 6 минут), вес при подъеме на бицепс, вес при жиме лежа, скорость подъема по лестнице (например, время для подъема на 4 ступени) и/или силу хвата руки (например, измеряемую с помощью ручной динамометрии). В варианте осуществления настоящего изобретения субъект проходит реабилитацию после инсульта (например , реабилитацию при гемипарезе после инсульта) или физиотерапию. Таким образом, комбинации антагонистов LEPR/GDF8/ActA по настоящему изобретению могут применяться как вспомогательное средство в любой терапевтической процедуре, где будет желательно увеличение спортивных способностей, например, в физиотерапии, например, при реабилитации после инсульта или для восстановления после хирургической операции (например, хирургической операции на коленном суставе для восстановления поврежденных сухожилий или связок или замены коленного сустава) или телесного повреждения.
[215][00100] Субъекты (например, люди), которым вводили антагонисты рецептора лептина (например, антитела к LEPR), могут претерпевать увеличенные уровни триглицеридов в печени или уровни триглицеридов в сыворотке крови. Одним способом снижения этих повышенных уровней является введение в сочетании с антагонистом LEPR антагониста активина А (например, антитела к ActA или его антигенсвязывающего фрагмента) и антагониста GDF8 (например, антитела к GDF8 или его антигенсвязывающего фрагмента). Например, такой способ может включать введение терапевтически эффективного количества комбинации антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2).
[216][00101] «Субъект» является млекопитающим, таким как, например, человек, собака, кошка, лошадь, корова, мышь, крыса, обезьяна (например, яванский макак, например, Macaca fascicularis или Macaca mulatta) или кролик.
[217][00102] Эффективная или терапевтически эффективная доза комбинаций антагонистов LEPR/GDF8/ActA (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2) по настоящему изобретению составляет от приблизительно 0,1 до приблизительно 200 мг/кг (всех трех антител или антигенсвязывающих фрагментов), например, для лечения или предупреждения любого из заболеваний или состояний, обсуждаемых в данном документе (например, кахексии).
[218][00103] В конкретных вариантах осуществления комбинации антагонистов LEPR/GDF8/ActA по настоящему изобретению (например, H4H18457P2/H4H1657N2/H4H10446P2) можно применять в отдельности или в сочетании с любыми другими дополнительными терапевтическими средствами и/или терапевтическими процедурами, например, которые являются применимыми для увеличения потребления пищи, тучности, веса тела, массы нежировых тканей (например, мышечной массы) и/или силы у субъекта и/или для лечения или предупреждения любого из заболеваний или состояний, обсуждаемых в данном документе, например, кахексии.
[219][00104] В варианте осуществления настоящего изобретения терапевтическая процедура представляет собой кормление через назогастральный зонд.
[220][00105] В варианте осуществления настоящего изобретения дополнительное терапевтическое средство представляет собой любое одно или более из стимулятора аппетита, каннабиноида, ингибитора ангиотензинпревращающего фермента (ACE), блокатора рецепторов ангиотензина, релаксанта гладкой мускулатуры, нитрата, диуретика, железа, бронходилататора, антихолинергического средства, кортикостероида, антибиотика, нестероидного противовоспалительного лекарственного средства (NSAID), иммунодепрессанта, ингибитора HMG-CoA-редуктазы, антидепрессанта, средства противораковой терапии или средства для местного применения.
[221][00106] В варианте осуществления настоящего изобретения дополнительное терапевтическое средство представляет собой любое одно или более из 5-фторурацила (5-FU), 6-меркаптопурина, комбинации аторвастатина и амлодипина, комбинации ловастатина и ниацина, комбинации, такой как симвастатин и эзетимиб, атропина, адалимумаба, альбутерола, алефацепта, алемтузумаба, амитриптилина, анаморелина, арформотерола, аспирина, аторвастатина, атропина, азатиоприна, азитромицина, беназеприла, бетаметазона, будесонида, буметанида, буфенина, бупропиона, каптоприла, карбоплатина, целекоксиба, цертолизумаба пегола, хлортиазида, хлорталидона, циклоспорина, циталопрама, кленбутерола, каменноугольного дегтя, кокосового масла, кортикостероидов, ципрогептадина, циклофосфамида, дабрафениба, даклизумаба, дезоксиметазона, десвенлафаксина, дексаметазона, диклофенака, дицикломина, дифлунисала, димеболина, диметилфумарата, диметилфумарата, дитранола, доцетаксела, допексамина, доксорубицина, дронабинола, дулоксетина, эфализумаба, эналаприла, энобосарма, эпинефрина, эпирубицина, эритромицина, эсциталопрама, этанерцепта, этакрината, этодолака, фенотерола, финголимода, флунизолида, флуоцинонида, флуокортолона, флуоксетина, флувастатина, формотерола, фозиноприла, фуросемида, глатирамера ацетата, голимумаба, гидралазина, гидрохлортиазида, гидрокортизона, гидрокортизон-17-бутирата, гидрокортизон-17-валерата, гидроксикарбамида, гиосциамина, гиосциамина, ибупрофена, индапамида, индометацина, инфликсимаба, интерферона бета-1a, интерферона бета-1b, интерлейкина-2, ипилимумаба, изоэтарина, изопреналина, изопротеренола, изосорбида динитрата, JX-594, кетопрофена, левосальбутамола, лизиноприла, ловастатина, мегестрола, мегестрола ацетата, мепензолата, месалазина, метотрексата, метотрексата, метилклотиазида, метолазона, мевастатина, митоксантрона, моэксиприла, набилона, напроксена, натализумаба, ниволумаба, нортриптилина, окрелизумаба, офатумумаба, биологически активных пероральных пищевых добавок (например, печенья Protibis или добавок на молочной основе), орципреналина, оксапрозина, паклитаксела, пара-аминобензойной кислоты, железа для парентерального применения, пароксетина, пембролизумаба, периндоприла, фенобарбитала, фенобарбитала, фенобарбитала и скополамина, пирбутерола, пироксикама, питавастатина, правастатина, преднизолона, преднизона, преднизона, прокатерола, пролин-богатого пептида (PRP) 1, псоралена, квинаприла, рамиприла, ритодрина, ритуксимаба, розувастатина, сальбутамола, салсалата, скополамина, сертралина, симвастатина, сорафениба, сулиндака, тербуталина, терифлуномида, теофиллина, тиотропия, толметина, торсемида, траметиниба, трандолаприла, тразодона, триамцинолона ацетонида, триамцинолона в спиртовой форме, вемурафениба, венлафацина, венлафаксина, витамина D3 или аналога витамина D.
[222][00107] Настоящее изобретение также охватывает варианты осуществления, где комбинация антагонистов LEPR/GDF8/ActA применяется не в сочетании с дополнительным терапевтическим средством и/или процедурой.
[224][00108] Эти примеры предназначены для иллюстрации настоящего изобретения и не являются его ограничением. Композиции, например, комбинации антагонистов LEPR/GDF8/ActA, и способы, представленные в примерах, составляют часть настоящего изобретения.
[225][00109] Пример 1. Тестирование эффективности антагонистических антител к LEPR (H4H17322P2, H4H18457P2 и H4H18464P2) у гуманизированных по LEPR мышей in vivo
[226][00110] Эффекты трех специфичных антагонистических антител к LEPR по настоящему изобретению - H4H17322P2, H4H18457P2 и H4H18464P2 - в отношении потребления пищи, веса тела и тучности определяли у содержащихся по одной особи мышей LEPRHu/Hu, полученных методами генной инженерии, которые экспрессируют рецептор лептина, состоящий из последовательности эктодомена LEPR человека вместо последовательности эктодомена LEPR мыши.
[227][00111] Исходный уровень суточного потребления пищи измеряли в период между 5 днями и 1 днем до обработки (в дни -5 и -1). Композиционный состав тела, в том числе тучность, определяли количественно за четыре дня до обработки и через 6 дней после обработки (в дни -4 и 6) посредством μCT. В день 0 тридцать два самца мышей LEPRHu/Hu в возрасте от 12 до 13 недель рандомизировали в четыре группы по 8 мышей в зависимости от веса тела с 1 дня до обработки (дня -1). В день 0 каждая группа получала путем подкожной инъекции однократную дозу антитела изотипического контроля в дозе 30 мг/кг, H4H17322P2 в дозе 30 мг/кг, H4H18457P2 в дозе 30 мг/кг либо H4H18464P2 в дозе 30 мг/кг. Антитело изотипического контроля не связывает ни один известный белок мыши. Вес тела измеряли на протяжении исследования для каждого животного (таблица 1А). Процентное изменение веса тела относительно дня 0 рассчитывали для каждого животного в каждый момент времени. В таблице 1B обобщены показатели средней жировой массы и массы нежировых тканей животных в каждой группе обработки антителами, определенные количественно посредством μCT за 6 дней до и через 6 дней после обработки антителами. Все результаты выражены в виде среднего значения ± SEM. Кроме того, количественно определяли уровень лептина в плазме крови как перед введением дозы, так и в день 6 (таблица 1C).
