[1]Изобретение относится к области биотехнологии и фармацевтической промышленности и представляет собой способ получения суммарной рибонуклеиновой кислоты (суммарная РНК) из биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae и может быть использовано в фармацевтике и биотехнологии для производства противоинфекционных и иммуномодулирующих препаратов.
[2]Природные двуспиральные РНК (дсРНК) являются одними из важнейших медиаторов, обеспечивающих индукцию интерферона (IFN) в ответ на вирусную инфекцию в организме, при этом дсРНК вызывают индукцию всех типов интерферона, включая интерферон-дельта, обладают противовирусным действием в отношении различных видов вирусов, стимулируют неспецифическую резистентность, гемопоэз, являются иммуномодуляторами, иммуноадъювантами, антимутагенами. Таким образом, с точки зрения терапевтического потенциала дсРНК являются перспективным объектом для создания на их основе противовирусных, антибактериальных, противовоспалительных и проивоопухолевых препаратов, а также средств для повышения неспецифической защитной реакции и снижения восприимчивости организма к действию патогенных агентов различной природы.
[3]Терапевтическая активность таких препаратов во многом зависит от молекулярно-массового распределения и пространственной конформации нуклеиновых кислот. Наибольшей активностью обладают препараты на основе природных двуспиральных РНК (дсРНК).
[4]Источниками природных РНК, помимо РНК-содержащих вирусов, вызывающих заболевания человека и животных, могут быть вирусы насекомых, растений и микроорганизмов, а также некоторые грибы.
[5]Суммарная дрожжевая РНК является важнейшим биологически активным компонентом, на основе которого возможно дальнейшее получение различных высокополимерных РНК, в том числе индивидуальных РНК (тРНК, рРНК), дсРНК, обладающих противовирусной и интерферон-индуцирующей активностью [1], а также иммуномодулирующим действием [2]. Источниками суммарной дрожжевой РНК являются дрожжи Saccharomyces cerevisiae, в частности, некоторые «киллерные» штаммы [3].
[6]Несмотря на большой интерес к природной суммарной дрожжевой РНК, описанные в уровне техники способы ее получения недостаточно эффективны и требуют совершенствования.
[7]Из уровня техники известен способ получения суммарной РНК из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, охарактеризованный следующими стадиями: суспендирование биомассы дрожжей в буфере при температуре 25°С, добавление хлороформа до концентрации 25%, центрифугирование, добавление к экстракту клеток SDS (додецилсульфата натрия) до конечной концентрации 2,5% при 0°С, центрифугирование и высаливание посредством 3,5 М раствора NaCl. После осуществляют промывку осадка дважды 3,5 М раствором NaCl и растворяют в воде. Далее проводят центрифугирование, фильтрование и осаждение суммарной РНК этиловым спиртом до концентрации 60 %, промывание осадка этиловым спиртом концентрации 60 % и лиофильное высушивание [4].
[8]Недостатком данного способа является небольшой выход активного целевого продукта (суммарной РНК) вследствие использования исключительно химического способа разрушения клеток дрожжей без дополнительной механической обработки суспензии биомассы.
[9]Также известен способ получения высокополимерной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, включающий суспендирование дрожжей в водном растворе олеата натрия при температуре суспензии не ниже 98°C, кипячение суспензии при 98-100°C при периодическом перемешивании, центрифугирование охлажденного до комнатной температуры лизата, доведение объема дрожжевого экстракта до стандарта дистиллированной водой с последующим выделением из него высокополимерной РНК с дальнейшим замораживанием и лиофилизацией [5].
[10]Известен способ получения высокополимерной РНК путем суспендирования отработанных пивных дрожжей в водном растворе олеиновой кислоты, оттитрованной щелочью, с последующим продолжительным кипячением суспензии, отстаиванием горячего лизата при комнатной температуре, осаждением высокополимерной РНК из супернатанта хлористым натрием концентрацией 2-3 М, промывкой осадка раствором 2-3 М хлористого натрия и 92-96 % этанолом путем последовательного ресуспендирования - центрифугирования и выделения конечного продукта из полученного шрота экстракцией водой [6].
[11]Известен способ получения высокополимерной РНК из сухих пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae, включающий суспендирование дрожжей в водном растворе олеиновой кислоты, оттитрованном щелочью, при температуре суспензии не ниже 98°C, кипячение суспензии при периодическом перемешивании, добавление через 10, 20 и 30 мин после суспендирования последней порции дрожжей в кипящую суспензию щелочи, добавление по окончании экстракции в суспензию кипяченой воды, перемешивание, отстаивание суспензии при комнатной температуре с последующим замораживанием и лиофилизацией [7].
