[1]Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается композиций на основе растительных экстрактов, предназначенных для предупреждения, облегчения или лечения патологических состояний живых организмов путем воздействия на физиологию паразитирующего микроорганизма. В частности, изобретение касается биологических составов, способных подавлять коллективное поведение («чувство кворума») у патогенных, условно-патогенных и гнилостных бактерий. Изобретение может найти применение при изготовлении лечебных, профилактических, косметических и санитарно-гигиенических средств контроля бактериальных инфекций человека и животных.
[2]Из уровня техники известен ряд растительных композиций с различной лечебно-профилактической направленностью. В частности, известна растительная композиция для профилактики или лечения расстройств метаболизма углеводов и/или жиров [1], для предупреждения или лечения аллергического заболевания [2], в качестве противовоспалительного и иммуностимулирующего средства [3], для предотвращения или лечения нейродегенеративных нарушений [4] и др. При этом основным аргументом для формирования подобных композиций является наличие у каждого из входящих в их состав растительных экстрактов соответствующей биологической активности, а также аддитивный эффект при их совместном использовании.
[3]Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к заявляемому изобретению является композиция на основе фитоэкстрактов, подавляющая «чувство кворума» у бактерий [5]. Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности к композиции, подавляющей «чувство кворума». Композиция, подавляющая «чувство кворума» у бактерий, содержит по меньшей мере два высушенных водных или спиртовых экстракта из коры дуба (Quercus cortex), почек березы (Betulae gemmae), листьев эвкалипта (Eucalyptus folia) при определенном соотношении компонентов.
[4]В качестве альтернативы природным и химически синтезируемым бактерицидам прямого действия в настоящее время все чаще рассматривается подход, заключающийся не в уничтожении, но в изменении физиологии микроорганизма в направлении подавления (снижения) его способности к паразитированию и повреждению биологических субстратов. В частности, сказанное относится к поиску и созданию ингибиторов «чувства кворума» (Quorum sensing, QS) у бактерий, оцениваемых как привлекательная альтернатива традиционным средствам борьбы с инфекциями, особенно, вызываемыми полирезистентными штаммами микроорганизмов. Shukla и Bhathena (2016) сообщают, что экстракты, богатые гидролизуемыми танинами Phyllanthus emblica, Terminalia bellirica, Terminalia chebula, Punica granatum, S. cumini и Mangifera indica (цветок), проявляют анти-QS активность широкого спектра действия, которая влияет на активность ацилгомосеринлактонов (АГЛ) в широком диапазоне субингибирующих концентраций [6].
[5]Обнаружено, что дихлорметановый экстракт из корней коры Cordia gilletii гасит выработку пиоцианина, QS-зависимого фактора вирулентности P. aeruginosa и специфически ингибирует экспрессию нескольких QS-регулируемых генов [7].
[6]В этой связи задачей данного изобретения является разработка композиции из экстрактов лекарственных растений, используемых в традиционной медицине и проявляющих аддитивный эффект при регуляции «чувства кворума» патогенных и гнилостных бактерий.
[7]В настоящем изобретении эта задача решается совместным применением водных экстрактов или полученных подобным образом и в последующем высушенных извлечений из коры дуба (Quercus cortex), листьев березы (Folia Betulae) и травы зверобоя (Hyperici herba). В соответствии с изобретением регуляторный препарат (композиция) на их основе содержит от 50,0 мас. % каждого из экстрактов, а само подобное соотношение и форма его применения (в виде жидкостей, порошков, аппликаций и т.д.) определяются исходя из особенностей локализации инфекционного процесса и индивидуальных особенностей пациента (организма). В частности, экстракт коры дуба включается в композиции, предназначенные для лечения и профилактики кишечных, раневых инфекций, инфекций полости рта, а также воспалительных заболеваний кожи и женских половых органов. В свою очередь противопоказанием к включению коры дуба в состав композиции является гиперчувствительность к данному препарату.
[8]Экстракт березовых листьев включается в состав композиций, предназначенных для лечения инфекционно-воспалительных заболеваний мочеполовой и пищеварительной систем, ЛОР-органов, раневых инфекций, а также воспалительных процессов кожи. Противопоказаниями к использованию данного экстракта являются период беременности и патология мочевыделительной системы (почечная недостаточность и острые заболеваниями мочевыводящих путей).
[9]Экстракт травы зверобоя включается в состав композиций, предназначенных для лечения инфекционных заболеваний полости рта, кишечных инфекций. Противопоказаниями к использованию данного экстракта являются гиперчувствительность к данному препарату.
[10]Используемые экстракты готовили на основе сухого растительного сырья, осуществляя из него водные извлечения, после чего при необходимости производили дополнительное высушивание полученных извлечений.
