[1]Группа изобретений относится к области медицины, в том числе к диагностике онкогематологических заболеваний, и предназначена для использования при проведении молекулярно-генетических исследований в клинико-диагностических лабораториях с целью выявления генетических маркеров хронических Ph-негативных миелопролиферативных новообразований.
[2]В соответствии с клиническими рекомендациями [Barbui Т., Thiele J., Gisslinger Н., Finazzi G., Vannucchi A.M, Tefferi A. The 2016 revision of WHO classification of myeloproliferative neoplasms: Clinical and molecular advances. Blood Reviews, 2016. 30: 453-459] основным диагностическим критерием для постановки диагноза Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, а именно истинной полицитемии (ИП), эссенциальной тромбоцитемии (ЭТ) и первичного миелофиброза (ПМФ) является выявление одной из пяти наиболее частых патогенетических соматических мутаций в генах янускиназы-2 (JAK2 V617F), кальретикулина (CALR 1 типа - с. 1092_1143del и 2 типа - с. 1154_1155insTTGTC) и рецептора тромбопоэтина (MPL W515L и W515K).
[3]Наиболее распространенные в практике клинико-диагностических лабораторий методы и наборы реагентов для детекции мутаций предусматривают возможность проведения исследования только мутаций в отдельных генах, выполнение полного лабораторного тестирования всех основных мутаций ассоциированных с миелопролиферацией занимает достаточно большой промежуток времени.
[4]Известно одновременное исследование различных мутаций в разных генах с использованием методов секвенирования ДНК [Langabeer SE, Andrikovics Н, Asp J, et al. Molecular diagnostics of myeloproliferative neoplasms. Eur J Haematol. 2015, 95:270-279] и микрочипов (https://tools.mermofisher.com/content/sfs/brochures/genomewide_snp6_datasheet.pdf).
[5]Однако требования к оборудованию и квалификации персонала, а также высокая трудоемкость выполнения и стоимость тестирования осложняет широкое использование данных методов в реальной практике клинико-диагностических лабораторий.
[6]Известен способ, который заключается в использовании аллель-специфичных праймеров с регистрацией результатов ПЦР в режиме реального времени с использованием флуоресцентно-меченных проб. Реакционная смесь включает праймеры, отличающиеся для каждого аллеля, и общие для двух аллелей праймер и пробу, а также общий флуоресцентный зонд [RU, пат. 2445373, МПК C12Q 1/68, опубл. 20.03.2012 г., бюл. №8].
[7]Недостатки способа заключаются в невозможности проведения мультиплексной реакции в виду использования одного флуоресцентного зонда общего для двух анализируемых аллелей.
[8]Наиболее близким к заявляемому набору реактивов и способу диагностики на его основе по совокупности признаков является набор реактивов для выявления Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, предусматривавший использование при выполнении мультиплексной полимеразной цепной реакции четырех реакционных смесей, включающих специфические праймеры и TaqMan зонды [RU пат. 2679653, МПК G01N 33/533, опубл. 12.02.2019, Бюл. №5 (прототип)]. В патенте 2679653 предложен набор, содержащий специфичные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды. Праймеры имеют следующий нуклеотидный состав (5'-3'-): JAK2-W-F, JAK2-W-R, JAK2-W-P, JAK2-M-F, JAK2-M-R, JAK2-M-P, CALR-1-F, CALR-1-R, MPL-K-F, MPL-K-R, CALR-1-P, MPL-K-P, CALR-2-F, CALR-2-R, MPL-L-F, MPL-L-R, CALR-2-P, MPL-L-P. В TaqMan зондах на 5' конце применяют красители: флуоресцеин (FAM) и хлорированный флуоресцеин (HEX). Для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-1 (BHQ1) на 3' конце. Данное техническое решение позволяет проводить одновременное исследование нескольких мутаций в одной аналитической серии, что приводит к результату в более короткие сроки. А также обеспечивает точную диагностику хронических Ph-негативных миелопролиферативных опухолей, позволяет выявлять группу пациентов с наличием сочетанных патогенетических мутаций.
[9]Однако при использовании вышеуказанного набора необходимо на каждую анализируемую пробу использовать четыре реакционные смеси требующие не менее 4 отдельных пробирок, что ограничивает производственные ресурсы лаборатории, особенно при больших объемах тестирования.
[10]Задача изобретения - разработка набора реактивов для одновременного выявления пяти основных соматических мутаций в генах JAK2, CALR и MPL, а также ускоренного и экономичного способа диагностики Ph- негативных миелопролиферативных новообразований на его основе.
