[1]Изобретение относится к лабораторной микологии и касается получения клеток дифазного микроскопического гриба Histoplasma capsulatum в тканевой (паразитической) фазе роста при его культивировании in vitro.
[2]Возбудитель особо опасной микотической инфекции - гистоплазмоза - Histoplasma capsulatum - микромицет II группы патогенности, характеризующийся дифазным характером роста (мицелиальной - во внешней среде и тканевой - в организме теплокровных). Описано 3 варианта возбудителя - Histoplasma capsulatum var. capsulatum, H capsulatum var. duboisii и H. capsulatum var. farciminosum
[3]Восприимчивость населения к заражению считается всеобщей. Инфицирование человека происходит элементами мицелия гриба - макро- и микроконидиями, которые при попадании в макроорганизм трансформируются (конверсируют) в тканевую (или паразитическую) форму, которая представляет собой округлые слегка удлиненные клетки (1,5-2,2×3,0-3,5) мкм, оккупирующие систему тканевых макрофагов, где они реализуют свою способность беспрепятственно размножаться в клетках и поражать практически любые органы и ткани макроорганизма.
[4]Верификация диагноза микоза для исхода заболевания имеет особое значение, так как связана с назначением принципиально иного по сравнению с противобактериальным этиотропного противомикотического лечения. Однако культуральная диагностика гистоплазмоза, оставаясь «золотым стандартом микробиологии», прежде всего, основывается на доказательстве диморфизма гриба и, как следствие, как можно в более ранние сроки выявления клеток возбудителя в тканевой фазе роста in vitro.
[5]Таким образом, получение дрожжевой фазы возбудителя из мицелиальной является неоспоримым доказательством его причастности к микромицетам II группы патогенности и позволяет четко выявить специфический процесс, поэтому подбор питательной среды, на которой возможна конверсия возбудителя и его культивирование в тканевой (паразитической) фазе роста, является ключевым в ходе проведения лабораторного анализа. В связи с этим получение питательной среды, обеспечивающей эффективный рост дрожжевых клеток Н. capsulatum, приобретает в лабораторном анализе гистоплазмозной инфекции особое и существенное значение.
[6]Для культивирования клеток Histoplasma capsulatum стандартными являются среды Сабуро и Френсиса. В состав агара Сабуро входят пептон ферментативный 10,0 г/л, D-глюкоза 40,0 г/л, дрожжевой экстракт 2,0 г/л, агар 10,0 г/л, при необходимости - хлорамфеникол 0,05 г/л. Однако на среде Сабуро возбудитель гистоплазмоза растет в течение длительного (до 1 мес) времени и при этом формирует культуру только в мицелиальной фазе роста, когда его септированный многоклеточный диаметром от 1 до 5 мкм мицелий морфологически практически неотличим от гиф многих других плесневых грибов, в том числе однофазных III и IV групп патогенности.
[7]Наиболее часто используемой средой для роста возбудителя гистоплазмоза в тканевой фазе является среда Френсиса, представляющая собой мясной бульон двойной крепости, куда в качестве требуемых питательных ингредиентов добавлены дефибринированная кроличья или лошадиная кровь (8% по объему, или 80,0 г/л), ферментативный пептон 10,0 г/л, D-глюкоза 10,0 г/л, хлорид натрия 5,0 г/л, L-цистин 1,0 г/л, агар-агар 10,0 г/л. Однако мясные экстракты трудно стандартизуемы, могут содержать в разных концентрациях антимикробные препараты, стабилизаторы вакцин, консерванты и другие компоненты, влияющие на рост микроорганизмов, что нередко приводит к ингибированию не только конверсии грибных клеток, но и непосредственно их роста. Поэтому поиск питательной среды с высокими ростовыми характеристиками, в основе которой будут находиться стандартизованные легко усвояемые возбудителем гистоплазмоза компоненты, представляет собой актуальную задачу лабораторного анализа при этой инфекции.
[8]Ближайшим аналогом предлагаемой среды является «Питательная среда для культивирования и выделения туляремийного микроба, сухая (FT-агар)». Как известно, возбудители туляремии являются требовательными медленно растущими микроорганизмами, которые не вырастают на простых питательных средах, в связи с чем для работы с Francisella tularensis применяют различные варианты агаровых сред на рыбных, мясных, дрожжевых основах с обязательным добавлением L-цистеина (L-цистина), D-глюкозы, дрожжевого экстракта (как источника витамина В). FT-агар, выпускаемый ФБУН ГНЦ ПМБ (Оболенск; ТУ 9398-028-78095326-2007) в виде комплекта основы с глюкозо-витаминной добавкой (ГВД), при культивировании и выделении F. tularensis не требующего внесения крови или других стимуляторов роста (Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство /Под ред акад. РАМН Г.Г. Онищенко, акад РАМН В.В. Кутырева. - Изд. 2-ое, переработанное и дополненное. - М.: ЗАО «Шико», 2013. - стр. 175), и в последние годы в лабораторной диагностике туляремии ему отдается предпочтение (там же, стр. 173).
