[2]Изобретение относится к микробной биотехнологии, микробиологической промышленности и касается штамма микроорганизма Streptomyces rochei МР21, продуцирующего кирромицин - поликетидный антибиотик полиеновой структуры.
[3]Изобретение может быть использовано для получения антибиотика кирромицина, обладающего особой селективной активностью в отношении ограниченного круга бактерий, в том числе представителей родов Streptococcus sp. и Mycoplasma sp. Его практическое применение возможно также при разработке лечебных кормов и ветеринарных препаратов для сельскохозяйственных животных.
[5]Кирромицин (моцимицин, дельвомицин, антибиотик MYC8003 и т.д.) является ингибитором синтеза белка у прокариотических организмов, принадлежащим по механизму действия к группе так называемых «эльфамицинов»: веществ, блокирующих активность термонестабильного фактора элонгации EF-Tu - необходимого функционального звена, обеспечивающего жизненно важную клеточную функцию синтеза белка. У прокариот основной функцией EF-Tu является транспортировка заряженной соответствующей аминокислотой тРНК (аа-тРНК) к А-сайту рибосомы для удлинения синтезируемой полипептидной цепи. EF-Tu представляет собой G-белок, обладающий внутренней способностью гидролизовать ГТФ до ГДФ (гуанозинтрифосфат до гуанозиндифосфата). EF-Tu образует комплекс с ГТФ и аа-тРНК и способствует общей точности трансляции.
[6]Если с кодоном мРНК связывается соответствующий ему антикодон тРНК, то рибосома изменяет конфигурацию и изменяет геометрию ГТФазного домена EF-Tu, что приводит к гидролизу ГТФ в ГДФ. При гидролизе ГТФ конформация EF-Tu резко изменяется, и он диссоциирует от комплекса аа-тРНК и рибосомы. Затем аа-тРНК полностью попадает в А-сайт, где ее аминокислота приближается к полипептиду Р-сайта, а рибосома катализирует ковалентный перенос полипептида на аминокислоту - так растет полипептидная цепь.
[7]Кирромицин препятствует высвобождению EF-Tu из рибосомы после гидролиза ГТФ [Wolf, Chinali, Parmeggiani, 1974] и, таким образом, нарушает процесс удлинения пептидной цепи. Такой механизм активности проявляется как в отношении грамположительных, так и грамотрицательных бактерий [Jotte, 2016].
[8]Наряду с рибосомой, EF-Tu является одной из наиболее важных мишеней для антибиотик-опосредованного ингибирования трансляции [Krab, Parmeggiani, 2002], поскольку не способствует формированию перекрестной устойчивости к веществам, непосредственно связывающимся с рибосомой и блокирующим ее работу, многие из которых широко используются в клинической практике. Природные ингибиторы факторов трансляции в настоящее время вызывают особый интерес у исследователей [Dmitriev, Vladimirov, Lashkevich, 2020], так как на их основе могут быть получены комбинированные антибактериальные препараты из нескольких активных субстанций, действующих синергично.
[9]В 1972 Вольфом и Захнером при скрининге природных антибактериальных субстанций с узким спектром действия в культуральной жидкости Streptomyces collinus Tu 365 было обнаружено и выделено вещество, названное кирромицином [Wolf, Zahner, 1972]. Примерно в то же время, Boc и Вервель выделили вещество моцимицин, которое было идентично кирромицину (дельвомицин, диметиллауродокс) [Maehr et al., 1973; Vos, Verwiel, 1973]. Также были описаны и другие вещества микробного происхождения близкой к кирромицину структуры: ауродокс [Berger et al., 1973], эфротомицин [Wax et al., 1976], хенейкомицин [Zimmerman et al., 1979], кирротрицин [Thein-Schranner et al., 1982], ганефромицин [Carter et al., 1988].
[10]Вскоре после открытия была установлена и редкая биологическая мишень, на которую воздействуют кирромицин и его аналоги: они осуществляют специфическое взаимодействие с фактором элонгации у прокариот (EF-Tu) [Parmeggiani, Swart, 1985; Wolf, Chinali, Parmeggiani, 1974; Wolf, Zahner, 1972]. Благодаря общей мишени эти антибиотики были объединены в группу так называемых эльфамицинов (термин, образованный от сокращения словосочетания elongation factor).
