[1]Изобретение относится к биотехнологии и может использоваться для промышленного получения водоросли Chlorella vulgaris. Питательная среда включает компоненты основной питательной среды Болда, почвенную вытяжку, витамины В1 и В12 в заданном соотношении. Изобретение позволяет увеличить концентрацию суспензии, оптическую плотность и темпы роста Chlorella vulgaris.
[2]Для промышленного производства микроскопических водорослей, в том числе и Chlorella vulgaris, требуется создание благоприятных условий для их роста. Для выращивания водорослей необходимо поддержание оптимального уровня освещения и температуры, концентрации углекислого газа, а также перемешивание. Для достижения максимального прироста водоросли необходимо подобрать оптимальную питательную среду, которая удовлетворяет физиологические потребности водоросли. Питательная среда по своему составу должна максимально воспроизводить условия, в которых вид обитает в природе. Питательные среды, используемые для культивирования Chlorella vulgaris, содержат макро- и микроэлементы, которые обеспечивают нормальную жизнедеятельность клеток.
[3]Для выращивания хлореллы используется среда Тамия (Tamiya, 1957). Одной из особенностей выращивания водоросли в данной среде является нехватка азота и повышенная концентрация калия, что ведет к подщелачиванию среды. Чтобы избежать подобного явления рекомендуется применить мочевину как источник азота. Так было выяснено, что для среды Тамия, содержащей нитратный азот, характерно присутствие повышенных концентраций серы и магния.
[4]С целью устранения недостатков среды Тамия была разработана среда №3, для которой были характерны тот же прирост биомассы, что и у среды Тамия с нитратным азотом и ниже на 1% в отличие от среды Тамия с мочевиной (Мещерякова, 2016). Однако среда №3 дает меньший прирост биомассы хлореллы, чем среда Тамия.
[5]Также известна питательная среда для выращивания хлореллы на основе среды Тамия с добавлением аммофоса, калимагнезия и хлорного железа (SU 506962).
[6]Для выращивания хлореллы используется также среда Бенеке (Wijanarko, 2011). Установлено, что среда Бенеке, содержащая нитрат калия, является оптимальной для накопления липидов до 0,42 г/г биомассы. В случаях применения мочевины как источника азота, рост клеток снижался на 30%, однако при этом происходило увеличение содержание белка в клетках водоросли. Было установлено, что использование для среды сточных вод с аммиаком увеличивает скорость роста хлореллы на 55-60%, а внутриклеточные липиды увеличиваются на 8,5%.
[7]Группа ученых с П. Хелд изучала возможности культивирования хлореллы на питательных средах BG-11, ТАР и ТР. Прирост числа клеток в среде TP был ниже, чем в среде ТАР в 1,7 раз, а прирост биомассы в среде BG-11 был ниже, чем в среде ТАР в 16 раз (Дворецкий и др., 2015).
[8]К недостаткам питательных сред Тамия с модификациями, Бенеке, BG-11, ТАР и TP относится относительно низкий темп прироста биомассы.
[9]Следует отметить, что все перечисленные выше питательные среды характеризуются использованием ограниченного числа микроэлементов. Это негативно сказывается на росте и жизнеспособности клеток Chlorella vulgaris. Микроэлементы особенно важны для культивирования хлореллы в течение длительного времени, так как при их нехватке со временем будет происходить угнетение их жизнеспособности и гибель.
[10]Известна также среда Люка для выращивания водорослей с использованием ионита «Ионосорб™» и куриного помета (RU 2556126). Недостатком этой среды является необходимость использования ионита, который достаточно сложно прибрести. Куриный помет относится к отходам III класса опасности, его гашение требует специальных навыков и тщательного соблюдения техники безопасности.
[11]Основная среда Болда (Bold's Basal Media - ВВМ) - это среда, которая широко используется для выращивания водорослей (Bischoff, Bold, 1963). От других сред она отличается использованием большого числа микроэлементов, что позволяет поддерживать жизнеспособность водорослей в течение длительного времени (таблица 1). Однако в ряде случаев даже при использовании основной среды Болда наблюдается замедление скорости роста водоросли. Причиной этих процессов является нехватка витаминов, а также органических веществ, присутствующих в естественных условиях обитания.