[12]Известен способ получения высокополимерной РНК из сухих пекарских дрожжей путем суспендирования их в водном растворе олеиновой кислоты, оттитрованной щелочью, в кипящем растворе литического агента с последующим продолжительным кипячением суспензии, центрифугированием охлажденного лизата, осаждением высокополимерной РНК из супернатанта хлористым натрием до концентрации 2-3 М и промывкой осадка раствором хлористого натрия концентрации 2-3 М и 92-97 %-ым этанолом путем последовательного его ресуспендирования-центрифугирования и выделения конечного продукта из полученного шрота экстракцией водой [8].
[13]Известен способ получения высокополимерной РНК из дрожжей путем суспендирования их водном растворе олеиновой кислоты, оттитрованной щелочью, в кипящем растворе литического агента с последующим продолжительным кипячением суспензии, отстаиванием горячего лизата при комнатной температуре, осаждением высокополимерной РНК из супернатанта хлористым натрием до концентрации 3 М в растворе и промывкой осадка двумя порциями 3 М раствора хлористого натрия и пятью порциями 94 %-ым этанолом путем последовательного его ресуспендирования-центрифугирования и выделения конечного продукта из полученного шрота экстракцией водой [9].
[14]Известен способ получения высокополимерной РНК с помощью додецилсульфата натрия (при температуре не ниже 99°С), освобожденной от примесных ассоциатов РНК с белками и полисахаридами из сухих пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae, охарактеризованный высаливанием РНК хлористым натрием и последующими промывками при низкоскоростном центрифугировании без охлаждения [10].
[15]Недостатками указанных способов являются низкая чистоты и выход активного целевого продукта (суммарной РНК), в том числе, вследствие деформации структуры РНК из-за длительного воздействия «жестких» температурных условий (при использовании в технологии получения РНК таких условий, как прогревание при температуре 68-100°С, может приводить к «расплетанию» цепей дсРНК.).
[16]Известен способ получения суммарной РНК и полисахарида зимозана из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae штамма ВКПМ Y-448, характеризующийся тем, что он включает разрушение клеток дрожжей в буфере, путем обработки додецилсульфатом натрия (SDS) в концентрации 1,0% при 20-30°C и хлороформом в концентрации до 25% при 20-30°C; центрифугирование смеси с последующим отделением надосадочной жидкости; добавление раствора SDS до конечной концентрации 2% до выпадения осадка; центрифугирование; осаждение надосадочной жидкости раствором хлористого лития с концентрацией соли 3,5 М; промывание осадка 3,5 М раствором соли хлористого лития и растворение его в воде; осветление раствора центрифугированием, фильтрование; осаждение суммарной РНК этанолом до концентрации 50-55% в растворе, центрифугирование; промывание 60%-ным этанолом и растворение в изотоническом растворе [11].
[17]Недостатком данного способа является сниженный выход целевого продукта вследствие использования исключительно химического способа разрушения клеток дрожжей без дополнительной механической обработки суспензии биомассы.
[18]Также из уровня техники известен способ получения высокополимерной РНК из суммарной РНК дрожжей путем суспендирования их водном 0,3-1,2 М растворе 2-этилгекрановой кислоты, содержащем 0,1-0,5 М раствор NaCl, с последующим нагреванием суспензии до 92-98°С и выдерживания при установленной температуре, центрифугирования и осаждения суммарной РНК этанолом до его концентрации в целевом растворе 50-55 об. % [12].
[19]Данный способ предполагает использование неприродного высокотоксичного литического агента - 2-этилгексановой кислоты, что требует глубокой очистки конечного продукта, вследствие чего этот способ не экономичен и практически не масштабируем. К тому же, при использовании в технологии получения РНК таких условий, как прогревание при температуре 68-100°С, может приводить к «расплетанию» цепей дсРНК.
[20]Также известен способ получения дсРНК, который предусматривает получение суммарной РНК путем обработки клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448 культуральной жидкостью Arthrobacter luteus ATSS 21606 при температуре 30-40°С. Далее гомогенат прогревают в течение 10 мин при температуре 75°С, после чего охлаждают и осветляют центрифугированием. Полученный экстракт подвергают концентрированию и диафильтрации на ультрафильтрационном разделительном аппарате с пределом отсечения 100 КДа [13].