[11]Техническим результатом, достигаемым заявляемой группой изобретений, является изготовление набора реактивов для выявления пяти соматических мутаций в генах янускиназы-2 (JAK2 V617F), кальретикулина (CALR 1 типа - с. 1092_1143de1 и 2 типа - с. 1154_1155insTTGTC) и рецептора тромбопоэтина (MPL W515L и W515K) методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, сокращение рабочего времени на выполнение лабораторных тестов и экономия расходных материалов.
[12]Указанный единый технический результат при осуществлении группы изобретений по объекту набор реактивов достигается тем, что в наборе реактивов для одновременного выявления пяти основных соматических мутаций Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, содержащем специфичные праймеры и флуоресцентно-меченые ДНК-зонды, в качестве источника флуоресценции в TaqMan зондах на 5' конце используют красители: флуоресцеин (FAM), и хлорированный флуоресцеин (HEX), а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-1 (BHQ1) на 3' конце, новым является то, что для анализа одного биологического образца используют две реакционные смеси, при этом первая смесь включает праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-D, CALR-R, 515K, 515-R5 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р6, а вторая смесь включает праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-R, JAK2-RM, CALR-I, 515L, 515-R9 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р10 и имеют следующий нуклеотидный состав (5'-3'-):
[13]JAK2-W-F: AGCAGCAAGTATGATGAGC,
[14]JAK2-R: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,
[15]JAK2-P: FAM-CACAGACACATACTC-BHQ1,
[16]JAK2-RM: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,
[17]CALR-D: GAGGAGTTTGGCAACGAGAC,
[18]CALR-R: ССТСАТССТССТСАТССТСА,
[19]CALR-P: HEX-AGGAGCAGAGGACAAGGAGGATGA-BHQ2,
[20]CALR-I: GCAACGAGACGTGGGGCGTA
[21]515-R9: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,
[22]515L: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,
[23]515-P6: HEX-TGCTGCTGAGGAAGCAGTTTCC-BHQ2,
[24]515K: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,
[25]515-R5: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,
[26]515-Р10: HEX-CTGCTGAGGTTGCAGTTTC-BHQ2,
[27]дополнительно в качестве источника флуоресценции в TaqMan зондах на 5' конце используют краситель карбокси-Х-родамин (ROX), а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-2 (BHQ2) на 3' конце.
[28]Указанный единый технический результат при осуществлении группы изобретений по объекту способу достигается также и тем, что в способе диагностики Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, включающем проведение мультиплексного варианта полимеразной цепной реакции в режиме реального времени путем смешивания буфера, дНТФ, специфичных праймеров, TaqMan зондов, Taq-полимеразы, MgCI2; и воды в оптимальных объемах, с последующей амплификацией которую проводят в следующем режиме: предварительная активация при 95°С - 5 минут и последующие циклы, включающие денатурацию при 95°С - 15 секунд, отжиг и элонгацию при 60°С - 60 секунд, цикл повторяют 50 раз, новым является то, что мультиплексную полимеразную цепную реакцию проводят одновременно в двух реакционных смесях, первая смесь включает праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-D, CALR-R, 515К, 515-R5 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р6, вторая смесь включает праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, CALR-R, JAK2-RM, CALR-I, 515L, 515-R9 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р10, имеющих следующий нуклеотидный состав (5'-3'-):
[29]JAK2-W-F: AGCAGCAAGTATGATGAGC,
[30]JAK2-R: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,
[31]JAK2-P: FAM-CACAGACACATACTC-BHQ1,
[32]JAK2-RM: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,
[33]CALR-D: GAGGAGTTTGGCAACGAGAC,
[34]CALR-R: CCTCATCCTCCTCATCCTCA,
[35]CALR-P: HEX-AGGAGCAGAGGACAAGGAGGATGA-BHQ2,
[36]CALR-I: GCAACGAGACGTGGGGCGTA
[37]515-R9: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,
[38]515L: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,
[39]515-P6: HEX-TGCTGCTGAGGAAGCAGTTTCC-BHQ2,
[40]515K: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,
[41]515-R5: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,
[42]515-P10: HEX-CTGCTGAGGTTGCAGTTTC-BHQ2,
[43]дополнительно в качестве источника флуоресценции в TaqMan зондах на 5' конце используют краситель карбокси-Х-родамин (ROX), а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-2 (BHQ2) на 3' конце, а результат признают положительным, если значение порогового цикла (Ct) для образца не больше 35.