[12]Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка питательной среды для культивирования водоросли Chlorella vulgaris с целью повышения темпов роста и плотности суспензии за небольшой промежуток времени.
[13]Для решения задачи предлагается питательная среда для культивирования водоросли Chlorella vulgaris, которая отличается введением новых компонентов (почвенной вытяжки и витаминов В1 и В12) в определенных соотношениях.
[14]Для получения суспензии используется аутентичный штамм Chlorella vulgaris Beijerinck ВСАС 76. Готовится питательная среда Болда согласно стандартному рецепту (Bischoff, Bold, 1963; Гайсина и др., 2008). Почвенную вытяжку получают путем добавления 10 мг просеянной воздушно-сухой почвы к 40 мл дистиллированной воды с последующим взбалтыванием. Раствор оставляют на сутки, затем фильтруют через бумажный складчатый фильтр (Кабиров, Сугачкова, 2005) и стерилизуют автоклавированием. В 1 л среды добавляется 40 мл почвенной вытяжки и по 0,125 мкг витаминов B1 и В12. В питательную среду вносят маточный раствор Chlorella vulgaris, которую затем культивируют при комнатной температуре в сочетании искусственного и естественного освещения при световой и темновой фазах 12:12 ч. Эксперименты проводятся в 500 мл колбах с рабочим объемом 230 мл. Для исключения оседания и агрегации клеток водорослей используется перемешивающее устройство ПЭ-6300.
[15]Для контроля количества и концентрации клеток образцы суспензии отбираются каждые 24 часа. Предварительная оценка прироста клеток в суспензии осуществляется методом прямого подсчета клеток в камере Горяева. Так же определяется общая концентрация клеток (Биотест-системы…, 2014). Оптическая плотность измеряется с помощью концентрационного фотоколориметра КФК-3-01.
[16]Чтобы показать, насколько эффективен тот или иной состав питательной среды, определяется темп роста водоросли. Темп роста зависит от плотности суспензии, отобранной с интервалом, например, один раз в сутки, в зависимости от скорости роста водоросли (Barsanti, Gualtieri, 2006).
[17]Темп роста (μ) рассчитывается с использованием формулы:
[18]
[19]где N2 и N1 - это число клеток во время t1 и t2.
[20]Когда N2 это удвоенная N1, например, если численность клеток увеличилась вдвое. Скорость роста можно выразить формулой:
[21]
[22]где Tg - это время генерации.
[23]С учетом того, что ln (2)=0,6931, время генерации может быть подсчитано по формуле:
[24]
[25]Для статистической оценки результатов использовали критерий S Вальда-Вольфовица (Кузнецов, 2006). Оценка различия выборок по данному критерию осуществляется при помощи программы Statistica trial, пробная версия которой имеется в интернете в свободном доступе (http://statsoft.ru/products/trial/).
[26]Пример конкретной реализации способа. Эксперимент был направлен на сравнение эффективности культивирования на среде Болда с добавлением витаминов B1 и В12 (первый вариант), среде Болда с добавлением почвенной вытяжки (второй вариант), среде Болда с добавлением витаминов B1 и В12 и почвенной вытяжки (третий вариант). На 12-е сутки культивирования концентрация клеток водоросли на среде Болда с витаминами и почвенной вытяжкой составила 9,19 млн клеток/мл, на среде Болда с добавлением витаминов - 8,15 млн клеток/мл и на среде Болда с почвенной вытяжкой - 7,05 млн клеток/мл (таблица 2). Сочетание питательной среды с витаминами и почвенной вытяжкой приводит к значительному увеличению концентрации клеток водоросли, следовательно, данный вариант среды наиболее эффективен при получении суспензии.