[11]При приготовлении водных извлечений из грубых частей растений (в частности, коры дуба) 6 грамм измельченного растительного сырья, предварительно стерилизованного в автоклаве при 1 атмосфере в течение 30 минут, заливали стерильной дистиллированной водой в объеме 50 мл. На следующем этапе производилось кипячение на водяной бане в течение 30 минут, охлаждение - 10 минут, после чего полученный отвар процеживали через стерильный ватно-марлевый фильтр в стеклянную посуду.
[12]При приготовлении водных извлечений из мягких частей растений (березовых листьев и травы зверобоя) использовали аналогичную последовательность действий за исключением того, что кипячение на водяной бане осуществляли 15 минут, а настаивание - в течение 45 минут.
[13]При необходимости полученные вытяжки выпаривались на водяной бане до получения более густой консистенции, после чего подвергались полному высушиванию до получения порошка.
[14]Композиции получали путем смешивания водных извлечений в соотношении по 50,0 мас. % при смешивании двух экстрактов. По сравнению с упомянутого выше технического решения [5] заявляемое изобретение имеет ряд существенных отличий, отвечающих требованию новизны.
[15]1) В отличие от композиции фитоэкстрактов в патенте RU 2542464 заявляемая композиция оказывает регуляторное воздействие на физиологию паразитирующего микроорганизма в направлении подавления «чувства кворума» патогенных и гнилостных бактерий в форме двухкомпонентной смеси и без спиртовой основы, что экономически более целесообразно.
[16]Экспериментальным обоснованием использования названных экстрактов являются данные о воздействии водных вытяжек на рост и проявление «чувства кворума» у индикаторного штамма Chromobacterium violaceum АТСС 31532.
[17]Адекватность использования данного микроорганизма для заявленных целей определяется наличием у него системы QS, которая состоит из гена CviI (функциональный аналог гена luxI), кодирующего синтазу автоиндуктора N-гексаноил-L-ацилгомосеринлактона (С6-АГЛ); а также гена CviR (аналог гена luxR), кодирующего рецепторный регуляторный белок. С.violaceum АТСС 31532 представляет собой дикий штамм с полноценной системой CviI/CviR, контролирующей образование доступного для визуальной и аппаратной регистрации сине-фиолетового пигмента виолацеина с максимумом поглощения при 570-600 нм.
[18]При проведении экспериментальной серии исследования в жидкой питательной среде готовили двукратные разведения сухих экстрактов коры дуба, листьев березы и травы зверобоя. В каждое исследование включали дополнительные пробы LB-бульона, не содержащие названных компонентов и используемые в качестве положительного (рост тест-штамма) и отрицательного (стерильного) контролей. Оценку результатов эксперимента проводили с использованием многофункционального микропланшетного ридера «Infinite 200 Pro» («Tecan», Австрия), после чего оценка и архивирование полученных данных проводилась с использованием штатного программного обеспечения magellanTM Software V7.2. Оптическую плотность бактериальной биомассы измеряли при 450±5 нм, а количественное присутствие пигмента виолацеина при 600±5 нм, после его предварительной этанольной экстракции. Значения поглощения отрицательного контроля вычитали. Антибактериальный эффект выражали значениями МИК100 и МИК50 - минимальными ингибирующими концентрациями, вызывающими 100%-ое и 50%-ое подавление роста тест-штамма относительно положительного контроля. В свою очередь интенсивность подавления системы «чувства кворума» выражали величинами ЕС100 и ЕС50, соответствующими аналогичным интенсивностям ингибирования биосинтеза пигмента виолацеина.
[19]На фиг. 1, табл. 1 показаны результаты проведенной серии экспериментов по воздействию коры дуба (фиг. 1 «а»), листьев березы (фиг. 1 «б») и травы зверобоя (фиг. 1 «в») на рост и QS-зависимый биосинтез пигмента виолацеина в культуре С. Violaceum АТСС 31532. Установлено, что водные извлечения из лекарственных растений развивают прямую антибактериальную активность в отношении индикаторного штамма С. violaceum АТСС 31532, характеризуемую значениями МИК100=5, 10 и 10 мг/мл сухого вещества для коры дуба, листьев березы и травы зверобоя соответственно. Одновременно было установлено, что все исследуемые экстракты подавляли QS-зависимый биосинтез пигмента виолацеина, хотя выраженность эффекта была различной. Так, соотношение концентраций действующих соединений (мг/мл), обусловливающих полное подавление роста (МИК100) и пигментообразования (ЕС100) составляло 16 для коры дуба, 4 для листьев березы и 2 для травы зверобоя. Соотношение МИК50/ЕС50, наиболее полно характеризующее диапазон концентраций сухих экстрактов, вызывающих подавление QS-зависимого биосинтеза пигмента виолацеина в отсутствие рост-ингибирующего эффекта, было на уровне 22,2 для коры дуба, 13 для листьев березы и 12 для травы зверобоя.