[44]Заявляемая группа изобретений соответствует требованию единства изобретения, поскольку группа разнообъектных изобретений образует единый изобретательский замысел, причем один из заявляемых объектов - набор реактивов для выявления Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, предназначен для использования в другом - способе диагностики Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, при этом оба объекта группы изобретений направлены на решение одной и той же задачи с получением единого технического результата.
[45]Сопоставительный анализ с прототипом позволил выявить совокупность существенных по отношению к техническому результату отличительных признаков для каждого из заявляемых объектов группы, изложенных в формулах. Следовательно, каждый из объектов группы изобретений соответствует критерию «новизна».
[46]Из литературы и практики ПЦР-исследований неизвестно о способе мультиплексного ПЦР-анализа и (или) наборе реактивов для одновременного выявления отдельных патогенетических соматических мутаций V617F, с. 1092_1143del, с. 1154_1155insTTGTC, W515L, W515K в генах JAK2, CALR и MPL с использованием всего двух реакционных смесей для одной биологической пробы, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию «изобретательский уровень».
[47]Сущность изобретения поясняется с помощью графических материалов.
[48]На фиг. 1 представлены кривые накопления флуоресцентного сигнала после проведения ПЦР-РВ для пробы без соматических мутаций: 1 - аллель "дикого типа" JAK2.
[49]На фиг. 2 представлены кривые накопления флуоресцентного сигнала после проведения ПЦР-РВ для пробы с одной из пяти соматических мутаций: 1 - аллель "дикого типа" JAK2, 2 - мутация JAK2 V617F.
[50]На фиг. 3 представлены кривые накопления флуоресцентного сигнала после проведения ПЦР-РВ для пробы одновременно с двумя соматическим мутациями: 1 - аллель "дикого типа" JAK2, 2 - мутация JAK2 V617F, 3 - CALR 1 типа (с.1092_1143del).
[51]Способ осуществляется следующим образом.
[52]Мультиплексную полимеразную цепную реакцию проводят в смеси объемом 25 мкл на 1 пробу ДНК. Для каждого анализируемого образца ДНК пациента готовят 2 пробирки, в которые вносят реакционные смеси, соответствующие номеру пробирки (таблица 1). В каждую пробирку добавляют Taq-полимеразу (5 ед/мкл) в объеме 0,5 мкл, а затем ДНК исследуемого образца с концентрацией не менее 40 нг в объеме 10 мкл. При каждом исследовании необходимо использовать две дополнительные пробирки, в которые вместо ДНК вносят контрольные образцы ПКО (положительный контрольный образец) и ОКО (отрицательный контрольный образец). ПКО представляет собой человеческую геномную ДНК с наличием мутантных аллелей всех исследуемых генов. ОКО представляет собой человеческую геномную ДНК здорового донора, не имеющего мутаций в исследуемых генах.
[53]
[54]
[55]Указанные в таблице 1 реакционные смеси, входящие в состав набора включают специфичные праймеры и зонды:
[56]Реакционная смесь №1 содержит праймеры: JAK2-W-F, JAK2-R, JAK2-P, CALR-D, CALR-R, 515K, 515-R5 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р6 с красителями: флуоресцеин (FAM), карбокси-Х-родамин (ROX) и хлорированный флуоресцеин (HEX) на на 5' конце, а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-1 (BHQ1) и Black Hole Quencher-2 (BHQ2) на 3' конце.
[57]Реакционная смесь №2 содержит праймеры: JAK2-W-F, JAK2-P, CALR-R, JAK2-RM, CALR-I, 515L, 515-R9 и TaqMan зонды: JAK2-P, CALR-P, 515-Р10 с красителями: флуоресцеин (FAM), карбокси-Х-родамин (ROX) и хлорированный флуоресцеин (HEX) на на 5' конце, а для тушения флуоресценции используют Black Hole Quencher-1 (BHQ1) и Black Hole Quencher-2 (BHQ2) на 3' конце.
[58]Праймеры имеют следующий нуклеотидный состав:
[59]JAK2-W-F: AGCAGCAAGTATGATGAGC,
[60]JAK2-R: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,
[61]JAK2-P: FAM-CACAGACACATACTC-BHQ1,
[62]JAK2-RM: GATGCTCTGAGAAAGGCAT,
[63]CALR-D: GAGGAGTTTGGCAACGAGAC,
[64]CALR-R: CCTCATCCTCCTCATCCTCA,
[65]CALR-P: HEX-AGGAGCAGAGGACAAGGAGGATGA-BHQ2,
[66]CALR-I: GCAACGAGACGTGGGGCGTA
[67]515-R9: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,
[68]515L: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,
[69]515-P6: HEX-TGCTGCTGAGGAAGCAGTTTCC-BHQ2,
[70]515K: TAGCCTGGATCTCCTTGGTG,
[71]515-R5: ACAGAGCGAACCAAGAATGC,
[72]515-P10: HEX-CTGCTGAGGTTGCAGTTTC-BHQ2
[73]Праймеры и зонды подбирали с использованием программы «Primer 3». Подобранные последовательности были проанализированы в GenBank с помощью программы BLAST (таблица 2). По итогам анализа не было обнаружено последовательностей в геноме человека, гомологичных подобранным праймерам и зондам.