[11]Совместная кристаллизация ауродокса (N-метил-производного кирромицина) с очищенным фактором элонгации, полученным из Thermus aquaticus, выявила, что вещество связывается с доменами I и II фактора элонгации EF-Tu [Vogeley et al., 2001]. Эта связь приводит к изменению конформации данного белкового фактора, повышая его сродство к рибосоме, и тем самым препятствуя его освобождению, что приводит к остановке рибосомы и в конечном счете нарушению процесса синтеза белка. Подобный механизм действия делает кирромицин и его аналоги важными средствами для изучения процессов регуляции синтеза белка и поиска веществ, ценных для фармакологии [Weber et al., 2008].
[12]В патенте US 3927211 описан антибиотик кирромицин (моцимицин, МУС 8003), полученный в микроорганизме Streptomyces ramocissimus. В экспериментах in vitro было установлено, что МУС 8003 обладает селективным ингибирующим действием на ряд микоплазм, возбудителей пневмоний, особенно в отношении Mycoplasma gallisepticum, вызывающего заболевания респираторного тракта у домашней птицы.
[13]Было показано также, что кирромицин обладает низкой минимальной действующей концентрацией (МИК) в отношении Bacillus cereus АТСС 9139, Actinobacillus equuli subsp. equuli T9 и ряда других бактерий [патент US 3927211], особенно выраженная антагонистическая активность отмечена против представителей родов Streptococcus, Enterococcus, Neisseria gonorrhoeae и Haemophilus influenzae [Tavecchia et al., 1996], в то время как белок EF-Tu, выделенный из Staphylococcus aureus оказался устойчивым к присутствию кирромицина [Hall, Watkins, Georgopapadakou, 1989].
[14]Хотя не сообщалось о токсическом действии кирромицина на эукариотические клетки [Schmid, Anke, Wolf, 1978], кирромицин оказался активным против малярийного паразита Plasmodium falciparum в культурах крови, вызывая у плазмодия нарушение синтеза белка в органеллах [Clough et al., 1999].
[15]Благодаря узкому спектру действия кирромицин может рассматриваться как селективный, специфичный агент, ориентированный на ограниченную группу чувствительных микроорганизмов. Кроме того, данное вещество может быть использовано как стимулятор роста животных: было показано, что дозы 2,5-20 мг/кг массы вызывают положительный эффект на прирост биомассы кур [патент US 3927211].
[16]Существуют две причины того, что микроорганизмы могут быть устойчивы к кирромицину: во-первых, они могут иметь мутации в гене EF-Tu, приводящие к изменению сайта связывания с кирромицином и делающие фактор элонгации способным выполнять свои функции в присутствии антибиотика [Mesters et al., 1994]; во-вторых, можно предположить, что у некоторых микроорганизмов кирромицин не может проникнуть внутрь клетки, либо выводится из нее прежде, чем произойдет взаимодействие с EF-Tu [Weber et al., 2008].
[17]Молекула кирромицина линейный поликетид, содержащий три циклические структуры: пиридоновое кольцо, центральную тетрагидрофурановую структуру и сахароподобную структуру, так называемую голдиноновую кислоту (Фиг. 1). В 2008 году был описан биосинтетический кластер генов, участвующих в синтезе кирромицина, и показано, что поликетидный остов кирромицина синтезируется очень необычным способом с помощью гибридной нерибосомальной пептид с интетазы (NRPS)/поликетидсинтазы (PKS), а также прояснен путь биосинтеза пиридонового кольца [Weber et al., 2008]. Дальнейшие исследования генов, кодирующих «сшивочные ферменты» в биосинтетическом кластере позволили установить их роль на поздних стадиях формирования конечной структуры кирромицина [Robertsen et al., 2018].
[18]Известны несколько продуцентов кирромицина (моцимицина), принадлежащие к роду Streptomyces vi Actinoplanes.
[19]Из работы Рюкерта с соавторами известен нетиповой штамм Streptomyces collinus Tti 365 (DSMZ 40733) - продуцент кирромицина; в результате полногеномного секвенирования выявлены гены биотехнологического кластера, ответственного за синтез кирромицина [Rückert et al., 2013]. Продуктивность этого штамма составляет порядка 6-7 мг/л кирромицина [Weber et al., 2008].