[9]Целью изобретения является получение питательной среды на ферментированной основе, позволяющей стимулировать in vitro быструю конверсию клеток Н. capsulatum в тканевую фазу роста, а также увеличивать выход культуры и тем самым способствовать усовершенствованию лабораторной диагностики гистоплазмоза.
[10]Цель достигается тем, что за основу питательной среды для конверсии и культивирования клеток возбудителя гистоплазмоза в тканевой фазе используют FT-агар (ФБУН ГНЦ ПМБ Оболенск; ТУ 9398-028-78095326-2007) для культивирования туляремийного микроба. В состав FT-агара входят сернокислотный гидролизат рыбной муки (17,0 г/л), который используется в предлагаемой среде вместо мясопептонного бульона двойной крепости, а также ферментированная кровь как стимулятор роста гемофильных микроорганизмов (5,0 г/л), дрожжевой экстракт (2,3 г/л), сульфит натрия (0,7 г/л), сернокислый магний (0,5 г/л), L-цистеин (0,5 г/л), а также - при необходимости - глюкозо-витаминная добавка к FT-среде (6,02 г/л), в целом обеспечивающие высокие питательные потребности микроорганизмов. В предлагаемую среду к FT-агару дополнительно для обеспечения эффективного роста дрожжевых клеток Н. capsulatum вносят ферментативный пептон (10 г/л), хлорид натрия (5 г/л), а также ex tempore дефибринированную кровь лабораторного животного (козы, барана, кролика) (80,0 г/л, или 8 об %), D-глюкозу (14,0 г/л), L-цистин (1,0 г/л), RPMI 1640 Vitamins Solution (100Х) - концентрат витаминов группы В фирмы Sigma (США) для тканевых культур при концентрации агара микробиологического (15,0±2,0 г/л).
[11]Среду автоклавируют (121°С, 20 мин), остужают до 50-45°С, после чего ex tempore добавляют предварительно подготовленные растворы питательных добавок (1,0 г L-цистина разводят в 10,0 мл дистиллированной воды и стерилизуют раствор через одноразовый фильтр «Millipore» 0,45 мкм), а также используют 40% стерильный аптечный раствор глюкозы для внутривенного введения (35 мл, что составляет в конечной концентрации 14,0 г/л), готовый стерильный концентрат витаминов RPMI 1640 Vitamins Solution (100Х - 10,0 мл/л) и взятую асептически дефибринированную кровь лабораторного животного (80,0 мл/л). После тщательного перемешивания среду разливают в чашки Петри или пробирки, оставляют на 24 час в термостате при 37°С для подсушивания и одновременно контроля отсутствия контаминации посторонней микробиотой и затем используют в дальнейшей работе.
[12]Применение полученной среды обеспечивает по сравнению с наиболее часто используемым в практике кровяным агаром Френсиса в среднем десятикратное увеличение выхода клеток Н. capsulatum, что позволяет провести выделение возбудителя при более низкой посевной дозе, при этом рост в дрожжевой (тканевой, паразитической) фазе in vitro подтверждает его принадлежность к возбудителям особо опасного микоза. В целом, такие результаты лабораторного анализа обеспечивают полноценную доказательную базу при диагностике гистоплазмоза у больных.
[13]ПРИМЕРЫ КОНКРЕТНОГО ПРИМЕНЕНИЯ
[14]Пример 1. Сравнительная оценка применяемых и предлагаемой сред для конверсии и культивирования дрожжевых клеток Н. capsulatum
[15]Культуры Н. capsulatum var. capsulatum 6651, 6652, В-630; Н. capsulatum var. duboisii 9/22, H. capsulatum var. farciminosum 12-89, представленные в Коллекционном центре Волгоград НИПЧИ и пересеваемые в пробирках на агаре Сабуро в мицелиальной фазе роста, суспендировали в 0,15 М растворе хлорида натрия в концентрациях 107, 106 и 105 кл/мл (согласно ОСО мутности ФГБУ НЦЭСМП), что в пересчете применительно к грибным клеткам составляет 2⋅104-2⋅102 кл/мл соответственно (Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство. Под ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко. - М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006. - с. 171). Питательные среды Сабуро, Френсиса, FT-агар готовили согласно прилагаемым инструкциям. Состав и кислотность сред представлен ниже (табл. 1).