[228][00112] Мыши, обработанные с помощью антагонистических антител к LEPR, демонстрировали увеличения процентного изменения потребления пищи (данные не показаны) и изменения в весе тела (таблица 1A). Эти увеличения не наблюдались при обработке антителами изотипического контроля. Мыши, обработанные с помощью H4H17322P2 в дозе 30 мг/кг, демонстрировали значимые увеличения потребления пищи, начиная с одного дня после обработки (дня 1) и в последующие моменты времени, по сравнению с мышами, которым инъецировали антитело изотипического контроля. Мыши, обработанные с помощью H4H18457P2 в дозе 30 мг/кг, демонстрировали значимое увеличение потребления пищи, начиная с дня 2 и в последующие моменты времени, по сравнению с мышами, которым инъецировали антитело изотипического контроля. Мыши, обработанные с помощью H4H18464P2 в дозе 30 мг/кг, демонстрировали значимое увеличение потребления пищи, начиная с дня 2 и в последующие моменты времени, но не в день 4, по сравнению с мышами, которым инъецировали антитело изотипического контроля. Мыши, обработанные с помощью H4H17322P2 в дозе 30 мг/кг, демонстрировали значимое увеличение процентного изменения веса тела, начиная с четырех дней после обработки (дня 4) и в последующие моменты времени, по сравнению с мышами, которым инъецировали антитело изотипического контроля. Мыши, обработанные с помощью H4H18457P2 в дозе 30 мг/кг, демонстрировали значимое увеличение процентного изменения веса тела, начиная с дня 3 и в последующие моменты времени, по сравнению с мышами, которым инъецировали антитело изотипического контроля. Мыши, обработанные с помощью H4H18464P2 в дозе 30 мг/кг, демонстрировали значимое увеличение процентного изменения веса тела, начиная с дня 4 и в последующие моменты времени, по сравнению с мышами, которым инъецировали антитело изотипического контроля. Как показано в таблице 1B, между группами до обработки не было различий в жировой массе (день -4). Мыши, обработанные с помощью антител H4H17322P2, H4H18457P2 и H4H18464P2 в дозе 30 мг/кг, демонстрировали значимое увеличение жировой массы и уровней лептина через 6 дней после обработки (в день 6) по сравнению с антителом изотипического контроля (таблица 1C). В заключение, обработка с помощью антагонистического антитела к LEPR, но не антитела изотипического контроля, приводила к увеличению потребления пищи, веса тела, тучности и уровней лептина у мышей.
[229]Таблица 1A. Вес тела (г отличия относительно исходного уровня)
[230] | REGN1945, 30 мг/кг | H4H18457, 30 мг/кг | H4H18464, 30 мг/кг | H4H17322, 30 мг/кг |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| День 0 | 0,000 | 0,000 | 12 | 0,000 | 0,000 | 12 | 0,000 | 0,000 | 12 | 0,000 | 0,000 | 12 |
| День 1 | 0,088 | 0.137 | 12 | 0,597 | 0,149 | 12 | 0,300 | 0,153 | 12 | 0,331 | 0,142 | 12 |
| День 4 | -0,052 | 0,322 | 12 | 2,505 | 0,158 | 12 | 2,215 | 0,212 | 12 | 1,169 | 0,181 | 12 |
| День 5 | 0,405 | 0,144 | 12 | 2,679 | 0,204 | 12 | 2,433 | 0,239 | 12 | 1,178 | 0,194 | 12 |
| День 6 | 0,093 | 0,171 | 12 | 2,563 | 0,282 | 12 | 2,062 | 0,229 | 12 | 1,021 | 0,180 | 12 |
| День 8 | 0,563 | 0,128 | 12 | 3,243 | 0,323 | 12 | 2,959 | 0,360 | 12 | 1,710 | 0,364 | 12 |
| День 11 | 0,289 | 0,283 | 12 | 3,604 | 0,367 | 12 | 2,927 | 0,434 | 12 | 2,165 | 0,299 | 12 |
| День 13 | 0,356 | 0,233 | 12 | 3,091 | 0,413 | 12 | 2,116 | 0,317 | 12 | 1,678 | 0,336 | 12 |
[231]REGN1945: антитело к Fel d1 (IgG4)
[232]SEM: стандартная ошибка среднего
[233]Таблица 1B. Композиционный состав тела
[234] | REGN1945, 30 мг/кг | H4H18457, 30 мг/кг | H4H18464, 30 мг/кг | H4H17322, 30 мг/кг |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| Жировая масса (г отличия относительно исходного уровня) | 0,033 | 0,141 | 12 | 1,563 | 0,168 | 12 | 1,396 | 0,217 | 12 | 0,767 | 0,123 | 12 |
| Масса нежировых тканей (г отличия относительно исходного уровня) | 0,576 | 0,485 | 12 | 0,718 | 0,153 | 12 | 0,724 | 0,297 | 12 | 0,624 | 0,331 | 12 |
[235]Таблица 1C. Лептин в плазме крови (пг/мл)
[236] | REGN1945, 30 мг/кг | H4H18457, 30 мг/кг | H4H18464, 30 мг/кг | H4H17322, 30 мг/кг |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| Перед введением дозы | 690,590 | 101,890 | 12 | 1202,452 | 293,789 | 12 | 1068,469 | 224,895 | 12 | 952,510 | 190,816 | 12 |
| День 6 | 983,476 | 136,172 | 12 | 5956,415 | 977,674 | 12 | 4467,408 | 651,147 | 12 | 3630,862 | 442,252 | 12 |
[237][00113] Пример 2. Комбинированная обработка с помощью mAb к GDF8 (REGN1033), mAb к активину А (REGN2477) и антагонистического mAb к LEPR (H4H184572P2) у самцов мышей в возрасте 20-24 недели
[238][00114] Эффекты специфичного антагонистического антитела к LEPR H4H18457P2 в комбинации с блокирующими антителами к MSTN (также называемыми антителами к GDF8) и к INHBA (также называемыми антителами к активину А) - H4H1657N2 (REGN1033) и H4H10446P2 (REGN2477) соответственно - по настоящему изобретению в отношении потребления пищи, веса тела, композиционного состава тела, значений веса отдельных тканей и формирования мышечной силы ex vivo определяли у содержащихся по одной особи самцов мышей LEPRHu/Hu, полученных методами генной инженерии, в возрасте 20-24 недель, которые экспрессируют рецептор лептина, состоящий из последовательности эктодомена LEPR человека вместо последовательности эктодомена LEPR мыши.
[239][00115] Исходный уровень суточного потребления пищи измеряли в период между днями -8 и 0. В день -5 или день -1 исходный уровень массы нежировых тканей и жировой массы всего тела определяли количественно посредством ЯМР (ядерного магнитного резонанса). В день 0 мышей стратифицировали на четыре группы по 11-12 мышей в зависимости от композиционного состава тела с дня -5 и веса тела с дня 0. Начиная с дня 0, каждая группа получала обработку антителами в соответствующей дозе путем подкожной инъекции. Дозы mAb REGN1033, REGN2477 и соответствующего IgG4P вводили дважды в неделю при 10 мг/кг; и дозы mAb H4H18457P2 и соответствующего ему IgG4P вводили один раз в неделю при 30 мг/кг; таким образом, любую дозу тестируемого антитела, даваемую тестируемой мыши, давали параллельно с соответствующей дозой контрольного антитела у контрольной мыши. Антитело изотипического контроля (IgG4P) (p = означает мутацию S228P, нумерация согласно Eu) не связывало ни один известный белок мыши. Антитело изотипического контроля представляло собой REGN1945.
[241]a) Контроль IgG4P (10 мг/кг + 10 мг/кг, 2 раза в неделю; 30 мг/кг, 1 раз в неделю), N = 11
[242]b) REGN1033 + REGN2477 (10 мг/кг + 10 мг/кг, 2 раза в неделю), N = 11
[243]c) H4H18457P2 (30 мг/кг, 1 раз в неделю), N = 11
[244]d) REGN1033 + REGN2477 + H4H18457P2 (10 мг/кг + 10 мг/кг, 2 раза в неделю; 30 мг/кг, 1 раз в неделю).