[20]2) В отличие от патента RU 2542464 способность к подавлению «чувства кворума» у бактерий установлена у экстрактов из широко распространенных в умеренном климатическом поясе восточной Европы луба и березы, а также зверобоя, более распространенного в Евразии растения, в отличие от эвкалипта (Eucalyptus folia), что снимает ресурсные (сырьевые) ограничения при производстве основанных на них композиций.
[21]Из доступной научной и патентной литературы сведения о выраженном влиянии экстрактов коры дуба (Quercus cortex) и травы зверобоя (Hyperici herba), листьев березы (Folia Betulae) и травы зверобоя (Hyperici herba) на проявления «чувства кворума» у бактерий не известны. Соответственно, наибольшая выраженность подобного эффекта в отсутствие или при минимальном прямом антибактериальном воздействии явилось основанием для рекомендации по их использованию для нового способа воздействия на физиологию паразитирующего микроорганизма в направлении подавления его плотностно-зависимой коммуникации.
[22]3) На фиг. 2 приведены результаты отдельной серии экспериментов и было показано, что экстракты коры дуба и травы зверобоя, листьев березы и травы зверобоя при их комбинировании обладают аддитивным эффектом в отношении системы «чувства кворума» С. violaceum АТСС 31532 (К1 - действие травы зверобоя без коры дуба, К2 - действие коры дуба безтравы зверобоя, К3 - чистая культура).
[23]При проведении подобного исследования серии двукратных разведений вещества «а» и вещества «б» вносились в перпендикулярных друг другу направлениях в ячейки 96-луночного планшета, так что в каждой из них формировалось индивидуальное соотношение «кора дуба: листья березы», «кора дуба: трава зверобоя» или «трава зверобоя: листья березы». Контрольными пробами являлись ряды разведений, содержащие только вещество «а» или только вещество «б». Далее ячейки заполнялись жидкой питательной средой, содержащей С. violaceum АТСС 31532 и инкубировались при 27°С в течение 24-48 часов для проявления роста бактериальной культуры с развитием эффекта «чувства кворума», оцениваемого по образованию экстрагируемого из бактериальной биомассы сине-фиолетового пигмента виолацеина.
[24]Совместное действие исследуемых экстрактов оценивалось в соответствии с методикой, предложенной Tallarida R.J. [8]. Принцип этого метода заключается в построении изоболограммы, по которой можно определить характер взаимодействия двух веществ путем сравнения экспериментальных точек, координатами которых является концентрация вещества и значение EC50. Комбинация веществ вызывает аддитивный эффект, если точка расположена на изоболе, супераддитивный эффект, если она находится под изоболой и инфрааддитивный эффект, если точка находится над изоболой.
[25]На фиг. 3 представлен изоболографический анализ совместного воздействия комбинаций коры дуюа с листьями березы (фиг. 3 «а») и травой зверобоя (фиг. 3 «б»), а также листьев березы с травой зверобоя (фиг. 3 «в») на QS-зависимый биосинтез пигмента виолацеина в культуре С. Violaceum АТСС 31532. Изоболы представлены в виде прямых линий, соединяющих концентрации каждого из соединений, вызывающих одинаковых биологических эффект (50% подавления биосинтеза виолацеина, EC50). Результаты исследований, проведенных в перекрестной матрице концентраций исследуемых экстрактов в растущих культурах С. violaceum АТСС 31532, выявили разную биоактивность в тесте подавления QS-зависимого биосинтеза пигмента виолацеина. Так комбинирование коры дуба с листьями березы и коры дуба с травой зверобоя показало супераддитивный эффект, проявляющийся в расположении большинства расчетных индексов комбинированного воздействия под прямой, соединяющей значения ЕС50. Изоболографический анализ композиции «листья березы : трава зверобоя» свидетельствовал о незначительном аддитивном характере действия подобных композиций.
[26]4) Описанные выше результаты также явились экспериментальным обоснованием формирования композиций экстрактов с содержанием каждого компонента от 50,0 мас. % (двухкомпонентных композиций в случаях отсутствия показаний или наличия противопоказаний к применению одного из экстрактов). В состав патентуемого изобретения входит также применение композиции на основе экстрактов коры дуба, листьев березы и травы зверобоя для подавления «чувства кворума» у патогенной и условно-патогенной бактериальной микрофлоры, вовлеченной в развитие инфекционных заболеваний растений, животных и человека. С этой целью данная композиция может вводиться в организм для обеспечения системного эффекта, а также применяться местно для воздействия на определенные области (например, в составе перевязочных материалов для обработки ран, при обработке операционного поля и т.д.). Композиция экстрактов может использоваться в виде водных или спиртовых растворов, твердых веществ (порошков), а также нанесенными на различные носители.