[21]Недостатком данного способа является сниженный выход и чистота целевого продукта вследствие использования исключительно химического способа разрушения клеток дрожжей без какой-либо дополнительной механической обработки суспензии биомассы. При этом использование в технологии получения РНК таких условий, как прогревание при температуре 68-100°С, может приводить к «расплетанию» цепей РНК, а механические воздействия при диафильтрации приводят к деформации структуры РНК и нестабильности ее при хранении.
[22]Задачей настоящего изобретения является получение суммарной РНК из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae с увеличенным выходом и чистотой целевого продукта.
[23]Техническим результатом настоящего изобретения является увеличение выхода (примерно в 1,3 раза) и чистоты суммарной РНК из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, при этом количество дсРНК в составе суммарной РНК, полученной способом по настоящему изобретению, также существенно возрастает.
[24]Ниже приведены термины, которые используются в описании настоящего изобретения. Если не указано иное, все технические и специальные термины, использованные в описании, имеют общепринятое в данной области техники значение.
[25]Термин «двуспиральная РНК (дсРНК)» в контексте настоящего изобретения характеризует молекулу РНК, состоящую из двух комплементарных цепей.
[26]Термин «высокополимерная РНК» в контексте настоящего изобретения характеризует все возможные отличные от дсРНК виды молекул РНК (например, мРНК, тРНК и др).
[27]Термин «суммарная РНК» в контексте настоящего изобретения характеризует общее количество всей получаемой РНК из клеток киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которое может включать, в том числе, не ограничиваясь указанным, как двуспиральную РНК, так и высокополимерную РНК.
[28]Термин «биомасса» в контексте настоящего изобретения относится к совокупной массе клеток киллерного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae, отделенных в процессе центрифугирования от супернатанта культуральной жидкости, полученной в результате культивирования, в том числе, в качалочных колбах или биореакторах (например, при культивировании батарейным способом).
[29]Термин «ферментный препарат» в контексте настоящего изобретения относится к препарату, полученному, например, не ограничиваясь указанным, из культуральной жидкости бактерий Arthrobacter luteus B-2350 путем высаливания. В состав препарата входит фермент зимолиаза. Литическая активность ферментного препарата составляет не менее 500 ед/мл.
[30]Термин «одноатомный спирт» относится к спиртам, в составе молекулы которых содержится одна гидроксильная группа (например, метанол, этанол, пропанол и т.п.).
[31]Термин «об. %» в контексте настоящего изобретения означает объёмную концентрацию (долю) некоторого жидкого вещества в растворителе (т.е. соотношение объема растворенного вещества к объему раствора, выраженное в процентах (об. %)).
[32]Термин «единица активности» (ед. акт.), в контексте настоящего изобретения применяется к характеристике активности ферментного препарата. Одна единица литической активности определяется как количество, например, зимолиазы, которое полностью лизирует 3 мг (в пересчете на сухую массу) дрожжей.
[33]В контексте настоящего изобретения термин «пн» означает количество комплементарных пар нуклеотидов.
[34]Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, который характеризуется тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и ферментным препаратом при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением, центрифугируют и отделяют супернатант, к которому добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают и инкубируют, затем центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
[35]Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, который характеризуется тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и ферментным препаратом при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением, центрифугируют и отделяют супернатант, к которому добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают и инкубируют, затем центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
[36]Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается путем реализации способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и ферментным препаратом зимолиазы, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия до достижения его концентрации 1,5-2,5 М в целевом растворе, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
[37]Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается путем реализации способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и ферментным препаратом зимолиазы, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия до достижения его концентрации 1,5-2,5 М в целевом растворе, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
[38]Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и ферментным препаратом зимолиазы, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия до достижения его концентрации 1,5-2,5 М в целевом растворе, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
[39]Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и ферментным препаратом, содержащим зимолиазу, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
[40]Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором, 1 % раствором SDS (додецилсульфат натрия) и ферментным препаратом, содержащим зимолиазу, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
[41]Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором, 1 % водным раствором SDS (додецилсульфат натрия) и ферментным препаратом, содержащим зимолиазу, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
[42]Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором, содержащим 1 об. % SDS (додецилсульфат натрия), и ферментным препаратом, содержащим зимолиазу, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
[43]Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и ферментным препаратом, представляющим собой зимолиазу, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
[44]Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и зимолиазой, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
[45]Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и ферментным препаратом зимолиазы, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
[46]Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором, 1 % SDS и ферментным препаратом зимолиазы, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
[47]Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором, 1 % раствором SDS и ферментным препаратом зимолиазы, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
[48]Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором, 1 % водным раствором SDS и ферментным препаратом зимолиазы, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
[49]Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором, содержащим SDS, и ферментным препаратом зимолиазы, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
[50]Поставленная задача решается, а заявленный технический результат достигается за счет способа получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, характеризующегося тем, что биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором, содержащим 1 об. % SDS, и ферментным препаратом зимолиазы, при температуре 28-35°С до получения однородной суспензии с последующим охлаждением, далее полученную суспензию механически гомогенизируют под давлением 600-1400 бар, центрифугируют, в полученный гомогенат добавляют хлорид натрия, инкубируют и центрифугируют, к полученному супернатанту добавляют одноатомный спирт до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают, инкубируют и центрифугируют для отделения осадка суммарной РНК.