[16]
[17]Примечание: *СРГМ - стимулятор роста гемофильных микроорганизмов
[18]Техника приготовления среды Сабуро сводилась к внесению в 1,000 л дистиллированной воды ферментативного пептона 10,0 г, D-глюкозы 40,0 г, дрожжевого экстракта 2,0 г, агара 10,0 г, доведения до кипения при постоянном перемешивании, кипячения в течение 1-2 мин. После снятия с огня доводили до рН 6,0±0,2 и стерилизовали автоклавированием при температуре 110°С в течение 20 мин.
[19]FT агар, изначально предназначенный для культивирования Francisella tularensis - микроорганизма, отличающегося высокими питательными потребностями, - варили согласно прилагаемой инструкции, в связи с чем 34,0 г основы размешивали в 980 мл дистиллированной воды, автоклавировали при 121°С в течение 15 мин и охлаждали до 50-45°С, после чего вносили 6,02 г глюкозо-витаминной добавки (ГВД), предварительно растворенной в 20 мл дистиллированной воды и автоклавированной при 110°С в течение 30 мин. Содержимое флакона тщательно перемешивали и стерильно разливали в чашки Петри.
[20]При производстве агара Френсиса к мясному бульону двойной крепости (1000,0 мл) добавляли ферментативный пептон (10,0 г/л), хлорид натрия (5,0 г/л) и агар (10,0±2,0 г/л). Среду автоклавировали (121°С, 20 мин), остужали до 50-45°С и затем в нее асептически вносили ex tempore дефибринированную кровь (80,0 г/л), D-глюкозу (10,0 г/л), раствор L-цистеина (до конечной концентрации 1,0 г/л) и в стерильных условиях разливали в соответствующую лабораторную посуду.
[21]С целью контроля стерильности чашки и пробирки, содержащие свежеприготовленный агар Френсиса, оставляли в суховоздушном термостате при 37°С на 24 часа и впоследствии использовали для проведения посевов.
[22]Предлагаемую среду готовили на основе агара для культивирования возбудителя туляремии, для чего к 34,0 г сухой FT-среды добавляли 10,0 г ферментативного пептона, 5,0 г хлористого натрия и дополнительно 5,0 г агара, которые размешивали в 865 мл дистиллированной воды, после чего суспензию ставили на огонь и при постоянном помешивании доводили до кипения. Разливали в стеклянную посуду, затем автоклавировали при 121°С в течение 15 мин и охлаждали до 50-45°С, после чего туда последовательно ex tempore вносили заранее приготовленные стерильные растворы L-цистеина (10% - 10,0 мл), D-глюкозы (40% - 35,0 мл), концентрат витаминов RPMI 1640 Vitamins Solution 100Х (10,0 мл), а также дефибринированную кровь кролика (80,0 мл/л). После тщательного перемешивания среду разливали в чашки Петри или пробирки, оставляли на 24 час в термостате при 37°С для подсушивания и одновременно контроля отсутствия контаминации посторонней микробиотой и впоследствии использовали в дальнейшей работе.
[23]На чашки с питательными средами (Сабуро, Френсиса, FT-агар и предлагаемый питательный агар) производили посев суспензии клеток возбудителей гистоплазмоза, далее культуру растирали по поверхности агара шпателем, и чашки помещали в термостат при 37°С. Все работы с возбудителями гистоплазмоза осуществляли в соответствии с Санитарными правилами СП 1.3.3118-13 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)". - Рег. N 32325 от 19.05.2014, регламентирующими работу с возбудителями особо опасных инфекций. Спустя 5 сут культивирования осуществляли учет результатов.
[24]Исследования проводили в трех повторностях на различных сериях предлагаемой среды (табл. 2).
[25]
[26]Примечания: * Посевная доза для каждого наблюдения составляла 1⋅102 кл/чашку (из концентрации по ОСО мутности 105 м.к./мл - 0,5 мл, что соответствует 1⋅102 клеток микромицетов / Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство. Под ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко. - М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006. - с. 171).;
[27]**Результаты (M±m) получены по результатам проведения опытов в 3-х повторностях; учет проводили на 5 сут наблюдения;
[28]***Статистическая обработка результатов проведена с помощью пакета программ MS Office Excel путем вычисления t-критерия Стьюдента.
[29]Как следует из данных таблицы, на 5 сут культивирования при температуре 37°С на средах Сабуро и FT-агаре роста дрожжевых клеток грибов отмечено не было, в отличие от приготовленной по классической рецептуре среды Френсиса и предлагаемой нами среды. При этом ростовые характеристики предлагаемой среды позволяли в среднем десятикратно по сравнению с традиционной средой Френсиса увеличить число конверсированных в тканевую фазу клеток возбудителей как американского, так и африканского гистоплазмоза (рис. 1. Рост дрожжевых клеток Н. capsulatum var. capsulatum 6652 на различных питательных средах (верхний ряд - среда Сабуро и FT-агар; нижний ряд - предлагаемая среда (слева) и среда Френсиса на основе мясного бульона (справа) при одних и тех же условиях посева и культивирования.)
