[1]Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарии и медицины, в частности к получению потенциальных препаратов для лечения бактериальных инфекций, вызванных стафилококками разных видов, в том числе устойчивых к антибиотикам.
[3]Стафилококкозы являются наиболее распространенными социально значимыми заболеваниями, охватывающими все возрастные слои населения. Высокая распространенность, устойчивость во внешней среде, а также к антибиотикам, способность поражать практически все органы и ткани, хронизация инфекции с образованием биопленок, делают стафилококковые заболевания трудноизлечимыми даже при наличии современного широкого спектра антимикробных препаратов. Исследование стафилолитических ферментов, является одним из этапов на пути создания высокоэффективных медицинских препаратов, которые могут быть с успехом включены как в имеющиеся схемы лечения стафилококкозов, так и использоваться индивидуально, например, в случаях таких серьезных, практически не излечимых заболеваниях как стафилококковый эндокардит, стафилококковое поражение суставов, разнообразные поражения внутренних органов с образованием биопленок.
[4]В 80-90 годах прошлого века уже был известен тот факт, что Staphylococcus hyicus обладает высокой протеолитической активностью, которая была показана в тестах по гидролизу казеина, желатина, а также по лизису клеток Micrococcus luteus. С. 
Characteristic Bacteriolytic Activities of Staphylococcus hyicus. Journal of Clinical Microbiology, July 1989, p. 1682-1683. 
C. Staphylococcus hyicus, the cause of exudative epidermit is of swine. Review. 1990. Berliner und Munchener Tierarztliche Wochenschrift 103(2): 60-63. Было высказано предположение, что антибактериальная активность в отношении микрококков может рассматриваться как видовой признак Staphylococcus hyicus. Однако дальнейшие исследования привели к выводу, что эта характеристика должна рассматриваться только как индивидуальное свойство отдельных штаммов, а не как видовой признак. В. Skalka. Antibacterial effects of Staphylococcus hyicus and Staphylococcus chromogenes. Acta Vet. BRNO, 62, 1993: 39-47.
[5]Из культуральной жидкости Staphylococcus hyicus 3682 был выделен бактериоцин (Hyicin 3682), обладающий широким спектром антибактериального действия в отношении грамположительных микроорганизмов, включающих такие патогены как Bacillus coagulans, Geobacillus stearothermophilus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus.
[6]Известен также штамм Staphylococcus hyicus 4244 - продуцент Hyicin 4244 - пептида с широким спектром действия в отношении грамположительных микроорганизмов. Аналогом предложенной стафилолитической амидазы является стафилолитическая амидаза из Staphylococcus sciuri DD 4747 содержащая в своей структуре домен CHAP (цистеин-гистидин зависимая амидогидролаза / пептидаза). Plasmid-specified Fern АВХ-like immunity factor in Staphylococcus sciuri DD 4747. FEMS Microbiology Letters 249 (2005) 227-231. Домен CHAP имеет длину около 120 аминокислот:
[7]MGSNIQGENILNIKKIATYTVLSTLVLTGFTNIDTGVKNFTQHEAKAAAIDKYPRPIKTAQPNYH WKNNCTWWHNKJWQTKRYLPSSFTHAKNWLSEAKKAGFKTGKTPLAGAILQTSKGGGGLGH VAFVEKVNANGSIKISEYNYNVSLGYGTRTLTKAQAATYNYIY, и обладает уникальным свойством участвовать в двух разных каталитических реакциях в ходе гидролиза клеточной стенки (Bateman and Rawlings, 2003; Rigden и др., 2003). Пептидазная активность заключается в расщеплении связи между D-аланином и первым глицином пентаглицинового мостика. Амидазная же активность проявляется в расщеплении химической связи между MurNAc и L-аланином на N-конце стволового пептида (Bateman and Rawlings, 2003; Rigden et al., 2003). Некоторые CHAP-белки, имеют только пептидазу активность (например, фаговый фермент LysK), только амидазная активность (например, Ski) или обе (например, LytN) (Llull et al., 2006; Becker et al., 2009; Frankel and Schneewind, 2012). В фаговых белках домен CHAP в основном расположен в N-концевой области, тогда как в бактериальных белках он расположен на С-конце (Zou and Hou, 2010).
[8]Ниже представлена таблица данных литической активности CHAP домена на различные виды стафилококков из работы М. Benesik, J. Novacek, et al. Virus Genes (2018) 54:130-139.
[9]
[10]Техническим результатом изобретения является получение штамма Staphylococcus hyicus В-8870, секретирующего фермент со стафилолитической активностью, и выделение стафилолитической амидазы с более широким спектром действия в отношении микроорганизмов рода Staphylococcus, позволяющей расширить ряд стафилолитических ферментов.