[51]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей штамма Saccharomyces cerevisiae, выбранного из группы, включающей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-872 и Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-1047.
[52]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором используют дрожжи киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448.
[53]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором в массовом соотношении от 1:4-1:10.
[54]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, в котором биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором в массовом соотношении от 1:4-1:10.
[55]Более предпочтительно биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором в массовом соотношении от 1:4.
[56]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором следующего состава: натрий сернокислый; ЭДТА; калий фосфорнокислый однозамещенный; калия хлорид; SDS.
[57]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, в котором биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором следующего состава: натрий сернокислый; ЭДТА; калий фосфорнокислый однозамещенный; калия хлорид; SDS.
[58]Более предпочтительно буферный раствор имеет следующий состав: натрий сернокислый - 100-150 мМ; ЭДТА - 5-10 мМ; калий фосфорнокислый однозамещенный - 20-80 мМ; калия хлорид - 250-600 мМ; SDS - 3-8 мМ.
[59]Более предпочтительно буферный раствор имеет следующий состав: натрий сернокислый - 100 мМ; ЭДТА - 5 мМ; калий фосфорнокислый однозамещенный - 40 мМ; калия хлорид - 350 мМ; SDS - 5 мМ.
[60]Одним из вариантов исполнения настоящего изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и 1%-ым раствором SDS.
[61]Одним из вариантов исполнения настоящего изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, в котором биомассу дрожжей инкубируют с буферным раствором и 1%-ым раствором SDS.
[62]Более предпочтительно буферный раствор с 1% раствором SDS используют в соотношении буферный раствор к 1 % раствору SDS 1,0 : 0,004 - 1,0 : 0,01 по объему.
[63]Более предпочтительно в настоящем изобретении используется 1 % водный раствор SDS.
[64]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором процесс гомогенизации проводят под давлением 600-1400 бар.
[65]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, в котором процесс гомогенизации проводят под давлением 600-1400 бар.
[66]Более предпочтительно процесс гомогенизации проводят под давлением 1400 бар.
[67]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором ферментный препарат получают из культуральной жидкости бактерий Arthrobacter luteus B-2350 методом высаливания.
[68]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, в котором ферментный препарат получают из культуральной жидкости бактерий Arthrobacter luteus B-2350 методом высаливания.
[69]Более предпочтительно ферментный препарат содержит зимолиазу.
[70]Более предпочтительно ферментный препарат представляет собой зимолиазу.
[71]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором ферментный препарат получают из культуральной жидкости бактерий Nocardiopsis sp.
[72]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором одноатомный спирт представляет собой метанол, этанол, изопропиловый спирт, пропанол или бутанол.
[73]Более предпочтительно одноатомный спирт представляет собой этанол.
[74]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором одноатомный спирт добавляют до его концентрации 40-60 % в целевом растворе.
[75]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором одноатомный спирт добавляют до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе.
[76]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором одноатомный спирт добавляют до его концентрации 45 об. % в целевом растворе.
[77]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором одноатомный спирт добавляют до его концентрации 45 % в целевом растворе.
[78]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, в котором одноатомный спирт добавляют до его концентрации 45 % в целевом растворе.
[79]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором хлорид натрия добавляют до достижения его концентрации 1,5-2,5 М в целевом растворе.
[80]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, в котором хлорид натрия добавляют до достижения его концентрации 1,5-2,5 М в целевом растворе.
[81]Более предпочтительно хлорид натрия добавляют до достижения его концентрации 2,5 М в целевом растворе.
[82]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae, в котором полученную суммарную РНК лиофильно высушивают.
[83]Одним из вариантов исполнения изобретения является способ получения суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y448, в котором полученную суммарную РНК лиофильно высушивают.
[84]Краткое описание чертежей.
[85]Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано посредством Фиг. 1, Фиг. 2 и Фиг. 3.