[20]Из статьи Олсторн-Тилеман соавторами и патента US 3927211 известен штамм S. ramocissimus CBS 190-63 [Olsthoorn-Tieleman et al., 2007], описанный как представитель нового вида, однако, не включенный в базу данных LPSN, признанную в настоящее время основой таксономической номенклатуры прокариот (https://lpsn.dsmz.de/). Продуктивность данного штамма составляет 16,1 мг/л кирромицина [патент US 3927211]
[21]Из работы Беретты с соавторами известен штамм Actinoplanes sp. А8924 - продуцент кирромицина [Beretta et al., 1993]. Гастальдо с соавторами путем направленных мутаций и подбора условий улучшили производительность этого штамма с 30-50 мг/л до 350 мг/л кирромицина [Gastaldo et al., 1996]. Однако, в настоящее время судьба данного мутантного штамма Actinoplanes sp. A8924/F неизвестна, поскольку за последующие 28 лет публикаций, упоминающих этот штамм, не обнаружено. Так же нам не удалось обнаружить сам этот штамм в российских и зарубежных коллекциях микроорганизмов.
[22]К серьезным недостаткам других упомянутых штаммов - продуцентов кирромицина, можно отнести малую продуктивность при выработке целевого антибиотика.
[23]Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является решение как минимум одной из вышеуказанных в уровне техники проблем.
[25]Технической решением является использование описанного признаками в пунктах формулы изобретения.
[26]Одной из возможных технических задач, на решение которой может быть направлено настоящее изобретение, являлось расширение арсенала технических средств, предназначенных для получения антибиотика кирромицина, в частности получение бактериального штамма, способного продуцировать ферментационную жидкость с высоким содержанием антибиотика кирромицина - не менее 200 мг/л.
[27]Задача может решаться тем, что выделен и охарактеризован штамм Streptomyces rochei МР21.
[28]Штамм Streptomyces rochei МР21 был выделен при поверхностном посеве на минеральный агар 1 [Гаузе et al., 1983] из образца, представляющего собой крупную фракцию (диаметром 2-3 мм) морских отложений. Образцы были собраны на городском пляже Федеральной территории Сириус (43.39774 с.ш. 39.96303 в.д) в августе 2021 года.
[29]Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов ФГБУ «ФИЦ «Пущинский Научный Центр Биологических Исследований Российской Академии Наук» (Россия, 142290, Московская обл., Пущино, пр. Науки, 5, ИБФМ) под регистрационным номером ВКМ Ac-2939D.
[30]Видовая идентификация штамма МР21 основывалась на методологии полифазной таксономии, сочетающей анализ данных секвенирования нуклеотидных последовательностей гена 16s рРНК и сопоставления этих данных с последовательностями, депонированными в базе GenBank [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank]. наряду с изучением фенотипических признаков: культуральных, морфологических и физиологических. Данный подход в настоящее время считается абсолютно надежным для идентификации мицелиальных актинобактерий на уровне рода и в большинстве случаев достаточным для определения видовой принадлежности.
[31]Штамм Streptomyces rochei МР21 характеризуется культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками, согласующимися с таковыми, приведенными для представителей рода Streptomyces [Goodfellow, 2015].
[32]Культурально-морфологические признаки
[33]Культуральные характеристики штамма Streptomyces rochei МР21 ВКМ Ac-2939D описаны на спектре твердых питательных сред (Фиг. 8), рекомендованных для фенотипического описания актиномицетов в рамках Международного проекта по изучению стрептомицетов - International Streptomyces Project [Shirling, Gottlieb, 1966].
[34]Изучение морфологии Streptomyces rochei MP21 на 14 сутки роста на овсяном агаре с помощью сканирующего электронного микроскопа (Фиг. 2) позволило установить, что штамм образует хорошо развитый разветвленный воздушный мицелий (0,43-0,45 мкм), несущий короткие прямые цепочки гладких овальных спор (1,25-1,27×0,75-0,81 мкм).
[35]Физиолого-биохимические признаки
[36]Штамм растет в аэробных условиях, в диапазоне температур от +20 до +45°С, с оптимумом роста при 37±2°С.
[37]Способен образовывать кислоту при росте на арабинозе, фруктозе, глюкозе, инозитоле, сахарозе, маннозе, рамнозе; слабее: на галактозе, лактозе, мальтозе, ксилозе, маннитоле. Не использует сорбитол, сахарозу (Фиг. 3).
[38]Способен к гидролизу казеина, крахмала, карбоксиметилцеллюлозы.
[39]В качестве источника азота использует нитратные, аммонийные соединения, гидролизаты белков, аминокислоты.