[27]Так же была определена оптическая плотность суспензии при длине волны 670 нм (таблица 3), которая достигала максимума 0,362 на 12-е сутки культивирования при сочетании питательной среды Болда с витаминами и почвенной вытяжкой.
[28]Наибольший темп роста Chlorella vulgaris, равный 0,152, наблюдался при культивировании на среде Болда с почвенной вытяжкой и витаминами (таблица 4). При культивировании на среде Болда с витаминами темп роста был равен 0,132, при выращивании на среде Болда с почвенной вытяжкой - 0,134 (таблица 4).
[29]Статистический анализ результатов экспериментов по влиянию среды с почвенной вытяжкой и витаминами на оптическую плотность суспензии по критерию Вальда-Вольфовица показал их достоверность (S=0,156714).
[30]Таким образом, разработанная питательная среда Болда с добавлением почвенной вытяжки, витаминов тиамина, цианкобаламина позволяет повысить концентрацию суспензии, оптическую плотность и темпы роста хлореллы за небольшой промежуток времени, что актуально при промышленных масштабах производства водоросли.
[32]Авторское свидетельство СССР 506962 от 25 ноября 1976 г., кл. А01Н 13/00. Питательная среда для выращивания хлореллы. Альбицкая О.Н., Райко А.Н., Филатова Т.М. 28.02.77. Бюл. №43.
[33]Биотест-системы для задач экологического контроля: Методические рекомендации по практическому использованию стандартизованных тест-культур / Терехова В.А., Воронина Л.П., Гершкович Д.В., Ипатова В.И., Исакова Е.Ф., Котелевцев С.В., Попутникова Т.О., Рахлеева А.А., Самойлова Т.А., Филенко О.Ф. М.: Доброе слово, 2014. 48 с.
[34]Гайсина Л.А., Фазлутдинова А.И., Кабиров P.P. Современные методы выделения и культивирования водорослей: учебное пособие. Уфа: Изд-во БГПУ, 2008. 152 с.
[35]Дворецкий Д.С., Дворецкий С.И., Темнов М.С. Пешкова Е.В., Акулинин Е.И. Технология получения липидов из микроводорослей. Тамбов: Издательство ФГБОУ ВПО «ТГТУ», 2015, С. 14.
[36]Кабиров P.P., Сугачкова Е.В. Оценка качества окружающей среды: Учебно-методическое пособие. Уфа: Вагант, 2005. 128 с.
[37]Кузнецов В.М. Основы научных исследований в животноводстве. Киров: Зональный НИИСХ Северо-Востока, 2006. 568 с.
[38]Мещерякова Ю.В. Разработка технологического процесса получения биодобавок из липидных компонентов микроводоросли хлорелла для улучшения свойств дизельного топлива: дис. … канд. техн. наук. ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт использования техники и нефтепродуктов в сельском хозяйстве», Тамбов, 2016.
[39]Патент РФ 2556126 от 9 января 2014 г., кл. C12N 1/12. Питательная среда Люка для культивирования микроводорослей. Михайлюк А.В., Щемелинина Т.Н., Анчугова Е.М. 10.07.2015. Бюл. №19.
[40]Триал-версии STATISTIC А. [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://statsoft.ru/products/trial/). Дата обращения 25.05.2018
[41]Barsanti L., Gualtiery P. Algae: anatomy, biochemistry and biotechnology. New York: CRC Taylor & Francis. 2006.
[42]Bischoff H.W., Bold H.C. Phycological studies IV. Some soil algae from enchanted rock and related algal species. University of Texas, Austin, 1963, 6318. P. 1-95.
[43]Tamiya H. Mass culture of algae // Annual Review of Plant Physiology. 1957. N8. C. 309-334.
[44]Wijanarko A. Effect of the Presence of Substituted Urea and Also Ammonia as Nitrogen Source in Cultivied Medium on Chlorella Lipid Content, Progress in Biomass and Bioenergy Production. 2011. [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.intechopen.com. DOI: 10.5772/19358. Дата обращения 23.09.2018.
[45]
[46]
[47]
[48]