[86]На Фиг.1 изображена электрофореграмма образцов суммарной РНК, полученных путем реализации способа 1, способа 2 и способа 3:
[87]М - маркер молекулярной массы (маркер молекулярного веса ДНК, содержащий 13 фрагментов от 250 до 10000 п.н. (фрагменты: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 п.н.);
[88]37, 40 - образцы, полученные способом 1;
[89]38, 42 - образцы, полученные способом 2;
[90]39, 41 - образцы, полученные способом 3.
[91]На Фиг. 2 изображена электрофореграмма образцов суммарной РНК, полученных путем реализации способов 4 - 8:
[92]М - маркер молекулярной массы (маркер молекулярного веса ДНК, содержащий 13 фрагментов от 250 до 10000 п.н. (фрагменты: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 п.н.);
[93]1/1 - образец, полученный способом 8;
[94]2/1 - образец, полученный способом 7;
[95]3/1 - образец, полученный способом 5;
[96]4/1 - образец, полученный способом 6;
[97]5/1 - образец, полученный способом 4.
[98]На Фиг. 3 изображена электрофореграмма образца суммарной РНК, полученной способом 4, с отбором проб на разных промежутках времени инкубирования клеток дрожжей при 100 °С:
[99]М - маркер молекулярной массы (маркер молекулярного веса ДНК, содержащий 13 фрагментов от 250 до 10000 п.н. (фрагменты: 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 п.н.);
[100]6.1. - через 5 минут;
[101]7.1. - через 20 минут;
[102]8.1. - через 40 минут;
[103]9.1. - через 60 минут;
[104]10.1. - через 80 минут;
[105]11.1. -через 100 минут.
[106]Подробное описание изобретения. Раскрытие сущности изобретения.
[107]Предложенный в рамках настоящего изобретения способ экстракции суммарной РНК из биомассы клеток дрожжей киллерного штамма Saccharomyces cerevisiae по одному из вариантов исполнения настоящего изобретения предусматривает следующие этапы.
[108]Биомассу киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae, в частном случае исполнения киллерного штамма ВКПМ Y448 или ВКПМ Y-872, илиY-1047, перемешивают с буферным раствором (рН = 7,00±0,05, состав: натрий сернокислый - 100 мМ; ЭДТА - 5 мМ; калий фосфорнокислый однозамещенный - 40 мМ; калия хлорид - 350 мМ; SDS - 5 мМ) в соотношении 1:4-1:10 по массе до гомогенного состояния. При постоянном перемешивании полученную суспензию нагревают до 28-35°С, вносят ферментный препарат зимолиазы, (из расчета 6000-20000 ед. акт на 1 кг. биомассы) и при необходимости 1% раствор SDS (соотношение указанного буферного раствора к SDS составляет 1,0 : 0,004 - 1,0 : 0,01 по объему), и оставляют инкубироваться при температуре 28-35°С в течение 60-180 минут. По окончании инкубации суспензию охлаждают до 18-7°С и механически гомогенизируют (под давлением 600-1400 бар). К полученному гомогенату добавляют отвешенный на весах хлорид натрия до концентрации 1,5-2,5 М в целевом растворе. Смесь перемешивают в течение 15-30 мин. при температуре 23-27°С до полного растворения соли в суспензии.
[109]Затем полученную суспензию охлаждают до 15-19°С и инкубируют при установленной температуре в течение 30,0-60,0 мин. Далее при необходимости проводят этап осветления полученной дрожжевой суспензии. Для этого полученный на предыдущей стадии гомогенат дрожжевой биомассы центрифугируют при оборотах 15000 об/мин. осадок растворяют в воде, в частности, в воде очищенной или воде для инъекций, до гомогенного состояния. В полученный супернатант добавляют одноатомный спирт с концентрацией 96 % до его концентрации 40-60 об. % в целевом растворе, полученную смесь перемешивают 4-6 ч и инкубируют при 0-8°С не менее 12 часов. Полученную после отстаивания суспензию центрифугируют при 15000 об/мин для отделения осадка суммарной РНК. Спиртовой супернатант, полученный в ходе центрифугирования, сливают.
[111]1. Isaque João da Silva de Faria, Roenick Proveti Olmo, Emanuele Guimarães Silva, and João Trindade Marques.Journal of Interferon & Cytokine Research.May 2013.239-253.http://doi.org/10.1089/jir.2013.0026.
[112]2. Yoneyama, Mitsutoshi and Takashi Fujita. “Recognition of viral nucleic acids in innate immunity.” Reviews in Medical Virology 20 (2010): n. pag.