[40]Чувствительность к антибиотикам, определенная диско-диффузионным методом составляет: для эритромицина (5 мкг/диск), левофлоксацина (5 мкг/диск), ванкомицина (5 мкг/диск) и амоксициллина (20 мкг/диск).
[41]Образует антибиотик кирромицин, характеризующийся выраженной антибиотической активностью в отношении ряда патогенных анаэробных бактерий, а также представителей родов Neisseria sp. и Streptococcus sp. [Gastaldo et al., 1996].
[42]Штамм Streptomyces rochei MP21 BKM Ac-2939D не патогенен.
[43]Хранение и поддержание жизнеспособности штамма
[44]Штамм можно хранить при +4°С и поддерживать путем пересева раз в 3-4 недели в пробирки со скошенным овсяным агаром.
[45]Длительное хранение штамма при температуре от -20 до -80°С может быть обеспечено культивированием в жидкой питательной среде, содержащей глюкозу, гидролизат белков, дрожжевой экстракт, минеральные соли в течение 3-5 суток, и последующим разливом культуральной жидкости в специальные емкости для хранения при низких температурах с добавлением веществ-криопротекторов и соблюдением условий стерильности.
[46]Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:
[47]На Фиг. 1 изображена структурная формула молекулы кирромицина.
[48]На Фиг. 2 представлена электронная микрофотография мицелия и спор штамма Streptomyces rochei МР21 ВКМ Ac-2939D, сделанная на 14-е сутки роста культуры на овсяном агаре при 28°С (Cambridge Instruments CamScan S2).
[49]На Фиг. 3 отражена способность штамма Streptomyces rochei МР21 ВКМ Ac-2939D образовывать кислоту при росте на среде с единственным источником углерода: верхний ряд слева направо: арабиноза, фруктоза, манноза, рамноза, глюкоза; средний ряд: инозитол, ксилоза, мальтоза, галактоза, лактоза; нижний ряд: сахароза, сорбитол, минеральная основа без источника углерода.
[50]На Фиг. 4 представлены результаты тестирования LPS-фракций на репортерном тест-организме Е.coli dtolC JW5503: МР21 - исходная культуральная жидкость, МР21 (ACN10-ACN50) - фракции культуральной жидкости штамма МР21, элюированные растворами ацетонитрила различных концентраций, нанесены референсные антибиотики эритромицин (Ery, 2 мкг) и норфлоксацин (Nor, 0,04 мкг).
[51]На Фиг. 5 представлены результаты ВЭЖХ-анализа активной фракции, извлеченной 30% раствором ацетонитрила в воде из культуральной жидкости Streptomyces rochei МР21 ВКМ Ac-2939D.
[52]На Фиг. 6а представлены результаты масс-спектрометрического обнаружения кирромицина в культуральной жидкости Streptomyces rochei МР21 ВКМ Ac-2939D (фрагментация иона [М+Н]+, m/z 797.421 Da): спектр фрагментации совпадает с литературными данными (Фиг. 6б).
[53]На Фиг. 7 представлен спектр оптического поглощения активного компонента в ультрафиолетовой и видимой областях.
[54]На Фиг. 8 представлена таблица культуральных характеристик штамма Streptomyces rochei МР21 ВКМ Ac-2939D.
[55]Примеры осуществления изобретения
[56]Сущность и практическая применимость настоящего изобретения поясняется следующими примерами:
[57]Пример 1. Подготовка штамма к длительному низкотемпературному хранению.
[58]Штамм Streptomyces rochei МР21 ВКМ Ac-2939D культивируют в жидкой питательной среде следующего состава: глюкоза - 10 г, пептон - 10 г, гидролизат казеина 2 г, дрожжевой экстракт 2 г, NaCl 6 г, вода 1 л, при 28°С. Затем в 3-5 суточную культуральную жидкость в качестве криопротектора асептически вводят стерильный раствор 50% глицерола в объемном соотношении 1:1. Полученную смесь раскапывают по криопробиркам и помещают на хранение при температуре -80°С.