[245][00116] Потребление пищи (таблица 2А) и вес тела (таблица 2B) измеряли на протяжении исследования для каждого животного. Композиционный состав тела (таблицы 2C и 4A-4D) определяли количественно в день 6 или 7 и день 13 или 14. В дни 22, 23 или 24 животных умерщвляли, и проводили измерения силы ex vivo на изолированных передних большеберцовых мышцах (таблицы 3A и 3B). Также определяли количественно значения веса отдельных органов и скелетных мышц (таблицы 5-7).
[246][00117] Мыши, обработанные с помощью H4H18457P2 в отдельности либо в комбинации с REGN1033 и REGN2477, демонстрировали значимые увеличения совокупного потребления пищи, начиная с семи дней после обработки (дня 7) и в последующие моменты времени, по сравнению с мышами, которым инъецировали антитело изотипического контроля (таблица 2A). Мыши, обработанные с помощью REGN1033 и REGN2477, демонстрировали сходное совокупное потребление пищи по сравнению с мышами, которым инъецировали антитело изотипического контроля (таблица 2A). Мыши, обработанные с помощью H4H18457P2 в отдельности либо в комбинации с REGN1033 и REGN2477, демонстрировали увеличения веса тела, начиная с 7 дней после введения дозы (дня 7) и в последующие моменты времени, по сравнению с мышами, обработанными с помощью антитела изотипического контроля, и по сравнению с мышами, обработанными с помощью REGN1033 и REGN2477 (таблица 2B). Мыши, обработанные с помощью REGN1033 и REGN2477, не демонстрировали значимых изменений веса тела по сравнению с мышами, обработанными с помощью антитела изотипического контроля (таблица 2B). Мыши в каждой группе обработки демонстрировали значимое увеличение массы нежировых тканей относительно исходного уровня (дня -1) в дни 6, 13 и 20 по сравнению с мышами, которым инъецировали изотипический контроль (таблица 4C). Мыши, обработанные с помощью H4H18457P2, REGN1033 и REGN2477, демонстрировали увеличение набора массы нежировых тканей относительно исходного уровня в дни 6, 13 и 20 по сравнению с мышами, обработанными с помощью REGN1033 и REGN2477 (таблица 4C). Мыши, обработанные с помощью REGN1033 и REGN2477, демонстрировали значимое уменьшение изменения жировой массы относительно исходного уровня по сравнению с мышами, которым вводили антитело изотипического контроля. Мыши, обработанные с помощью H4H18457P2 в отдельности либо в комбинации с REGN1033 и REGN2477, демонстрировали увеличение изменения жировой массы относительно исходного уровня в дни 6, 13 и 20 по сравнению с мышами, которым вводили антитело изотипического контроля, и по сравнению с мышами, обработанными с помощью REGN1033 и REGN2477 (таблица 4A). Мыши, обработанные с помощью H4H18457P2 в комбинации с REGN1033 и REGN2477, демонстрировали значимое снижение набора жировой массы относительно исходного уровня в дни 6, 13 и 20 по сравнению с мышами, обработанными с помощью REGN1033 и REGN2477 (таблица 4A). По сравнению с мышами, которым вводили антитело изотипического контроля, мыши, обработанные с помощью REGN1033 и REGN2477, а также мыши, обработанные с помощью H4H18457P2, REGN1033 и REN2477, демонстрировали увеличенную силу одиночного сокращения и пиковую силу тетанического сокращения (таблица 3А) изолированной передней большеберцовой скелетной мышцы. Соответственно, мыши, обработанные с помощью REGN1033 и REGN2477, и мыши, обработанные с помощью H4H18457P2, REGN1033 и REGN3477, демонстрировали увеличение значений веса скелетных мышц (четырехглавой мышцы, передней большеберцовой мышцы и икроножной мышцы) (таблица 5) по сравнению с мышами, которым вводили антитело изотипического контроля. Мыши, обработанные с помощью H4H18457P2 в отдельности и в комбинации с REGN1033 и REGN2477, демонстрировали увеличение значений веса жировой ткани паха, гонад и бурой жировой ткани (таблица 5) по сравнению с мышами, которым вводили антитело изотипического контроля. Значения веса бурой жировой ткани (таблица 5) были значимо увеличены у мышей, обработанных с помощью H4H18457P2 в комбинации с REGN1033 и REGN2477, по сравнению с мышами, обработанными с помощью REGN1033 и REGN2477. Среди групп обработки не было выявлено никаких значимых изменений значений веса сердца и печени (таблица 5) по сравнению с введением изотипического контроля. Говоря обобщенно, эти данные демонстрируют, что антагонист LEPR H4H18457P2 увеличивает потребление пищи, вес тела и увеличивает жировую массу у мышей. В дополнение, обработка с помощью комбинации антагониста LEPR H4H18457P2 с блокирующими антителами к MSTN (REGN1033) и к ActA (REGN2477) приводит к увеличению потребления пищи, веса тела, массы нежировых тканей, жировой массы, веса жировой ткани, веса скелетных мышц и силы скелетных мышц. По сравнению с обработкой с помощью REGN1033 и REGN2477 комбинированная обработка с помощью H4H18457P2, REGN1033 и REGN2477 приводит к дополнительным увеличениям массы нежировых тканей относительно исходного уровня и меньшим увеличениям жировой массы относительно исходного уровня.
[247]Таблица 2A. Потребление пищи (г)
[248] | Контрольное mAb | αGDF8 + αActA | Антагонистическое mAb к LEPR | Антагонистическое mAb к LEPR + αGDF8 + αActA |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| День 0 | 0,000 | 0,000 | 11 | 0,000 | 0,000 | 11 | 0,000 | 0,000 | 11 | 0,000 | 0,000 | 12 |
| День 1 | 3,858 | 0,274 | 11 | 3,987 | 0,158 | 11 | 4,554 | 0,380 | 11 | 4,264 | 0,204 | 12 |
| День 2 | 7,958 | 0,444 | 11 | 8,154 | 0,294 | 11 | 9,784 | 0,679 | 11 | 9,224 | 0,371 | 12 |
| День 3 | 12,148 | 0,573 | 11 | 12,330 | 0,422 | 11 | 15,246 | 0,919 | 11 | 14,618 | 0,502 | 12 |
| День 7 | 28,465 | 1,132 | 11 | 28,667 | 0,887 | 11 | 36,752 | 2,059 | 11 | 35,921 | 1,052 | 12 |
| День 8 | 32,434 | 1,299 | 11 | 32,585 | 1,039 | 11 | 42,095 | 2,394 | 11 | 41,094 | 1,109 | 12 |
| День 9 | 36,393 | 1,427 | 11 | 36,773 | 1,131 | 11 | 47,590 | 2,737 | 11 | 46,163 | 1,143 | 12 |
| День 10 | 40,386 | 1,566 | 11 | 40,853 | 1,221 | 11 | 52,779 | 2,874 | 11 | 51,400 | 1,263 | 12 |
| День 14 | 56,776 | 1,935 | 11 | 57,395 | 1,640 | 11 | 73,535 | 3,966 | 11 | 71,676 | 1,586 | 12 |
| День 15 | 60,708 | 2,059 | 11 | 61,353 | 1,802 | 11 | 78,424 | 4,353 | 11 | 76,398 | 1,604 | 12 |
| День 16 | 64,485 | 2,092 | 11 | 65,544 | 1,868 | 11 | 83,396 | 4,662 | 11 | 81,271 | 1,646 | 12 |
| День 17 | 68,394 | 2,182 | 11 | 69,716 | 1,951 | 11 | 88,506 | 4,993 | 11 | 86,352 | 1,730 | 12 |
| День 20 | 80,272 | 2,547 | 11 | 82,074 | 2,267 | 11 | 103,698 | 5,970 | 11 | 101,008 | 1,918 | 12 |
| День 21 | 83,961 | 2,518 | 11 | 85,904 | 2,326 | 11 | 108,243 | 6,360 | 11 | 105,226 | 2,016 | 12 |
[249]Таблица 2B. Вес тела (г отличия относительно исходного уровня)
[250] | Контрольное mAb (N = 11) | αGDF8 + αActA | Антагонистическое mAb к LEPR | Антагонистическое mAb к LEPR + αGDF8 + αActA |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| День 0 | 0,000 | 0,000 | 11 | 0,000 | 0,000 | 11 | 0,000 | 0,000 | 11 | 0,000 | 0,000 | 12 |
| День 1 | -0,030 | 0,092 | 11 | 0,052 | 0,064 | 11 | 0,614 | 0,172 | 11 | 0,405 | 0,158 | 12 |