[27]Заявляемое изобретение иллюстрируется, но никак не ограничивается следующими примерами.
[29]Композиция, подавляющая «чувство кворума» у бактерий, например, при лечении раневых инфекций и инфекционно-воспалительных заболеваний кожи. Композиция содержит настойки коры дуба (Quercus cortex) и травы зверобоя (Hyperici herba). Настойки приготавливаются по общей схеме: 6 грамм измельченного растительного сырья Quercus cortex, предварительно стерилизованного в автоклаве при 1 атмосфере в течение 30 минут, заливали стерильной дистиллированной водой в объеме 50 мл. На следующем этапе производилось кипячение на водяной бане в течение 30 минут, охлаждение - 10 минут, после чего полученный отвар процеживали через стерильный ватно-марлевый фильтр в стеклянную посуду.
[30]При приготовлении водных извлечений из мягких частей растений (травы зверобоя) использовали аналогичную последовательность действий за исключением того, что кипячение на водяной бане осуществляли 15 минут, а настаивание - в течение 45 минут.
[31]Полученные настойки смешиваются при следующем соотношении компонентов, мас. %:
[32]- настойка коры дуба (Quercus cortex) - 50,0;
[33]- настойка травы зверобоя (Hyperici herba) - 50,0;
[34]Композиция может использоваться путем примочек, аппликаций или орошений.
[35]Пример 2. Композиция, подавляющая «чувство кворума» у бактерий, например, при лечении и профилактике кишечных инфекций. Композиция содержит высушенные извлечения экстрактов листьев березы (Folia Betulae) и травы зверобоя (Hyperici herba). Извлечения листьев березы и травы зверобоя приготовлялся по общей схеме: 6 грамм измельченного растительного сырья, предварительно стерилизованного в автоклаве при 1 атмосфере в течение 30 минут, заливаются стерильной дистиллированной водой в объеме 50 мл. На следующем этапе производится кипячение на водяной бане в течение 15 минут, охлаждение - 45 минут, после чего полученные настои процеживаются через стерильный ватно-марлевый фильтр в стеклянную посуду. На следующем этапе отвар и настои выпариваются на водяной бане до получения более густой консистенции, после чего полностью высушиваются до получения порошка. Полученные сухие фитоэкстракты смешиваются при следующем соотношении компонентов, мас. %:
[36]- настойка травы зверобоя (Hyperici herba) - 50,0;
[37]- настойка листьев березы (Folia Betulae) - 50,0.
[38]Композиция может использоваться в качестве порошков и иных твердых форм для перорального применения, а также нанесенной на различные носители.
[40]1. Патент на изобретение RU №2712625 Композиция, содержащая смесь экстрактов растений или смесь молекул, содержащихся в указанных растениях и применение для контролирования метаболизма углеводов или липидов / С. Пельтье, П. Сирван, Т. Могар: опубликовано 30.01.2020, Бюл. №4.
[41]2. Патент на изобретение RU №2671501 Композиция, содержащая экстракт или фракцию из растений рода Justicia / Ч.Б. Юн, Х.Й. Ли, Ч.Х. Юм, К.Х. Ким, Ч.Х. Чон, Х.П. Чван, Ю.Х. Хван, С.К. Сон, Т.Р. Чхве: опубликовано 01.11.2018, Бюл. №31.
[42]3. Патент на изобретение RU №2637128 Березовый экстракт с отварами лекарственных растений / А.П. Полетаев: опубликовано 30.11.2017, Бюл. №34.
[43]4. Патент на изобретение RU №2575832 Композиция, содержащая экстракт растений для предотвращений или лечения нейродегенеративных нарушений / С-X. Ким, М.-В. Сон, С.-З. Чой, Х.-Д. Ким, Д.-Й. Риу, С.-Й. Ким: опубликовано 20.02.2016, Бюл. №5.
[44]5. Патент на изобретение RU №2542464 Композиция на основе фитоэкстрактов, подавляющая чувство кворума у бактерий / Д.Г. Дерябин, А.А. Толмачева: опубликовано 20.02.2015, Бюл. №5.
[45]6. Shukla V, Bhathena Z. Broad spectrum anti-quorum sensing activity of tannin-rich crude extracts of Indian medicinal plants. Scientifica (Cairo) 2016;2016:5823013.
[46]7. Okusa PN, Rasamiravaka T, Vandeputte O, Stevigny C, Jaziri ME, Duez P. Extracts of Cordia gilletii de wild (Boraginaceae) quench the quorum sensing of Pseudomonas aeruginosa PAO1. J Intercult Ethnopharmacol. 2014; 3:138-43.
[47]8. Tallarida R.J. Statistical analysis of drug combinations for synergism. Pain. 1992; 49: 93-97.
[48]