[59]Пример 2. Выделение и культивирование Streptomyces rochei МР21 ВКМ Ac-2939D
[60]Для исследования отбирали образцы морских отложений с территории пляжа ФТ «Сириус» (43.39774 с.ш. 39.96303 в.д.) в стерильные контейнеры, транспортировали в лабораторию и сразу производили посев из серии десятикратных разведений, приготовленных с использованием стерильной морской воды. Использовали питательную среду следующего состава (г/л): крахмал растворимый - 20,0; K2HPO4 - 0,5; MgSO4×7H2O - 0,5; KNO3 - 1,0; NaCl - 0,5; FeSO4×7H2O - 0,01; агар - 20 [Гаузе et al., 1983]. Для ограничения роста грибов и грамотрицательных бактерий в среды перед разливом добавляли нистатин (250 мкг/мл) и налидиксовую кислоту (10 мкг/мл) соответственно. Засеянные чашки Петри инкубировали при 28°С в течение двух недель.
[61]Выросшие колонии мицелиальных прокариот выделяли в отдельные изоляты, среди которых проводили скрининг на антагонистическую активность с помощью репортерной системы Е. coli JW5503 ΔtolC-pDualrep2 [Osterman et al., 2016].
[62]Разработанная репортерная конструкция представляет собой штамм грамотрицательной бактерии Е. coli JW5503 с инактивированным геном tolC, который кодирует один из компонентов AcrAB-TolC системы, ответственной за откачку из клетки различных ксенобиотиков. Модифицированные таким образом клетки лишены способности к синтезу белка TolC, а значит, являются значительно более чувствительными ко многим антибиотикам, в том числе к тем, которые подавляют рост только грамположительных бактерий. Кроме того, данный штамм трансформирован плазмидой pDualrep2, несущей гены для синтеза двух флюоресцентных белков TurboRFP и Katushka2S, которые позволяют определять два из возможных механизмов ингибирующего действия исследуемого агента на репортерные клетки. В случае попадания в клетку веществ, вызывающих повреждения ДНК, в ней активируется синтез белков, необходимых для репарации ДНК (так называемый SOS-ответ), однако, в репортерной системе в этом случае происходит увеличение экспрессии флюоресцентного белка TurboRFP, который можно детектировать при 553/574 нм.
[63]Если сублетальные концентрации тестируемого вещества нарушают процесс синтеза белка в клетках репортерного штамма, то под действием генетически измененного аттенюатора триптофанового оперона в них вырабатывается другой флюоресцентный белок - Katushka2S (максимум поглощения/испускания составляет 588/633 нм).
[64]Пример 3. Оценка ингибирующей активности и определение возможного механизма действия соединения, синтезируемого штаммом Streptomyces rochei МР21 ВКМ Ac-2939D, в отношении репортерного штамма Е. coli JW5503 ΔtolC-pDualrep2.
[65]Ночную культуру штамма E.coli JW5503 ΔtolC, трансформированного плазмидой pDualrep2, разбавляли в десять раз свежей средой LB и выливали на чашки с агаризованной средой LB и канамицином (50 мкг/мл). После высыхания жидкости на поверхности агара, в среде проделывали лунки диаметром 8 мм, в которые вносили по 100 мкл исследуемого образца: культуральную жидкость штамма, полученную способом, описанным в Примере 4.1. (Фиг. 4), фракции, полученные путем твердофазной экстракции посредством элюирования водными растворами ацетонитрила 10%, 20%, 30% и 40%, описанными в Примере 4.3 (Фиг. 4). Также на поверхность агара наносили антибиотики, для верификации отклика репортерного штамма: эритромицин (Ery, 2 мкг), нарушающий процесс трансляции, и норфлоксацин (Nor, 0,04 мкг), вызывающий повреждение ДНК (Фиг. 4).
[66]После культивировании в течении 18 часов при температуре 37°С полученные чашки сканировали при помощи системы для визуализации ChemiDoc® (Bio-Rad) в каналах Су3 (для детекции TurboRFP) и Су5 (для детекции Katushka2S).
[67]Вокруг лунок с культуральной жидкостью и экстрактами штамма Streptomyces rochei МР21 ВКМ Ac-2939D наблюдалась зона отсутствия роста репортерного штамма, а также активная экспрессия белка Katushka2S в зоне сублетальных концентраций (Фиг. 4). Таким образом, было выявлено, что штамм Streptomyces rochei МР21 ВКМ Ac-2939D, при культивировании в условиях, указанных в примере 4.1., вырабатывает вещество, вызывающее повреждение синтеза белка у репортерного штамма E.coli JW5503 ΔtolC-pDualrep2.