| День 2 | 0,324 | 0,140 | 11 | 0,504 | 0,104 | 11 | 1,355 | 0,218 | 11 | 1,431 | 0,210 | 12 |
| День3 | 0,222 | 0,162 | 11 | 0,644 | 0,107 | 11 | 1,791 | 0,224 | 11 | 2,273 | 0,187 | 12 |
| День7 | -0,008 | 0,133 | 11 | 1,314 | 0,152 | 11 | 3,192 | 0,327 | 11 | 4,383 | 0,288 | 12 |
| День8 | 0,089 | 0,134 | 11 | 1,585 | 0,177 | 11 | 3,559 | 0,288 | 11 | 4,772 | 0,348 | 12 |
| День9 | 0,139 | 0,189 | 11 | 1,908 | 0,151 | 11 | 4,088 | 0,380 | 11 | 5,251 | 0,361 | 12 |
| День10 | -0,106 | 0,141 | 11 | 1,849 | 0,171 | 11 | 4,244 | 0,374 | 11 | 5,489 | 0,296 | 12 |
| День14 | 0,217 | 0,248 | 11 | 2,229 | 0,217 | 11 | 4,931 | 0,417 | 11 | 6,666 | 0,299 | 12 |
| День15 | 0,171 | 0,265 | 11 | 2,215 | 0,188 | 11 | 5,321 | 0,502 | 11 | 6,964 | 0,332 | 12 |
| День16 | 0,281 | 0,262 | 11 | 2,576 | 0,191 | 11 | 5,564 | 0,504 | 11 | 7,357 | 0,326 | 12 |
| День17 | 0,050 | 0,265 | 11 | 2,395 | 0,178 | 11 | 5,535 | 0,492 | 11 | 7,386 | 0,302 | 12 |
| День20 | 0,195 | 0,345 | 11 | 2,626 | 0,207 | 11 | 6,429 | 0,449 | 11 | 8,196 | 0,378 | 12 |
| День21 | -0,347 | 0,285 | 11 | 2,172 | 0,193 | 11 | 6,024 | 0,502 | 11 | 7,624 | 0,363 | 12 |
[251]Таблица 2C. Изменения композиционного состава тела относительно исходного уровня
[252] | Изменение массы нежировых тканей (г) | Изменение жировой массы (г) |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| Контрольное mAb | -0,467 | 0,210 | 11 | 0,286 | 0,118 | 11 |
| αGDF8 + αActA | 3,432 | 0,117 | 11 | -1,118 | 0,205 | 11 |
| Антагонистическое mAb к LEPR | 0,532 | 0,195 | 11 | 4,897 | 0,551 | 11 |
| Антагонистическое mAb к LEPR + αGDF8 + αActA | 3,992 | 0,288 | 12 | 3,400 | 0,298 | 12 |
[253]Таблица 3A. Сила одиночного сокращения, пиковая сила тетанического сокращения и удельная сила (мН)
[254] | Контрольное mAb | αGDF8 + αActA | Антагонистическое mAb к LEPR | Антагонистическое mAb к LEPR + αGDF8 + αActA |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| Сила одиночного сокращения (мН) | 352,300 | 16,990 | 6 | 472,300 | 18,730 | 5 | 352,000 | 24,000 | 4 | 481,700 | 27,340 | 7 |
| Пиковая сила тетанического сокращения (мН) | 997,300 | 47,510 | 6 | 1415,000 | 49,740 | 5 | 842,000 | 80,380 | 4 | 1282,000 | 59,600 | 7 |
| Удельная сила (мН) | 19,770 | 0,317 | 6 | 20,500 | 0,150 | 5 | 15,770 | 1,661 | 4 | 19,200 | 1,092 | 7 |
[255]Таблица 3B. Сила изометрического тетанического сокращения (мН)
[256] | Контрольное mAb | αGDF8 + αActA | Антагонистическое mAb к LEPR | Антагонистическое mAb к LEPR + αGDF8 + αActA |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| 40Гц | 564,712 | 48,438 | 6 | 771,410 | 37,949 | 5 | 582,244 | 28,587 | 4 | 788,626 | 58,501 | 7 |
| 60Гц | 882,634 | 43,772 | 6 | 1183,435 | 47,472 | 5 | 791,627 | 50,899 | 4 | 1142,551 | 51,231 | 7 |
| 80Гц | 976,495 | 47,602 | 6 | 1357,974 | 50,474 | 5 | 833,329 | 73,525 | 4 | 1249,999 | 60,957 | 7 |
| 100Гц | 995,798 | 47,934 | 6 | 1414,735 | 49,740 | 5 | 813,684 | 88,515 | 4 | 1282,284 | 59,602 | 7 |
| 125Гц | 979,120 | 47,815 | 6 | 1393,443 | 45,717 | 5 | 778,318 | 97,194 | 4 | 1244,875 | 57,801 | 7 |
| 150Гц | 926,029 | 45,454 | 6 | 1325,240 | 50,839 | 5 | 732,848 | 91,838 | 4 | 1174,292 | 59,950 | 7 |
| 200Гц | 847,518 | 42,148 | 6 | 1199,041 | 50,727 | 5 | 678,718 | 84,987 | 4 | 1070,346 | 60,009 | 7 |
[257]Таблица 4A. Жировая масса (г)
[258] | Контрольное mAb | αGDF8 + αActA | Антагонистическое mAb к LEPR | Антагонистическое mAb к LEPR + αGDF8 + αActA |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| Неделя 0 | 5,227 | 0,477 | 11 | 5,779 | 0,558 | 11 | 5,626 | 0,461 | 11 | 5,425 | 0,415 | 12 |
| Неделя 1 | 5,149 | 0,503 | 11 | 5,199 | 0,528 | 11 | 7,476 | 0,626 | 11 | 6,583 | 0,510 | 12 |
| Неделя 2 | 5,395 | 0,544 | 11 | 4,858 | 0,484 | 11 | 9,389 | 0,759 | 11 | 8,008 | 0,401 | 12 |
| Неделя 3 | 5,514 | 0,491 | 11 | 4,661 | 0,458 | 11 | 10,524 | 0,800 | 11 | 8,825 | 0,411 | 12 |
[259]Таблица 4B. Жировая масса (г отличия относительно исходного уровня)
[260] | Контрольное mAb | αGDF8 + αActA | Антагонистическое mAb к LEPR | Антагонистическое mAb к LEPR + αGDF8 + αActA |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| Неделя 0 | 0,000 | 0,000 | 11 | 0,000 | 0,000 | 11 | 0,000 | 0,000 | 11 | 0,000 | 0,000 | 12 |
| Неделя 1 | -0,078 | 0,096 | 11 | -0,580 | 0,086 | 11 | 1,850 | 0,234 | 11 | 1,158 | 0,257 | 12 |
| Неделя 2 | 0,167 | 0,123 | 11 | -0,921 | 0,160 | 11 | 3,763 | 0,410 | 11 | 2,583 | 0,304 | 12 |
| Неделя 3 | 0,286 | 0,118 | 11 | -1,118 | 0,205 | 11 | 4,897 | 0,551 | 11 | 3,400 | 0,298 | 12 |
[261]Таблица 4C. Масса нежировых тканей (г)
[262] | Контрольное mAb | αGDF8 + αActA | Антагонистическое mAb к LEPR | Антагонистическое mAb к LEPR + αGDF8 + αActA |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| Неделя 0 | 23,507 | 0,476 | 11 | 23,075 | 0,493 | 11 | 23,213 | 0,637 | 11 | 23,420 | 0,486 | 12 |
| Неделя 1 | 23,390 | 0,517 | 11 | 24,701 | 0,554 | 11 | 23,805 | 0,613 | 11 | 25,693 | 0,492 | 12 |
| Неделя 2 | 23,307 | 0,547 | 11 | 25,968 | 0,590 | 11 | 23,681 | 0,547 | 11 | 26,865 | 0,565 | 12 |
| Неделя 3 | 23,040 | 0,495 | 11 | 26,507 | 0,507 | 11 | 23,745 | 0,539 | 11 | 27,412 | 0,545 | 12 |
[263]Таблица 4D. Масса нежировых тканей (г отличия относительно исходного уровня)
[264] | Контрольное mAb | αGDF8 + αActA | Антагонистическое mAb к LEPR | Антагонистическое mAb к LEPR + αGDF8 + αActA |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| Неделя 0 | 0,000 | 0,000 | 11 | 0,000 | 0,000 | 11 | 0,000 | 0,000 | 11 | 0,000 | 0,000 | 12 |
| Неделя 1 | -0,117 | 0,123 | 11 | 1,625 | 0,129 | 11 | 0,592 | 0,110 | 11 | 2,273 | 0,116 | 12 |
| Неделя 2 | -0,200 | 0,148 | 11 | 2,893 | 0,195 | 11 | 0,468 | 0,140 | 11 | 3,445 | 0,186 | 12 |
| Неделя 3 | -0,467 | 0,210 | 11 | 3,432 | 0,117 | 11 | 0,532 | 0,195 | 11 | 3,992 | 0,288 | 12 |
[265]Таблица 5. Масса органов, мышечная масса, жировая масса (мг)
[266] | Контрольное mAb | αGDF8 + αActA | Антагонистическое mAb к LEPR | Антагонистическое mAb к LEPR + αGDF8 + αActA |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| Сердце | 144,70 | 4,86 | 11 | 149,50 | 2,67 | 11 | 151,90 | 3,13 | 11 | 152,10 | 2,99 | 12 |
| Печень | 1449,00 | 71,30 | 10 | 1432,00 | 55,00 | 11 | 1695,00 | 105,20 | 11 | 1637,00 | 45,11 | 12 |
| Четырехглавая мышца | 203,10 | 4,45 | 11 | 270,80 | 7,69 | 11 | 210,10 | 6,95 | 11 | 263,10 | 8,05 | 12 |
| Мышца TA | 51,07 | 1,59 | 11 | 65,33 | 2,01 | 11 | 51,35 | 1,80 | 11 | 67,41 | 1,89 | 12 |
| Мышца GA | 161,90 | 4,02 | 11 | 212,00 | 5,29 | 11 | 166,10 | 5,90 | 11 | 213,10 | 4,87 | 12 |
| WAT паха | 510,50 | 60,33 | 11 | 430,30 | 56,39 | 11 | 992,20 | 84,22 | 11 | 893,60 | 67,38 | 12 |
| WAT гонад | 771,30 | 84,83 | 11 | 652,20 | 67,24 | 11 | 1592,00 | 80,00 | 11 | 1414,00 | 73,00 | 12 |
| BAT | 103,50 | 10,32 | 11 | 97,96 | 6,19 | 11 | 186,10 | 15,47 | 11 | 146,00 | 7,19 | 12 |
[267]TA - передняя большеберцовая мышца; GA - икроножная мышца; WAT - белая жировая ткань; BAT - бурая жировая ткань.