[11]Технический результат достигается тем, что предложен Штамм Staphylococcus hyicus В-8870 - продуцент стафилолитической амидазы и стафилолитическая амидаза, имеющая аминокислотную последовательность:
[12]
молекулярную массу 14000,75 Да, расчетное значение изоэлектрической точки pI=10.35, температурный оптимум ферментативной реакции в пределах 40°C, рН-оптимум фермента в пределах 7,7.
[13]В аминокислотной последовательности белка из Staphylococcus hyicus В-8870 жирным шрифтом отмечены аминокислотные остатки, не соответствующие участку замены последовательности Staphylococcus sciuri DD 4747.
[14]Штамм-продуцент стафилолитической амидазы Staphylococcus hyicus депонирован в государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» под номером В-8870.
[15]В ходе исследований нами выделен из культуральной жидкости штамма Staphylococcus hyicus В-8870 стафилолитический фермент, охарактеризованный как энзим содержащий домен CHAP (цистеин-гистидин зависимая амидогидролаза / пептидаза), далее обозначенный нами как, CHAPh фермент.
[16]Штамм Staphylococcus hyicus был выделен при высеве патологического материала из подглазничного синуса здорового бройлера на плотную питательную среду.
[17]Биохимические показатели, определенные методом «STAPHYtest» выявили принадлежность изолята к виду Staphylococcus hyicus. Биохимические показатели имеют отличия от стандартных лишь по показателям расщепления лактозы, галактозы и утилизации нитрата, который свойственен для 70-80% штаммов, но отсутствует у данного микроорганизма (таблица 2).
[18]
[19]Методом масс-спектрометрического анализа MALDI TOF подтверждена принадлежность изолята к виду Staphylococcus hyicus.
[20]Выделенный микроорганизм Staphylococcus hyicus В-8870 растет на стандартных жидких и плотных питательных средах при 37°C и не требует для роста специфических добавок и компонентов среды. На плотной среде образует белые блестящие гладкие колонии, а на жидкой питательной среде растет с равномерным помутнением среды. Отличительным свойством штамма является угнетение роста других видов стафилококков при совместном культивировании на плотной питательной среде.
[21]Чувствительность штамма Staphylococcus hyicus В-8870 к антимикробным препаратам определяли с использованием диск-диффузионного метода в соответствие с рекомендациями Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2013). Использовались диски (OXOID, Великобритания; HiMedia, Индия) - амоксиклав (10 μg), тилмикозин (15 μg), энрофлоксацин (5 μg), ампициллин (10 μg), доксициклин (30 μg), ципрофлоксацин (5 μg), флорфеникол (30 μg), цефтиофур (30 μg), гентамицин (10 μg), ко-тримоксазол (25 μg), и линкомицин (25 мкг). Условия культивирования - 37°C в течение 24 часов. Зоны задержки роста определяли с помощью автоматического штангельциркуля.
[22]Штамм Staphylococcus hyicus В-8870 устойчив к действию таких антибиотиков как: эритромицин, линкомицин, энрофлоксацин.
[23]Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:
[24]Фиг. 1. Хроматограмма очистки стафилолитической амидазы из Staphylococcus hyicus В-8870 катионообменной хроматографией. I - промывка колонки от балластных веществ буферным раствором, содержащим 250 мМ NaCl. II - элюция целевого вещества буферным раствором, содержащим 500 мМ NaCl.
[25]Фиг. 2. Электрофорез в 15% полиакриламидном геле с использованием маркерных белков Thermo Scientific «PageRuler» PI26619. 1 - маркерные белки. 2 - очищенная катионообменной хроматографией стафилолитическая амидаза из Staphylococcus hyicus В-8870.
[26]Фиг. 3. Температурная зависимость активности стафилолитической амидазы из Staphylococcus hyicus В-8870.
[27]Фиг. 4. Зависимость ферментативной активности фермента из Staphylococcus hyicus В-8870 от рН буферного раствора.
[28]Фиг. 5. Начальная скорость лизиса стафилококковых клеток стафилолитической амидазой из Staphylococcus hyicus В-8870.
[29]Пример 1. Культивирование штамма продуцента Staphylococcus hyicus В-8870. Штамм продуцент выращивают на плотной питательной среде LB ночь при 37°C. Микробиологической петлей производят посев материала с плотной питательной среды в качалочную колбу объемом 250 см3 с жидкой питательной средой LB. Культивируют на качалке 16-18 ч при 37°C при перемешивании 200 об/мин до оптической плотности ОП580 ~7. Посевной материал засевают в 4 качалочные колбы объемом 250 см3 по 50 см3. Культивируют в том же режиме, что и посевной материал. Культуральную жидкость центрифугируют при 8000 об/мин 15 мин (ротор "Backman" 14). Супернатант используют для выделения и очистки стафилолитической амидазы.