[68]Пример 4. Получение кирромицина с использованием нового штамма-продуцента
[69]Пример 4.1. Культивирование штамма-продуцента. Клетки Streptomyces rochei МР21 ВКМ Ac-2939D выращивали в 100 мл жидкой питательной среды следующего состава (г/л): глюкоза - 10, пептон - 10, дрожжевой экстракт - 2, гидролизат казеина - 2, NaCl - 6,0, вода - остальное (рН после автоклавирования при 0,5 атм составляет 7,0-7,2). Культивирование производили в 250 мл конических колбах при 28°С и перемешивании на орбитальном шейкере в течение 3 суток. Полученную культуральную жидкость с клетками продуцента в концентрации 106 кл/мл использовали как посевной материал, засевая им в объеме внесения 5-10% конические колбы общим объемом 750 мл, содержащие 100-150 мл жидкой питательной среды вышеприведенного состава. Засеянные колбы в течение 5 суток инкубировали на шейкере при 28°С.
[70]К концу ферментации содержание кирромицина в культуральной жидкости составляло не менее 270 мг/л.
[71]По окончании срока ферментации культуральную жидкость с клетками микроорганизмов сливали из колб и центрифугировали 10 минут при скорости 4500 об/мин, чтобы отделить кондиционированную культуральную жидкость от клеточной биомассы.
[72]Пример 4.2. Подготовка хроматографической колонки. В чистую и сухую колонку для твердофазной экстракции помещали 1 мл (0,3 г) сухого сорбента LPS-500H (сополимер дивинилбензола/ гидрофильного мономера), заливали 15 мл 50% (v/v) раствора ацетонитрила в воде, после полного просачивания через сорбент заливали 15 мл 10% v/v раствора ацетонитрила в воде и в заключение трижды промывали колонку дистиллированной водой. Данная процедура применяется для гарантированной очистки сорбента от посторонних соединений.
[73]Пример 4.3. Идентификация и выделение кирромицина из культуральной жидкости.
[74]Освобожденную от биомассы с помощью центрифугирования кондиционированную культуральную жидкость Streptomyces rochei МР21 ВКМ Ac-2939D наносили на хроматографическую колонку с подготовленным как описано в Примере 4.2. сорбентом. После нанесения всей культуральной жидкости на колонку, ее промывали дистиллированной водой, а затем элюировали 30% (v/v) раствором ацетонитрила в воде.
[75]Фракция, экстрагированная 30% раствором ацетонитрила, продемонстрировала наибольшую антагонистическую активность при подавлении роста репортерного штамма E.coli dtolC JW5503, трансформированного плазмидой pDualrep2, скрининг проводили способом, описанным в Примере 2. [Osterman et al., 2016] (Фиг. 4).
[76]Полученный элюат разделяли при помощи высокоэффективной хроматографии высокого давления (Фиг. 5) на ВЭЖХ-системе Vanquish Flex UHPLC System, используя детектор Diode Array (ThermoFisher Scientific), оснащенный колонкой Luna® 5 μm C18(2) 100 Å, 250 x 4.6 mm (Phenomenex)). Все полученные пробы тестировали на репортерном штамме E.coli dtolC JW5503 как описано в Примере 2, определяли активную фракцию и концентрировали ее при помощи роторного испарителя.
[77]Идентификацию активного вещества проводили методом хромато-масс-спектрометрии высокого разрешения, с использованием масс-спектрометра Bruker maXis II 4G ETD, хроматографа UltiMate 3000, оснащенного колонкой Acclaim RSLC 120 C18 2.2um 2.1x100mm. Масс-спектры обрабатывали с использованием программ OpenChrom Lablicate Edition (1.4.0.202201211106), TOPPView v. 2.6.0 [Kohlbacher et al., 2007]. Поиск природных соединений-кандидатов проводили с помощью баз данных GNPS [Wang et al., 2016], NP Atlas [Santen van et al., 2019; Santen van et al., 2022], Dictionary of Natural Products.
[78]Брутто-формула соединения C43H60N2O12, содержащегося в активной фракции, устанавливали на основании данных масс-спектрометрии высокого разрешения, отклонение массы составило 0.5 ppm. В режиме регистрации положительных ионов наблюдали ион [М+Н]+ с m/z 797.422 (расчетная масса [М+Н]+ для состава C43H60N2O12 - 797.4224554). Приоритизацию кандидатов проводили на основании данных о времени удерживания, происхождении и механизме действия активного соединения (ингибитор биосинтеза белка), выявляли кирромицин как удовлетворяющий всем заданным условиям.