[268]Таблица 6. Масса органов, мышечная масса, жировая масса (% от начального веса тела)
[269] | Контрольное mAb | αGDF8 + αActA | Антагонистическое mAb к LEPR | Антагонистическое mAb к LEPR + αGDF8 + αActA |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| Сердце | 0,457 | 0,013 | 11 | 0,473 | 0,005 | 11 | 0,480 | 0,011 | 11 | 0,480 | 0,010 | 12 |
| Печень | 4,576 | 0,140 | 10 | 4,527 | 0,158 | 11 | 5,310 | 0,227 | 11 | 5,170 | 0,159 | 12 |
| Четырехглавая мышца | 0,641 | 0,010 | 11 | 0,857 | 0,025 | 11 | 0,663 | 0,019 | 11 | 0,830 | 0,026 | 12 |
| Мышца TA | 0,161 | 0,005 | 11 | 0,206 | 0,005 | 11 | 0,162 | 0,005 | 11 | 0,212 | 0,005 | 12 |
| Мышца GA | 0,512 | 0,013 | 11 | 0,670 | 0,014 | 11 | 0,523 | 0,011 | 11 | 0,672 | 0,015 | 12 |
| WAT паха | 1,590 | 0,169 | 11 | 1,341 | 0,155 | 11 | 3,130 | 0,253 | 11 | 2,826 | 0,224 | 12 |
| WAT гонад | 2,392 | 0,231 | 11 | 2,029 | 0,172 | 11 | 5,015 | 0,238 | 11 | 4,441 | 0,201 | 12 |
| BAT | 0,322 | 0,027 | 11 | 0,308 | 0,017 | 11 | 0,583 | 0,045 | 11 | 0,460 | 0,022 | 12 |
[270]Таблица 7. Масса органов, мышечная масса, жировая масса (% изменения относительно контроля)
[271] | Контрольное mAb | αGDF8 + αActA | Антагонистическое mAb к LEPR | Антагонистическое mAb к LEPR + αGDF8 + αActA |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| Сердце | -3,182E-08 | 2,747 | 11 | 3,480 | 1,151 | 11 | 5,058 | 2,353 | 11 | 5,065 | 2,275 | 12 |
| Печень | -0,00000005 | 3,050 | 10 | -1,055 | 3,460 | 11 | 16,050 | 4,962 | 11 | 12,990 | 3,476 | 12 |
| Четырехглавая мышца | -4,545E-09 | 1,520 | 11 | 33,670 | 3,827 | 11 | 3,426 | 2,984 | 11 | 29,490 | 4,132 | 12 |
| Мышца TA | -5,818E-08 | 2,851 | 11 | 27,880 | 2,986 | 11 | 0,460 | 3,097 | 11 | 31,610 | 3,035 | 12 |
| Мышца GA | -4,182E-08 | 2,595 | 11 | 30,940 | 2,757 | 11 | 2,073 | 2,241 | 11 | 31,250 | 2,866 | 12 |
| WAT паха | 6,364E-08 | 10,660 | 11 | -15,660 | 9,761 | 11 | 96,900 | 15,940 | 11 | 77,740 | 14,100 | 12 |
| WAT гонад | -2,273E-08 | 9,652 | 11 | -15,170 | 7,197 | 11 | 109,600 | 9,929 | 11 | 85,620 | 8,399 | 12 |
| BAT | 2,455E-08 | 8,318 | 11 | -4,226 | 5,146 | 11 | 81,030 | 13,930 | 11 | 42,800 | 6,818 | 12 |
[272][00118] Пример 3. Комбинированная обработка с помощью mAb к GDF8 (REGN1033), mAb к активину А (REGN2477) и антагонистического mAb к LEPR (H4H18457P2) у самцов мышей в возрасте 12-14 недель (+ дополнительные группы обработки)
[273][00119] Эффекты специфичного антагонистического антитела к LEPR H4H18457P2 в комбинации с блокирующими антителами к MSTN (также называемыми антителами к GDF8) и к INHBA (также называемыми антителами к активину А) - H4H1657N2 (REGN1033) и H4H10446P2 (REGN2477) соответственно - по настоящему изобретению в отношении потребления пищи, веса тела, композиционного состава тела, значений веса отдельных тканей и формирования мышечной силы ex vivo определяли у содержащихся по одной особи самцов мышей LEPRHu/Hu, полученных методами генной инженерии, в возрасте 12-14 недель, которые экспрессируют рецептор лептина, состоящий из последовательности эктодомена LEPR человека вместо последовательности эктодомена LEPR мыши.
[274][00120] Исходный уровень суточного потребления пищи измеряли в период между днями -8 и 0. В день -1 исходный уровень массы нежировых тканей и жировой массы всего тела определяли количественно посредством ЯМР. В день 0 мышей стратифицировали на шесть групп по 7-8 мышей в зависимости от композиционного состава тела с дня -1 и веса тела с дня 0. Начиная с дня 0, каждая группа получала обработку антителами в соответствующей дозе путем подкожной инъекции. Дозы mAb REGN1033, REGN2477 и соответствующего IgG4P вводят дважды в неделю при 10 мг/кг. Дозы mAb H4H18457P2 и соответствующего ему IgG4P вводят один раз в неделю при 30 мг/кг. Антитело изотипического контроля (IgG4P) (REGN1945) не связывает ни один известный белок мыши.
[276]a) Контроль IgG4P (10 мг/кг + 10 мг/кг, 2 раза в неделю; 30 мг/кг, 1 раз в неделю), N = 7
[277]b) REGN1033 (10 мг/кг, 2 раза в неделю), N = 7
[278]c) REGN1033 + REGN2477 (10 мг/кг + 10 мг/кг, 2 раза в неделю), N = 7
[279]d) H4H18457P2 (30 мг/кг, 1 раз в неделю), N = 7
[280]e) REGN1033 + H4H18457P2 (10 мг/кг, 2 раза в неделю; 30 мг/кг, 1 раз в неделю), N = 8
[281]f) REGN1033 + REGN2477 + H4H18457P2 (10 мг/кг + 10 мг/кг, 2 раза в неделю; 30 мг/кг, 1 раз в неделю), N = 8
[282][00121] Потребление пищи (таблица 8B) и вес тела (таблица 8A) измеряли на протяжении исследования для каждого животного. Композиционный состав тела определяли количественно в дни 6, 13 и 20 (таблицы 8C и 8D). В день 21 или 22 животных умерщвляли для дополнительных анализов, включающих определение количества волокон скелетных мышц и площади поперечного сечения волокон (таблицы 9-11).