[113]3. Даниленко, Е. Д., Белкина, А. О., Сысоева, Г. М. (2019). Создание лекарственных препаратов на основе высокополимерных двуспиральных РНК для противовирусной и противоопухолевой терапии. Биомедицинская химия, 65(4), 282.
[114]4. Шевченко З.А., Телегина Ю.В., & Лебедев Л.Р. (2017). Способ получения препаратов на основе рнк. Актуальные проблемы гуманитарных и естественных наук, (8-2), 9-13.
[115]5. Патент РФ № 2522900.
[116]6. Патент РФ № 2435862.
[117]7. Патент РФ № 2510854.
[118]8. Патент РФ № 2403288.
[119]9. Патент РФ № 2392329.
[120]10. Патент РФ № 2430969.
[121]11. Патент РФ № 2722731.
[122]12. Патент SU № 936701.
[123]13. Патент РФ № 2302464.
[124]Далее приводятся примеры осуществления изобретения, которые иллюстрируют изобретение, но не охватывают все возможные варианты его осуществления и не ограничивают изобретение.
[125]Специалисту в данной области очевидно, что возможны и другие частные варианты осуществления изобретения.
[126]Пример 1. Получение суммарной РНК из биомассы дрожжей.
[127]Биомассу киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae штамм ВКПМ Y-448 (в частном случае реализации настоящего изобретения суммарную РНК получали, используя биомассу дрожжей, в том числе, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-872 или Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-1047) смешивали с буферным раствором (рН = 7,00±0,05, состав: натрий сернокислый - 100 мМ; ЭДТА - 5 мМ; калий фосфорнокислый однозамещенный - 40 мМ; калия хлорид - 350 мМ; SDS - 5 мМ) в соотношении биомасса дрожжей : буферный раствор - 1:4 по массе. Полученную суспензию перемешивали 100±10 об/мин до гомогенного состояния в течение 30 мин, затем нагревали до температуры 30±1°С и вносили ферментный препарат зимолиазы, полученный, например, из культуральной жидкости бактерий Arthrobacter luteus B-2350, из расчета 6000 ед. акт. на 1 кг биомассы. От полученной суспензии отбирали пробу на определение титра на начало инкубации. Суспензию тщательно перемешивали и оставляли инкубироваться при температуре 30±1°С в течение 1 часа. После 1 ч инкубации отбирали пробу на определение титра и для расчета степени разрушения клеток дрожжей, по окончании инкубации суспензию охлаждали до 18±1°С и дезинтегрировали при давлении от 600 до 1400 бар (в частном случае исполнения при 1400 бар).
[128]К полученному гомогенату загружали сухой хлорид натрия до его концентрации 1,5-2,5 М (в частном случае исполнения до 2,5 М) в целевом растворе. Смесь перемешивали в течение 15 мин при температуре 25±1°С до полного растворения соли в суспензии. Затем полученную суспензию охлаждали до 18±1°С и инкубировали при установленной температуре в течение 30 мин, затем центрифугировали при оборотах 15000 об/мин. Осадок утилизировали, а к полученному супернатанту добавляли спирт этиловый 96 % (или другой одноатомный спирт, например, не ограничиваясь указанным, метанол, пропанол, изопропанол, бутанол или изобутанол) до концентрации его в целевом растворе от 40 до 60 об. % и тщательно перемешивали в течение 4,0 ч. Затем полученный раствор охлаждали до 4±1°С и отстаивали при установленной температуре в течение 12 часов. Полученную после отстаивания суспензию центрифугировали при 15000 об/мин. Полученный осадок суммарной РНК лиофильно высушивали.
[129]Идентификацию суммарной РНК проводили методами электрофореза в агарозном геле и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
[130]Пример 2. Изучение влияния различных условий в способах получения суммарной РНК из клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae на выход суммарной РНК.
[131]Для изучения влияния различных условий в способах получения суммарной РНК из биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, полученной после центрифугирования культуральной жидкости, на выход суммарной РНК авторы изобретения проделали ряд экспериментов по получению суммарной РНК различными способами. Результаты исследований представлены в таблице 1.
[132]В способах получения суммарной РНК из дрожжей Saccharomyces cerevisiae согласно таблице 1 анализировали различные способы разрушения клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae и процессы осаждения суммарной РНК.
[133]Для проведения каждого из экспериментов, описанных в таблице 1, использовали по 3 кг биомассы киллерных дрожжей Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448, полученных с одного процесса ферментации. Каждый эксперимент проводили 3 раза. Все целевые продукты, полученные по завершении экспериментов, лиофилизировали при одинаковых условиях. Аналогичные исследования проводили, используя биомассу других штаммов дрожжей, в частности, Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-872 и Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-1047. Статистически значимых различий в количестве выхода суммарной РНК по сравнению с результатами, приведенными в таблице 1, не наблюдалось.