[79]Подтверждение структуры проводили на основе совпадения зарегистрированного УФ-спектра с максимумом на 327-328 нм с литературными данными [Maehr et al., 1973; Vos, Verwiel, 1973; Vost, Verwiel, 1973] в пределах погрешности. Совпадение структуры дополнительно подтверждали сравнением основных ионов в спектре фрагментации CID выделенного соединения со спектром фрагментации кирромицина из базы данных масс-спектров GNPS (номер спектра CCMSLIB00000853299), в котором наблюдались идентичные фрагментные ионы в области m/z 550-650 (589.3, 607.3, 625.3); в области m/z 400-450 (416.2, 434.2), а также фрагментные ионы с m/z 322.2, 178.1, 138.0, 121.1 и др. (Фиг. 6а, 6б). Различия в интенсивностях фрагментных ионах обусловлены разными условиями съемки и энергиями ионизации, приводящими к изменению глубины фрагментации молекулы; совпадение более чем 6 фрагментных ионов и точной массы однозначно указывает на идентичности структуры выделенного соединения кирромицину.
[80]Таким образом, установлено, что фракция, полученная экстракцией 30% v/v раствором ацетонитрила из культуральной жидкости Streptomyces rochei МР21 ВКМ Ас-2939D, нарушает синтез белка у репортерного штамма JW5503 ΔtolC -pDualrep2 и представлена антибиотиком кирромицином (моцимицином, дельвомицином).
[81]Заявитель просит рассмотреть представленные материалы заявки «Штамм Streptomyces rochei МР21 - продуцент антибиотика кирромицина» на предмет выдачи патента на изобретение.
[83]1. Гаузе Г.Ф. и др. Определитель актиномицетов. Роды Streptomyces, Streptoverticillium, Chainia. Москва: Наука, 1983. 248 с.
[84]2. Beretta G. et al. A novel producer of the antibiotic kirromycin belonging to the genus Actinoplanes // J. Antibiot. 1993. T. 46. №7. C. 1175-1177.
[85]3. Berger J. et al. A new antibiotic X-5108 OF Streptomyces origin. I. Production, isolation and properties. // J Antibiot (Tokyo). 1973. T. 26. №1. C. 15-22.
[86]4. Carter G.T. et al. LL-E19020 alpha and beta, novel growth promoting agents: isolation, characterization and structures. // J Antibiot (Tokyo). 1988. T. 41. №10. C. 1511-1514.
[87]5. Clough B. et al. Antibiotic inhibitors of organellar protein synthesis in Plasmodium falciparum. // Protist. 1999. T. 150. №2. C. 189-195.
[88]6. Dmitriev S.E., Vladimirov D.O., Lashkevich K.A. A Quick Guide to Small-Molecule Inhibitors of Eukaryotic Protein Synthesis // Biochemistry (Moscow). 2020. T. 85. №11. C. 1389-1421.
[89]7. Gastaldo L. et al. Improvement of the kirromycin fermentation by resin addition // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 1996. T. 16. №5. C. 305 308.
[90]8. Goodfellow M. Actinobacteria // Bergey's Manual of Systematics of Archaea and Bacteria.: John Wiley & Sons, Ltd, 2015. C. 1-2.
[91]9. Hall С.C., Watkins J.D., Georgopapadakou N.H. Effects of elfamycins on elongation factor Tu from Escherichia coli and Staphylococcus aureus. // Antimicrob Agents Chemother. 1989. T. 33. №3. C. 322-325.
[92]10. Jotte M. Kirromycin Enacyloxin Ha report for BioOrganic Chemistry., 2016.
[93]11. Kohlbacher О et al. TOPP--the OpenMS proteomics pipeline. // Bioinformatics. 2007. T. 23. №2. C. e191-197.
[94]12. Krab I.M., Parmeggiani A. Mechanisms of EF-Tu, a pioneer GTPase // Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology.: Academic Press, 2002. C. 513-551.
[95]13. Maehr H. et al. Antibiotic X-5108. V. Structures of antibiotic X-5108 and mocimycin. // J Am Chem Soc. 1973. T. 95. №25. C. 8449 8450.
[96]14. Mesters J. R. et al. The structural and functional basis for the kirromycin resistance of mutant EF-Tu species in Escherichia coli. // EMBO J. 1994. T. 13. №20. C. 4877-4885.