[30]В ходе культивирования штамма, на жидкой питательной среде LB установлено, что микроорганизм секретирует белок, обладающий бактериолитической активностью в отношении тестового штамма Staphylococcus aureus FDA 209Р, которая составила 4,5 ед/мл. За одну литическую единицу активности принимали уменьшение оптической плотности суспензии живых клеток тестового штамма Staphylococcus aureus FDA 209Р в 2 раза за 10 минут с учетом значения спонтанного лизиса контрольной суспензии клеток, при исходной оптической плотности ~0,3, в 50 мМ трис-буфере рН 7,4 + 100 мМ NaCl, при температуре 37°C.
[31]Пример 2. Очистка стафилолитической амидазы из культуральной жидкости Staphylococcus hyicus В-8870.
[32]Хроматографическую очистку проводят на колонке с КМ-сефарозой объемом 100 см3 уравновешенную буферным раствором (5 мМ трис-HCl, рН 7,8). Промывку проводят тем же буферным раствором, содержащим 250 мМ NaCl. Элюируют фермент все в том же буфере с 500 мМ NaCl (Фиг. 2). Фракцию, содержащую стафилолитическую амидазу, оценивают с помощью электрофореза в 15% полиакриламидном геле с использованием маркерных белков Thermo Scientific «PageRuler» PI26619, а также определяют удельную активность. Далее, раствор фермента замораживают для хранения при -18°C.
[33]При проведении очистки стафилолитической амидазы с помощью изократической катионообменной хроматографии на колонке с носителем CM-Sepharose Fast Flow "Pharmacia" выделен электрофоретически чистый белок с молекулярной массой ~14 кДа по данным электрофореза в ПААГ (Фиг. 3). Нанесение белка и промывку проводили в 50 мМ трис-буфере +100 мМ NaCl. Примесные вещества удаляли промывкой 50 мМ трис-буфером рН 7,8+250 мМ NaCl. Элюировали продукт в том же буфере с 500 мМ NaCl. Удельная активность фермента составила 1370 ед/мг.
[34]Первичная структура стафилолитической амидазы, определена хроматомасспектрометрическим анализом.
[35]При оценке последовательности в базе данных NCBI показано 98% сходство участка аминокислотной последовательности данного фермента с аминокислотной последовательностью фермента из Staphylococcus hyicus В-8870. Анализ показал ~90% сходство с участком последовательности стафилолитической амидазы из Staphylococcus sciuri (Фиг. 4). Белок из Staphylococcus hyicus В-8870 состоит из 123 аминокислотных остатков, 12 из которых не соответствуют участку первичной последовательности белка из Staphylococcus sciuri DD 4747, что составляет 9,8%.
[36]На основании первичной структуры стафилолитической амидазы вычислен коэффициент поглощения белка (1 мг/мл) при 280 нм, который составил 
. Расчет проводили по формуле: (5700 nTyr + 1300 nTrp)/М, где М - молекулярная масса.
[37]Расчетное значение изоэлектрической точки pI=10.35.
[38]Уточненное значение молекулярной массы - 14000,75 Да.
[39]Определена температурная зависимость ферментативной активности стафилолитической амидазы. Ее максимальное значение находится в пределах 40°C. Начиная с 50°C активность резко падает и к 60°C практически полностью утрачивается (Фиг. 5).
[40]рН-оптимум стафилолитической амидазы лежит в пределах 7,7.
[41]Определение антистафилококковой активности стафилолитической амидазы из Staphylococcus hyicus В-8870 проводили на суспензии клеток контрольных штаммах и клинических изолятах различных видов стафилококков, с учетом спонтанного лизиса клеток. Фермент проявлял литическую активность во всех случаях, но скорость лизиса существенно различалась в зависимости от вида стафилококков. Результаты литической активности стафилолитической амидазы приведены на гистограмме.
[42]Из рисунка видно, что литическая активность фермента из Staphylococcus hyicus В-8870 проявляется в отношении всех исследованных клинических изолятов и референсных штаммов стафилококков, в отличие от CHAP домена, неактивного в отношении таких видов, как: S. hyicus, S. lugdunensis, S. cohnii, S. gallinarum, S. pasteuri, S. piscifermentans, S. sciuri (Таблица 1), что свидетельствует о более широком спектре литических свойств исследуемого фермента.
[43]Таким образом, из приведенных результатов видно, что впервые выделен и охарактеризован штамм Staphylococcus hyicus В-8870 обладает способностью секретировать в культуральную жидкость антистафилококковую амидазу, обладающий литической активностью в отношении всего исследованного спектра видов микроорганизмов рода Staphylococcus. Данные свойства делают стафилолитическую амидазу перспективным кандидатом для создания рекомбинантного ферментного антистафилококкового препарата как медицинского, так и ветеринарного назначения. Ее небольшая (для ферментов) молекулярная масса предполагает пониженную иммуногенность в ходе возможного парентерального применения.