[283][00122] По сравнению с антителом изотипического контроля антагонист LEPR H4H18457P2 значительно увеличивал вес тела и совокупное потребление пищи при введении в отдельности или в комбинации с REGN1033 или REGN1033 и REGN2477. Мыши, обработанные с помощью H4H18457P2, демонстрировали значимые увеличения веса тела и совокупного потребления пищи (таблицы 8А и 8В), начиная с дней 13 и 8 соответственно и в последующие моменты времени, по сравнению с мышами, которым вводили антитело изотипического контроля. Вес тела и совокупное потребление пищи значимо повышались при обработке с помощью H4H18457P2 и REGN1033, начиная с дня 7 и в последующие моменты времени, по сравнению с введениями антитела изотипического контроля. Мыши, обработанные с помощью H4H18457P2, REGN1033 и REGN2477, также демонстрировали увеличение веса тела и потребления пищи с дня 8 и в день 7 соответственно до конца исследования по сравнению с мышами, которым вводили антитело изотипического контроля. Мыши, обработанные с помощью REGN1033 или REGN1033 и REGN2477, не демонстрировали значимых изменений веса тела или совокупного потребления пищи по сравнению с мышами, которым вводили контрольное антитело.
[284][00123] Мыши, обработанные с помощью H4H18457P2 в отдельности либо в комбинации с REGN1033 или REGN1033 и REGN2477, демонстрировали увеличения жировой массы относительно исходного уровня во все моменты времени измерений (дни 6, 13 и 20) по сравнению с мышами, которым вводили антитело изотипического контроля (таблица 8D). В дни 13 и 20 мыши, обработанные с помощью H4H18457P2, REGN1033 и REGN2477, демонстрировали меньший набор жировой массы относительно исходного уровня, чем мыши, обработанные с помощью H4H18457P2 в отдельности или в комбинации с REGN1033 (таблица 8D). Мыши, обработанные с помощью H4H18457P2, REGN1033 и REGN2477, также демонстрировали значимое увеличение набора массы нежировых тканей относительно исходного уровня в дни 13 и 20 по сравнению с мышами, которым вводили антитело изотипического контроля (таблица 8C).
[285][00124] Гистологические анализы не выявили значимых эффектов в какой-либо группе обработки по сравнению с введением антитела изотипического контроля в отношении количества мышечных волокон в передней большеберцовой мышце или икроножной мышце (таблицы 9 и 10). По сравнению с доставкой антитела изотипического контроля мыши, обработанные с помощью REGN1033 в комбинации с REGN2477 или H4H18457P2, демонстрировали увеличенное количество мышечных волокон в камбаловидной мышце (таблица 11). Во всех трех исследованных мышцах (передней большеберцовой, икроножной и камбаловидной) обработка с помощью H4H18457P2 не влияла на площадь мышечных волокон по сравнению с введением антитела изотипического контроля (таблицы 9, 10 и 11). Мыши, обработанные с помощью REGN1033, REGN1033 и REGN2477, REGN1033 и H4H18457P2 либо REGN1033, и REGN2477, и H4H18457P2, демонстрировали увеличенную площадь мышечных волокон в передней большеберцовой и икроножной мышцах (таблицы 9 и 10) по сравнению с мышами, которым вводили антитело изотипического контроля. В камбаловидной мышце только мыши, обработанные с помощью тройной комбинации H4H18457P2, REGN1033 и REN2477, демонстрировали увеличенную площадь мышечных волокон по сравнению с мышами, которым вводили антитело изотипического контроля (таблица 11).
[286][00125] Говоря обобщенно, обработка антагонистическим антителом к LEPR в отдельности приводит к увеличению веса тела, потребления пищи и тучности и в комбинации с блокирующими антителами к ActA и/или к MSTN индуцирует дополнительные увеличения площади или количества мышечных волокон соответственно.
[287]Таблица 8A. Вес тела (г)
[288] | IgG4P | REGN1033 | REGN1033 + REGN2477 | H4H18457P2 | REGN1033 + H4H18457P2 | REGN1033 + REGN2477 + H4H18457P2 |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| День 0 | 27,267 | 1,145 | 7 | 27,263 | 1,156 | 7 | 27,357 | 1,020 | 7 | 27,650 | 0,803 | 7 | 27,185 | 0,908 | 8 | 27,148 | 1,065 | 8 |
| День 2 | 27,580 | 1,086 | 7 | 27,927 | 1,161 | 7 | 28,121 | 1,041 | 7 | 29,437 | 0,775 | 7 | 29,141 | 0,849 | 8 | 28,915 | 1,081 | 8 |
| День 3 | 27,517 | 1,098 | 7 | 28,093 | 1,193 | 7 | 28,094 | 1,023 | 7 | 29,899 | 0,806 | 7 | 29,966 | 0,970 | 8 | 29,650 | 1,081 | 8 |
| День 6 | 27,464 | 1,090 | 7 | 28,690 | 1,232 | 7 | 28,907 | 1,014 | 7 | 31,124 | 0,934 | 7 | 31,813 | 0,995 | 8 | 31,539 | 1,100 | 8 |
| День 7 | 27,423 | 1,077 | 7 | 28,611 | 1,215 | 7 | 28,854 | 0,984 | 7 | 31,044 | 0,949 | 7 | 32,003 | 1,025 | 8 | 31,774 | 1,111 | 8 |
| День 8 | 27,696 | 1,176 | 7 | 28,961 | 1,133 | 7 | 29,186 | 1,076 | 7 | 31,704 | 0,896 | 7 | 32,719 | 1,009 | 8 | 32,340 | 1,136 | 8 |
| День 9 | 27,723 | 1,152 | 7 | 29,446 | 1,321 | 7 | 29,391 | 1,004 | 7 | 31,963 | 1,015 | 7 | 33,186 | 0,925 | 8 | 32,908 | 1,133 | 8 |
| День 10 | 27,759 | 1,156 | 7 | 29,169 | 1,144 | 7 | 29,373 | 1,008 | 7 | 32,306 | 0,961 | 7 | 33,569 | 0,966 | 8 | 33,299 | 1,211 | 8 |
| День 13 | 27,867 | 1,140 | 7 | 29,591 | 1,185 | 7 | 29,831 | 0,933 | 7 | 33,291 | 0,880 | 7 | 34,555 | 1,109 | 8 | 34,550 | 1,308 | 8 |
| День 14 | 27,883 | 1,162 | 7 | 29,343 | 1,195 | 7 | 29,770 | 0,939 | 7 | 33,059 | 1,026 | 7 | 34,668 | 1,157 | 8 | 34,658 | 1,248 | 8 |
| День 16 | 28,104 | 1,130 | 7 | 30,213 | 1,186 | 7 | 30,509 | 0,964 | 7 | 33,691 | 1,023 | 7 | 35,610 | 1,142 | 8 | 36,058 | 1,360 | 8 |
| День 17 | 28,217 | 1,074 | 7 | 29,861 | 1,191 | 7 | 30,259 | 0,978 | 7 | 33,771 | 1,052 | 7 | 35,796 | 1,143 | 8 | 36,114 | 1,347 | 8 |
| День 20 | 28,304 | 1,167 | 7 | 30,234 | 1,257 | 7 | 30,530 | 0,793 | 7 | 34,724 | 1,118 | 7 | 36,529 | 1,224 | 8 | 36,976 | 1,351 | 8 |
| День 21 | 28,229 | 1,197 | 7 | 30,264 | 1,242 | 7 | 30,811 | 0,978 | 7 | 34,516 | 1,115 | 7 | 36,604 | 1,258 | 8 | 36,830 | 1,368 | 8 |
[289]Таблица 8B. Совокупное потребление пищи
[290] | IgG4P | REGN1033 | REGN1033 + REGN2477 | H4H18457P2 | REGN1033 + H4H18457P2 | REGN1033 + REGN2477 + H4H18457P2 |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| День 0 | 0,000 | 0,000 | 7 | 0,000 | 0,000 | 7 | 0,000 | 0,000 | 7 | 0,000 | 0,000 | 6 | 0,000 | 0,000 | 7 | 0,000 | 0,000 | 8 |