[97]15. Olsthoorn-Tieleman L.N. et al. Elongation factor Tu3 (EF-Tu3) from the kirromycin producer Streptomyces ramocissimus Is resistant to three classes of EF-Tu-specific inhibitors. // J Bacterid. 2007. T. 189. №9. C. 3581-3590.
[98]16. Osterman I.A. et al. Sorting Out Antibiotics' Mechanisms of Action: a Double Fluorescent Protein Reporter for High-Throughput Screening of Ribosome and DNA Biosynthesis Inhibitors // Antimicrob Agents Chemother. 2016. T. 60. №12. C. 7481-7489.
[99]17. Parmeggiani A., Swart G.W. Mechanism of action of kirromycin-like antibiotics. // Annu Rev Microbiol. 1985. T. 39. C. 557-577.
[100]18. Robertsen H.L. et al. Filling the Gaps in the Kirromycin Biosynthesis: Deciphering the Role of Genes Involved in Ethylmalonyl-CoA Supply and Tailoring Reactions. // Sci Rep. 2018. T. 8. №1. C. 3230.
[101]19. Rtickert C. et al. Complete genome sequence of the kirromycin producer Streptomyces collinus Tti 365 consisting of a linear chromosome and two linear plasmids. // J Biotechnol. 2013. T. 168. №4. C. 739-740.
[102]20. Santen J.A. van et al. The Natural Products Atlas: An Open Access Knowledge Base for Microbial Natural Products Discovery. // ACS Cent Sci. 2019. T. 5. №11. C. 1824-1833.
[103]21. Santen J. A. van et al. The Natural Products Atlas 2.0: a database of microbially-derived natural products. // Nucleic Acids Res. 2022. T. 50. №D1. C. D1317-D1323.
[104]22. Schmid В., Anke Т., Wolf H. Action of pulvomycin and kirromycin on eukaryotic cells. // FEBS Lett. 1978. T. 96. №1. C. 189 191.
[105]23. Shirling E.В., Gottlieb D. Methods for characterization of Streptomyces species // International Journal of Systematic Bacteriology. 1966. T. 16. №3. C. 313-340.
[106]24. Tavecchia P. et al. Synthesis and biological evaluation of new fragments from kirromycin antibiotic. // J Antibiot (Tokyo). 1996. T. 49. №12. C. 1249-1257.
[107]25. Thein-Schranner I. et al. Metabolic products of microorganisms. 209 Kirrothricin, anew member of the kirromycin-group.// J Antibiot (Tokyo). 1982. T. 35. №8. C. 948-956.
[108]26. Vogeley L. et al. Conformational change of elongation factor Tu (EF-Tu) induced by antibiotic binding. Crystal structure of the complex between EF-Tu.GDP and aurodox. // J Biol Chem. 2001. T. 276. №20. C. 17149-17155.
[109]27. Vos C., Verwiel P.E. J. Structure of the new antibiotic mocimycin (myc 8003): chromophore and furopyranone fragment // Tetrahedron Letters. 1973. T. 14. №30. C. 2823-2826.
[110]28. Vost C., Verwiel P. E. J. The total structure of the novel antibiotic mocimycin (MYC 8003)//Tetrahedron Letters. 1973. T. 14. C. 5173-5176.
[111]29. Wang M. et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. // Nat Biotechnol. 2016. T. 34. №8. C. 828-837.
[112]30. Wax R. et al. Efrotomycin, a new antibiotic from Streptomyces lactamdurans. // J Antibiot (Tokyo). 1976. T. 29. №6. C. 670-673.
[113]31. Weber Т. et al. Molecular analysis of the kirromycin biosynthetic gene cluster revealed beta-alanine as precursor of the pyridone moiety. // Chem Biol. 2008. T. 15. №2. C. 175-188.
[114]32. Wolf H., Chinali G, Parmeggiani A. Kirromycin, an inhibitor of protein biosynthesis that acts on elongation factor Tu. // Proc Natl Acad Sci USA. 1974. T. 71. №12. C. 4910-4914.
[115]33. Wolf H., Zahner H. [Metabolic products of microorganisms. 99. Kirromycin]. // Arch Mikrobiol. 1972. T. 83. №2. C. 147-154.
[116]34. Zimmerman S.B. et al. Heneicomycin, anew antibiotic (A21A): fermentation, isolation, and antibacterial spectrum. // J Antibiot (Tokyo). 1979. T. 32. №6. C. 665-666.