[134]Количественное содержание нуклеиновых кислот в лиофилизатах оценивали спектрофотометрическим методом (по методу Спирина) в пересчете на безводный и свободный от остаточных органических растворителей лиофилизат. Выход суммарной РНК оценивали по содержанию нуклеиновых кислот в лиофилизате за вычетом содержания ДНК (в пересчете на безводный и свободный от остаточных органических растворителей лиофилизат).
[135]Для определения количественного содержания ДНК в лиофилизате (в пересчете на безводный и свободный от остаточных органических растворителей лиофилизат) использовали метод Дише. Для определения количественного содержания примесного белка в лиофилизате (в пересчете на безводный и свободный от остаточных органических растворителей лиофилизат) использовали метод Лоури. Молекулярно-массовое распределение оценивали с помощью электрофоретического разделения в 1% агарозном геле, предварительно проведя пробоподготовку образцов перед нанесением на гель методом фенол-хлороформной экстракции.
[136]Таблица 1.
Сравнение выхода суммарной РНК, полученной различными способами. |
| № эксперимента | Условия разрушения клеток дрожжей
Saccharomyces cerevisiae | Условия осаждения суммарной РНК | Способ разрушения клеток дрожжей | Выход суммарной РНК на 100 г биомассы дрожжей Saccharomyces cerevisiae, мг |
| Способ 1 | Ферментный препарат Arthrobacter luteus ATSS 21606, 36°С с последующим прогреванием при 75°С | Диафильтрация | Ферментативный | 760-900 |
| Способ 2 | SDS до 2% + 25 об. % хлороформ; 25°С | 3,5М NaCl + этанол (или другой одноатомный спирт) до концентрации 60 об. % в целевом растворе | Химический | 300-400 |
| Способ 3 | SDS до 1,0% + хлороформ до 25 % в растворе; 25-30°С; при очистке + SDS до 2,0 % | 3,5 М раствор LiCl; этанол (или другой одноатомный спирт) до концентрации 50-55 об. % в целевом растворе | Химический | 320-440 |
| Способ 4 | 2,5% SDS, 100°С, больше или равно 40 мин | до 3,0 М раствор NaCl; промывка 3,0 М раствором NaCl | Химический, физический (температура) | 1260 - 1410 (c полной деструкцией дсРНК) |
| Способ 5 | Олеиновая кислота, оттитрованная щелочью + 2,5 М NaOH; 98-102°С | 3,0 М раствор NaCl | Химический, физический | 1104- 1280 (c полной деструкцией дсРНК) |
| Способ 6 | Олеиновая кислота, оттитрованная щелочью + 2,5 М NaOH; 98-102°С | отстаивание | Химический, физический | 1160-1368 (c полной деструкцией дсРНК) |
| Способ 7 | 0,3-1,2 М раствор 2-этилгексановой кислоты + 92-98°С | этанол (или другой одноатомный спирт) до его концентрации в целевом растворе 50-55 об. % | Химический, физический | 1280- 1400 (c полной деструкцией дсРНК) |
Способ 8
(по настоящему изобретению) | ферментный препарат, содержащий зимолиазу (например, полученный из культуральной жидкости бактерий Arthrobacter luteus B-2350) , 28-35°С, механическая гомогенизация (под давлением от 600 до 1400 бар) | раствор NaCl до достижения его концентрации 1,5-2,5 М в целевом растворе; этанол до достижения его концентрации (или другой одноатомный спирт) от 40 до 60 об. % в целевом растворе | Ферментативный, химический +
механическая гомогенизация | 1930- 2240 |
[137]В результате выделения суммарной РНК из клеток киллерных дрожжей штамма Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448, согласно способу по настоящему изобретению (в таблице 1 способ 8), было получено в серии нескольких экспериментов в среднем от 57,9 г до 67,2 г суммарной РНК после всех этапов выделения и очистки первоначальной биомассы дрожжей, которая составляла 3 кг клеток Saccharomyces cerevisiae ВКПМ Y-448, полученных после культивирования, гомогенизации, центрифугирования и отделения супернатанта от осадка клеток. Таким образом, выход суммарной РНК после всех этапов выделения и очистки по настоящему изобретению составил от 1,93 до 2,24 г на 100 г биомассы дрожжей.