| День 2 | 9,050 | 0,379 | 7 | 8,993 | 0,601 | 7 | 9,070 | 0,284 | 7 | 10,548 | 0,407 | 6 | 10,527 | 0,400 | 7 | 10,433 | 0,298 | 8 |
| День 3 | 13,421 | 0,639 | 7 | 13,491 | 0,753 | 7 | 13,533 | 0,434 | 7 | 16,620 | 0,637 | 6 | 16,636 | 0,564 | 7 | 16,754 | 0,477 | 8 |
| День 6 | 26,191 | 1,373 | 7 | 26,673 | 1,326 | 7 | 26,543 | 0,839 | 7 | 32,998 | 1,303 | 6 | 34,169 | 1,278 | 7 | 34,114 | 0,605 | 8 |
| День 7 | 30,711 | 1,500 | 7 | 31,011 | 1,476 | 7 | 30,684 | 1,036 | 7 | 38,523 | 1,498 | 6 | 39,857 | 1,364 | 7 | 39,715 | 0,799 | 8 |
| День 8 | 34,877 | 1,689 | 7 | 35,223 | 1,665 | 7 | 34,610 | 1,258 | 7 | 43,735 | 1,580 | 6 | 45,370 | 1,504 | 7 | 45,015 | 0,918 | 8 |
| День 9 | 39,234 | 1,955 | 7 | 39,561 | 1,792 | 7 | 38,820 | 1,401 | 7 | 48,983 | 1,831 | 6 | 50,886 | 1,591 | 7 | 50,593 | 1,107 | 8 |
| День 10 | 43,473 | 2,260 | 7 | 43,599 | 1,934 | 7 | 42,959 | 1,542 | 7 | 54,487 | 1,946 | 6 | 56,586 | 1,615 | 7 | 56,254 | 1,246 | 8 |
| День 13 | 55,691 | 2,936 | 7 | 56,084 | 2,509 | 7 | 55,276 | 1,921 | 7 | 70,253 | 2,310 | 6 | 73,181 | 1,959 | 7 | 72,801 | 1,886 | 8 |
| День 14 | 60,170 | 3,083 | 7 | 60,543 | 2,776 | 7 | 59,541 | 1,966 | 7 | 75,147 | 2,497 | 6 | 78,610 | 2,026 | 7 | 78,475 | 2,036 | 8 |
| День 16 | 68,284 | 3,526 | 7 | 68,890 | 3,181 | 7 | 68,131 | 2,319 | 7 | 84,507 | 2,676 | 6 | 88,901 | 2,155 | 7 | 89,314 | 2,248 | 8 |
| День 17 | 72,526 | 3,721 | 7 | 72,721 | 3,367 | 7 | 72,154 | 2,450 | 7 | 89,543 | 2,855 | 6 | 93,999 | 2,203 | 7 | 94,939 | 2,429 | 8 |
| День 20 | 84,754 | 4,432 | 7 | 85,340 | 3,774 | 7 | 85,024 | 2,630 | 7 | 105,160 | 3,373 | 6 | 109,866 | 2,730 | 7 | 111,293 | 2,916 | 8 |
| День 21 | 88,433 | 4,661 | 7 | 89,089 | 3,962 | 7 | 88,910 | 2,770 | 7 | 109,127 | 3,478 | 6 | 114,414 | 2,916 | 7 | 116,163 | 3,025 | 8 |
[291]Таблица 8C. Масса нежировых тканей (г отличия относительно исходного уровня)
[292] | IgG4P | REGN1033 | REGN1033 + REGN2477 | H4H18457P2 | REGN1033 + H4H18457P2 | REGN1033 + REGN2477 + H4H18457P2 |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| День -1 | 0,000 | 0,000 | 7 | 0,000 | 0,000 | 7 | 0,000 | 0,000 | 7 | 0,000 | 0,000 | 7 | 0,000 | 0,000 | 8 | 0,000 | 0,000 | 8 |
| День 6 | -0,026 | 0,107 | 7 | 1,321 | 0,119 | 7 | 1,704 | 0,088 | 7 | 1,227 | 0,242 | 7 | 2,288 | 0,123 | 8 | 2,576 | 0,171 | 8 |
| День 13 | -0,016 | 0,210 | 7 | 1,930 | 0,151 | 7 | 2,997 | 0,108 | 7 | 1,490 | 0,227 | 7 | 3,201 | 0,197 | 8 | 4,281 | 0,282 | 8 |
| День 20 | 0,274 | 0,299 | 7 | 2,573 | 0,188 | 7 | 3,873 | 0,336 | 7 | 1,777 | 0,388 | 7 | 3,899 | 0,268 | 8 | 5,716 | 0,328 | 8 |
[293]Таблица 8D. Жировая масса (г отличия относительно исходного уровня)
[294] | IgG4P | REGN1033 | REGN1033 + REGN2477 | H4H18457P2 | REGN1033 + H4H18457P2 | REGN1033 + REGN2477 + H4H18457P2 |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| День -1 | 0 | 0 | 7 | 0 | 0 | 7 | 0 | 0 | 7 | 0 | 0 | 7 | 0 | 0 | 8 | 0 | 0 | 8 |
| День 6 | -0,027 | 0,084 | 7 | -0,009 | 0,087 | 7 | -0,099 | 0,091 | 7 | 1,909 | 0,170 | 7 | 2,028 | 0,128 | 8 | 1,496 | 0,197 | 8 |
| День 13 | 0,250 | 0,128 | 7 | 0,273 | 0,120 | 7 | -0,340 | 0,133 | 7 | 3,580 | 0,295 | 7 | 3,800 | 0,222 | 8 | 2,600 | 0,270 | 8 |
| День 20 | 0,500 | 0,207 | 7 | 0,220 | 0,166 | 7 | -0,319 | 0,180 | 7 | 4,834 | 0,469 | 7 | 5,158 | 0,304 | 8 | 3,614 | 0,485 | 8 |
[295]Таблица 9. Площадь и количество волокон в мышце ТА
[296] | IgG4P (N = 7) | REGN1033 (N = 7) | REGN1033 + REGN2477 (N = 7) | H4H18457P2 (N = 7) | REGN1033 + H4H18457P2 (N = 8) | REGN1033 + REGN2477 + H4H18457P2 (N = 8) |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| Размер мышц (мкм^2) | 2004 | 56,01 | 7 | 2535 | 73,66 | 7 | 2841 | 150,5 | 7 | 2316 | 82,99 | 7 | 2491 | 87,98 | 8 | 3011 | 147,6 | 8 |
| Число волокон (количество волокон) | 1982 | 117,1 | 7 | 1826 | 94,79 | 7 | 1839 | 115,7 | 7 | 1862 | 124,4 | 7 | 2018 | 163,2 | 8 | 1670 | 106,7 | 8 |
[297]Таблица 10. Площадь и количество волокон в мышце GA
[298] | IgG4p (N = 7) | REGN1033 (N = 7) | REGN1033 + REGN2477 (N = 7) | H4H18457P2 (N = 7) | REGN1033 + H4H18457P2 (N = 8) | REGN1033 + REGN2477 + H4H18457P2 (N = 8) |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| Размер мышц (мкм^2) | 1903 | 69,1 | 7 | 2444 | 127,2 | 7 | 2319 | 42,42 | 7 | 1902 | 85,57 | 7 | 2340 | 52,31 | 8 | 2562 | 106,1 | 8 |
| Число волокон (количество волокон) | 4992 | 510 | 7 | 3864 | 368,7 | 7 | 4615 | 336,5 | 7 | 4830 | 576,7 | 7 | 4189 | 328,5 | 8 | 3748 | 460,1 | 8 |
[299]Таблица 11. Площадь и количество волокон в камбаловидной мышце
[300] | IgG4P (N = 7) | REGN1033 (N = 7) | REGN1033 + REGN2477 (N = 7) | H4H18457P2 (N = 7) | REGN1033 + H4H18457P2 (N = 8) | REGN1033 + REGN2477 + H4H18457P2 (N = 8) |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| Размер мышц (мкм^2) | 1253 | 64,74 | 7 | 1590 | 188,8 | 7 | 1377 | 43,75 | 7 | 1235 | 79,26 | 7 | 1455 | 52,5 | 8 | 1696 | 84,62 | 8 |
| Число волокон (количество волокон) | 539,4 | 71,96 | 7 | 650,3 | 87,98 | 7 | 797,3 | 34,8 | 7 | 729,9 | 41,15 | 7 | 811,4 | 24,63 | 8 | 726,4 | 54,47 | 8 |
[301][00126] Пример 4. Комбинированная обработка с помощью mAb к GDF8 (REGN1033), mAb к активину А (REGN2477) и антагонистического mAb к LEPR (H4H184572P2) у самцов мышей
[302][00127] Эффекты специфичного антагонистического антитела к LEPR H4H18457P2 в комбинации с блокирующими антителами к MSTN (также называемыми антителами к GDF8) и к INHBA (также называемыми антителами к активину А) - H4H1657N2 (REGN1033) и H4H10446P2 (REGN2477) соответственно - в отношении потребления пищи, веса тела, композиционного состава тела, значений веса отдельных тканей и формирования мышечной силы ex vivo определяли у содержащихся по одной особи самцов мышей LEPRHu/Hu, полученных методами генной инженерии, в возрасте 12-14 недель, которые экспрессируют рецептор лептина, состоящий из последовательности эктодомена LEPR человека вместо последовательности эктодомена LEPR мыши.