[74]
[75]Реакционные смеси № 1 и № 2, состав которых указан в таблице 1, готовят в двух соответствующих пробирках и одновременно помещают в термоблок амплификатора. Температурно-временной режим проведения реакции для амплификатора «CFX96» («Bio-Rad», США) следующий: предварительная активация при 95°С - 5 минут и последующие циклы включающие денатурацию при 95°С - 15 секунд и отжиг и элонгацию при 60°С - 60 секунд, цикл повторяют 50 раз.
[76]Полученные данные - кривые накопления флуоресцентного сигнала с обеих пробирок анализируют с помощью программного обеспечения используемого прибора для проведения ПЦР в режиме «реального времени» в соответствии с инструкцией к прибору (фиг. 1-3).
[77]Для определения порогового цикла (Ct) для каждой пробирки необходимо использовать автоматический расчет. Интерпретация результатов возможна при условии, что пороговые циклы ОКО больше 35, а пороговые циклы ПКО меньше 35 в обеих пробирках. В противном случае результат признается недостоверным. Для всех исследуемых биологических проб пороговый цикл смеси №1 по каналу FAM должен быть менее 30. Несоблюдение этого условия указывает на малое количество ДНК, добавленное в пробу. Пороговые циклы флуоресцентных сигналов в любой из пробирок не должны быть менее 
что указывает на избыточное количество ДНК, добавленное в пробу. В этом случае необходимо повторить анализ с предварительным разведением ДНК.
[78]Для расчета аллельной нагрузки мутации V617F необходимо воспользоваться формулой:
[79]
[80]При значении аллельной нагрузки >0,5% проба считается положительной по мутации JAK2 V617F.
[81]Для определения наличия мутаций в гене CALR необходимо воспользоваться формулами:
[82]
[83]При значении CALR c.1092_1143del>3 проба считается положительной по мутации с. 1092_1143del гена CALR.
[84]
[85]При значении c.1154_1155insTTGTC>3 проба считается положительной по мутации с. 1154_1155insTTGTC гена CALR.
[86]Наличие мутации W515K в гене MPL определяется при Ct<35 смеси 1 по каналу ROX. Наличие мутации W515L в гене MPL определяется при Ct<35 смеси 2 по каналу ROX. Образцы пациентов в редких случаях могут содержать одновременно несколько мутаций.
[87]Кривые накопления флуоресцентного сигнала для образца, не содержащего ни одной из анализируемых мутаций, имеют вид, представленный на фиг. 1. На фиг. 2 представлены кривые для образца с одной соматической мутацией, в данном случае с мутацией JAK2 V617F. На фиг. 3 представлены кривые интенсивности флуоресценции для образца с двумя одновременно выявленными соматическими мутациями - JAK2 V617F и CALR 1 типа. Во всех примерах - по оси X - указаны циклы амплификации, по оси У - уровень флюоресценции продукта амплификации.
[88]Преимуществом заявляемого изобретения является то, что разработанный набор реактивов и использование мультиплексной ПЦР позволяют проводить одновременное исследование пяти соматических мутаций в одной аналитической серии с использованием всего двух реакционных смесей для анализа одной биологической пробы, при этом в сравнении с прототипом достигается двукратное снижение времени выполнения анализа, расход лабораторных пробирок и реактивов, а также повышается эффективность использования амплификаторов (таблица 3).
[89]
[90]Параллельный анализ 138 образцов клинического материала, установил, что положительные и отрицательные результаты ПЦР тестов совпали во всех образцах (таблица 4).
[91]
[92]Изобретение позволяет проводить одновременное исследование пяти мутаций в одной аналитической серии, используя всего две пробирки с реакционными смесями, что приводит к экономии используемого для анализа объема биологического образца, реактивов и времени выполнения анализа. Набор заявляемых реактивов позволяет с большей эффективностью использовать оборудование для амплификации нуклеиновых кислот.