[138]Дополнительно проводили идентификацию продукт суммарной РНК, полученной способами, указанными в табл. 1, методом электрофоретического разделения в 1% агарозном геле. Пробоподготовку всех образцов перед нанесением на гель проводили методом фенол-хлороформной экстракции. Результаты исследований представлены на Фиг. 1 и 2.
[139]Как видно на Фиг. 1, на электрофореграмме образцов суммарной РНК, полученных способами 1, 2, 3 детектируются полосы, соответствующие различным формам дсРНК, распределенным по молекулярной массе.
[140]На электрофореграмме образцов суммарной РНК, полученных способами 4, 5, 6, 7 полосы, соответствующие формам дсРНК, распределенные по молекулярной массе, не визуализируются (Фиг. 2).
[141]Для оценки времени, за которое происходит разрушение дсРНК при нагревании суспензии клеток в 2,5% SDS при 100°С дополнительно провели эксперимент (способ 4) с отбором образцов на протяжении времени инкубирования суспензии при 100 °С. Образцы суспензии отбирали в следующих временных интервалах после старта инкубирования при 100 °С: через 5 минут, 20 минут, 40 минут, 60 минут, 80 минут и 100 минут.
[142]На электрофореграмме видно (Фиг.3), что дсРНК в образцах начинают разрушаться уже через 5 минут после инкубирования клеток дрожжей при 100 °С. Через 20 минут после начала инкубирования дсРНК на электрофореграмме уже не визуализируются, а молекулярно-массовое распределение нуклеиновых кислот со временем инкубирования при температуре 100°С возрастает.
[143]Анализ электрофореграмм продуктов суммарных РНК, полученных способами 4-7, показал, что диапазон молекулярно- массового распределения впРНК начинался от десятков пн до примерно 1000 пн. Низкая степень интенсивности окрашивания данных участков электрофореграмм говорит о слабом взаимодействии с интеркалирущим агентом (в нашем случае бромистым этидием). Это обстоятельство указывает на относительно низкое количество комплементарно сдвоенных участков молекул рибонуклеиновых кислот.
[144]На электрофореграммах суммарных РНК, полученных способами 1-3, 8, наблюдаются ярко-выраженные полосы разных форм дсРНК.
[145]Продукт суммарной РНК, полученный способом 1, содержал достаточно большое количество примесей, в том числе примесных белков (~ 20%), рибонуклеиновые кислоты (~ 57%), в том числе двуспиральную РНК (~ 10 % от содержания всех рибонуклеиновых кислот).
[146]Продукт суммарной РНК, полученный способом 2, содержал, в том числе, примесные белки (~ 18%), рибонуклеиновые кислоты (~ 45%) (из них всего ~ 10 % дсРНК).
[147]Продукт суммарной РНК, полученный способом 3, содержал, в том числе, дсРНК в количестве ~ 20% от содержания всех рибонуклеиновых кислот, примесные белки (~ 18 %).
[148]Суммарная РНК, полученная способами 4, 5, 6, 7 вообще не содержала дсРНК. Поскольку для разрушения клеточных стенок дрожжей в этих способах дополнительно использовали физический метод (повышение температуры смеси до 98 - 100 °С), двуспиральные структуры разрушились и деградировали до впРНК с молекулярно-массовым распределением от 1000 п.н. и ниже.
[149]Продукт суммарной РНК, полученный способом 4, содержал значительные количества примесных белков (~ 22 %), впРНК агрегатов РНК с полисахаридами и белками, а также олигорибонуклеотидов. Доля впРНК в препарате составила не менее 30%.
[150]Продукты суммарной РНК, полученные способами 5 и 6 в результате применения для лизиса клеток дрожжей олеиновой кислоты/олеата натрия отличались содержанием высокого числа примесей (~ 25 % примесных белков), впРНК, агрегатов РНК с полисахаридами и белками, а также олигорибонуклеотидов.
[151]Продукт суммарной РНК, полученный способом 7, аналогично способам 5 и 6 не отличался высокой чистотой и содержал высокое количество примесных белков (~ 30 %) и впРНК вследствие применения в качестве лизирующего агента 2-этилгексановой кислоты и условий высоких температур от 90°C.
[152]Продукт суммарной РНК, полученный способом 8, содержал порядка 65 % рибонуклеиновых кислот, из которых около 40% составляла дсРНК, что значительно больше, чем в методах 1-3, примесных белков фиксировалось до 14 %.
[153]Исходя из вышесказанного, предложенный способ получения суммарной РНК по настоящему изобретению позволяет значительно увеличить выход суммарной РНК в среднем, не менее, чем примерно в 1,3 раза, при этом количество дсРНК в составе суммарной РНК также существенно возрастает.