[303][00128] Исходный уровень суточного потребления пищи измеряли в период между днями -8 и 0. В день -1 исходный уровень массы нежировых тканей и жировой массы всего тела определяли количественно посредством ЯМР. В день 0 мышей стратифицировали на шесть групп по 7-8 мышей в зависимости от композиционного состава тела с дня -1 и веса тела с дня 0. Начиная с дня 0, каждая группа получала обработку антителами в соответствующей дозе путем подкожной инъекции. Дозы mAb REGN1033, REGN2477 и соответствующего IgG4P вводили дважды в неделю при 10 мг/кг. Дозы mAb H4H18457P2 и соответствующего ему IgG4P вводили один раз в неделю при 30 мг/кг. Антитело изотипического контроля (IgG4P) не связывает ни один известный белок мыши.
[305]a) Контроль IgG4P (10 мг/кг + 10 мг/кг, 2 раза в неделю; 30 мг/кг, 1 раз в неделю), N = 7
[306]b) REGN1033 (10 мг/кг, 2 раза в неделю), N = 7
[307]c) REGN1033 + REGN2477 (10 мг/кг + 10 мг/кг, 2 раза в неделю), N = 7
[308]d) H4H18457P2 (30 мг/кг, 1 раз в неделю), N = 7
[309]e) REGN1033 + H4H18457P2 (10 мг/кг, 2 раза в неделю; 30 мг/кг, 1 раз в неделю), N = 8
[310]f) REGN1033 + REGN2477 + H4H18457P2 (10 мг/кг + 10 мг/кг, 2 раза в неделю; 30 мг/кг, 1 раз в неделю), N = 8
[311][00129] Потребление пищи и вес тела измеряли на протяжении исследования для каждого животного. Композиционный состав тела определяли количественно в дни 6, 13 и 20. В день 21 или 22 животных умерщвляли, отдельные органы и ткани скелетных мышц взвешивали и собирали для дополнительных анализов, включающих количественное определение триглицеридов в печени и определение количества волокон скелетных мышц и площади поперечного сечения волокон.
[312][00130] Количественное определение содержания триглицеридов в печени выявило, что мыши, обработанные с помощью H4H18457P2 в отдельности или в комбинации с REGN1033, демонстрировали увеличенное содержание триглицеридов в печени по сравнению с мышами, которым вводили антитело изотипического контроля (таблица 12). В противоположность этому, содержание триглицеридов в печени не было увеличенным у мышей, обработанных с помощью H4H18457P2 в комбинации с REGN1033 и REGN2477, по сравнению с мышами, которым вводили антитело изотипического контроля (таблица 12). Мыши, обработанные с помощью H4H18457P2 в комбинации с REGN1033 и REGN2477, демонстрировали уменьшенное содержание триглицеридов в печени по сравнению с мышами, обработанными с помощью H4H18457P2 в комбинации с REGN1033 (таблица 12). Говоря обобщенно, обработка антагонистическим антителом к LEPR приводила к увеличению содержания триглицеридов в печени, которое снижалось при комбинированной обработке с помощью антагониста LEPR, блокирующих антител к ActA и к MSTN.
[313]Таблица 12. Триглицериды в печени
[314] | IgG4P | REGN1033 | REGN1033 + REGN2477 | H4H18457P2 | REGN1033 + H4H18457P2 | REGN1033 + REGN2477 + H4H18457P2 |
| Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N | Среднее | SEM | N |
| Триглицериды в печени (мг/г сырого веса) | 8,927 | 6,163 | 7 | 9,687 | 6,552 | 5** | 8,093 | 5,782 | 7 | 19,09 | 8,495 | 6* | 19,18 | 13,53 | 8 | 12,53 | 5,846 | 8 |
[315]Данные для 2 из 7 мышей не включены в показанные значения
[316]Данные для 1 из 7 мышей не включены в показанные значения.
[318]ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[319]<110> Регенерон Фармасьютикалс, Инк.
[322]<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ВЕСА ТЕЛА И
[323] СУХОЙ МЫШЕЧНОЙ МАССЫ
[330]<170> PatentIn, версия 3.5
[336]Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ser Val Val Arg Pro Gly Glu
[338]Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
[340]Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
[342]Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ile Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
[344]Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
[346]Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys
[348]Ala Arg Ala Arg Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
[357]Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
[359]Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
[361]Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
[363]Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
[365]Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
[367]Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
[369]Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
[376]Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
[390]Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Ile Thr
[397]Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Gly
[404]Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ile Thr
[411]Ala Arg Ala Arg Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr
[418]Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
[420]Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
[422]Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
[424]Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
[426]Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
[428]Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
[430]Ala Lys Asp Gly Ala Trp Lys Met Ser Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln
[432]Gly Thr Thr Val Ile Val Ser Ser
[439]Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
[441]Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asp Tyr
[443]Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ile Pro Arg Leu Leu Ile
[445]Tyr Thr Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
[447]Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
[449]Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Pro Leu
[451]Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
[458]Gln Asp Ile Ser Asp Tyr
[472]Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Pro Leu Thr
[479]Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr Ala
[486]Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Ala
[493]Ala Lys Asp Gly Ala Trp Lys Met Ser Gly Leu Asp Val
[500]Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
[502]Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Ser His
[504]Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
[506]Gly Tyr Ile Leu Tyr Thr Gly Gly Thr Ser Phe Asn Pro Ser Leu Lys
[508]Ser Arg Val Ser Met Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
[510]Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
[512]Arg Ala Arg Ser Gly Ile Thr Phe Thr Gly Ile Ile Val Pro Gly Ser
[514]Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
[521]Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
[523]Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
[525]Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
[527]Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
[529]Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
[531]Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
[533]Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
[540]Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
[554]Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
[561]Gly Gly Ser Phe Ser Ser His Phe
[568]Ile Leu Tyr Thr Gly Gly Thr
[575]Ala Arg Ala Arg Ser Gly Ile Thr Phe Thr Gly Ile Ile Val Pro Gly
[584]Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Ser Val Val Arg Pro Gly Glu
[586]Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
[588]Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
[590]Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ile Thr Val Tyr Ala Asp Ser Val
[592]Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
[594]Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr His Cys
[596]Ala Arg Ala Arg Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
[598]Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
[600]Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
[602]Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
[604]Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
[606]Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
[608]Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
[610]Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
[612]Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
[614]Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
[616]Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
[618]Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
[620]Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
[622]Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
[624]Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
[626]Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
[628]Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
[630]Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
[632]Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
[634]Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
[636]Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
[638]Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
[645]Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
[647]Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
[649]Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
[651]Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
[653]Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
[655]Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
[657]Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
[659]Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
[661]Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
[663]Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
[665]Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
[667]Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
[669]Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
[671]Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
[678]Glu Val Gln Val Leu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly
[680]Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr
[682]Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
[684]Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
[686]Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
[688]Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
[690]Ala Lys Asp Gly Ala Trp Lys Met Ser Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln
[692]Gly Thr Thr Val Ile Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
[694]Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
[696]Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
[698]Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
[700]Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
[702]Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
[704]Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
[706]Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val
[708]Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
[710]Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
[712]Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
[714]Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
[716]Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
[718]Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
[720]Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
[722]Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
[724]Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
[726]Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
[728]Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
[730]Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
[732]His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
[739]Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
[741]Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asp Tyr
[743]Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ile Pro Arg Leu Leu Ile
[745]Tyr Thr Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
[747]Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
[749]Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asp Ser Ala Pro Leu
[751]Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
[753]Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
[755]Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
[757]Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
[759]Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
[761]Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
[763]Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
[765]Phe Asn Arg Gly Glu Cys
[772]Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
[774]Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe Ser Ser His
[776]Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
[778]Gly Tyr Ile Leu Tyr Thr Gly Gly Thr Ser Phe Asn Pro Ser Leu Lys
[780]Ser Arg Val Ser Met Ser Val Gly Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
[782]Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
[784]Arg Ala Arg Ser Gly Ile Thr Phe Thr Gly Ile Ile Val Pro Gly Ser
[786]Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
[788]Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
[790]Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
[792]Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
[794]His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
[796]Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr
[798]Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val
[800]Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
[802]Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
[804]Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
[806]Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
[808]Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
[810]Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
[812]Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
[814]Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
[816]Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
[818]Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
[820]Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
[822]Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
[824]Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
[826]Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
[835]Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
[837]Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
[839]Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
[841]Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
[843]Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
[845]Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
[847]Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
[849]Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
[851]Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
[853]Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
[855]Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
[857]Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
[859]Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
[861]Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