[30]Достоверность полученных результатов (р<0,001 и р<0,01 для возбудителей американского и африканского гистоплазмоза соответственно) была подтверждена статистическим анализом путем использования пакета компьютерных программ MS Office Excel посредством вычисления средней арифметической, ошибки средней арифметической, стандартного отклонения, дисперсии. Значимость различий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента с использованием компьютерной программы «MS Office Excel». Различия считали достоверными при р<0,05.
[31]Пример 2. Оптимальный состав питательной среды для конверсии и культивирования дрожжевых клеток Н. capsulatum
[32]Для приготовления питательной среды в нашей модификации за основу питательной среды для конверсии и культивирования клеток возбудителя гистоплазмоза в тканевой фазе использовали FT-агар (ФБУН ГНЦ ПМБ Оболенск; ТУ 9398-028-78095326-2007) для культивирования туляремийного микроба, в состав которого входят сернокислотный гидролизат рыбной муки (17,0 г/л), ферментированная кровь как стимулятор роста гемофильных микроорганизмов (5,0 г/л), дрожжевой экстракт (2,3 г/л), сульфит натрия (0,7 г/л), сернокислый магний (0,5 г/л), L-цистеин (0,5 г/л), агар микробиологический (10,0 г/л), куда дополнительно вносили ферментативный пептон (10,0 г/л), хлористый натрий (5,0 г/л) и 5,0 г/л агара (до конечной концентрации последнего 15±0,2 г/л вместо 10,0 г/л), а после автоклавирования (121°С, 20 мин) и охлаждения до 50-45°С ex tempore добавляли предварительно подготовленные растворы питательных добавок: взятую асептически дефибринированную кровь кролика (80,0 мл/л, или 8 об %), L-цистин - 1,0 г/л (1,0 г L-цистина разводили в 10,0 мл дистиллированной воды и стерилизовали раствор через одноразовый фильтр «Milllipore» 0,45 мкм), D-глюкозу - 14,0 г/л (использовали 40% стерильный фармакопейный раствор D-глюкозы для внутривенного введения - 35,0 мл, что составляет в конечной концентрации 14,0 г/л), а также готовый стерильный концентрат витаминов RPMI 1640 Vitamins Solution (100Х - 10 мл/л).
[33]После тщательного перемешивания среду разливали в чашки Петри и пробирки, оставляли на 24 час в термостате при 37°С для подсушивания и одновременно контроля отсутствия контаминации посторонней микробиотой и затем использовали в дальнейшей работе (табл. 3).
[34]
[35]Примечание: *СРГМ - стимулятор роста гемофильных микроорганизмов
[36]Как следует из данных таблицы, вместо мясного бульона двойной крепости в предлагаемую среду введены в качестве белковой основы сернокислотный гидролизат рыбной муки, а также отдельные питательные ингредиенты (ферментативный пептон, дрожжевой экстракт, D-глюкоза, серосодержащие аминокислоты, соли) и биостимуляторы (дефибринированная и ферментированная кровь, витамины) при повышении во избежание разжижения среды концентрации микробиологического агара, что в целом создает условия для оптимального культивирования клеток Н. capsulatum в дрожжевой фазе роста.
[37]Пример 3. Практическое использование предлагаемой среды для выделения дрожжевых клеток Н. capsulatum при низкой посевной дозе
[38]При сравнительном изучении ростовых характеристик предлагаемой нами питательной среды для культивирования возбудителей гистоплазмоза в дрожжевой фазе роста и стандартных питательных сред высевы на них осуществляли в трех повторностях. Культуру Н. capsulatum var. capsulatum 6651, пересеваемую в пробирках на агаре Сабуро в мицелиальной фазе роста, суспендировали в 0,15 М растворе хлорида натрия в концентрациях 107, 106 и 105 кл/мл (согласно ОСО мутности ФГБУ НЦЭСМП), что в пересчете применительно к грибным клеткам составляет 2⋅104-2⋅102 кл/мл соответственно (Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство. Под ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко. - М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006. - с. 171).
[39]На чашки с питательными средами (Сабуро, Френсиса-МПА, FT-агар, агар Френсиса на основе FT-агара) производили посев 0,5 мл суспензии клеток возбудителя гистоплазмоза Н. capsulatum var. capsulatum 6651 из каждой концентрации (соответственно 104-102 клеток микромицетов на чашку). Культуру растирали по поверхности агара шпателем и помещали в термостат при 37°С в аэробных условиях. Спустя 5 сут культивирования проводили учет результатов, после чего во избежание появления на чашках Петри культур в мицелиальной фазе роста посевы инактивировали. Все работы с возбудителями гистоплазмоза осуществляли в соответствии с Санитарными правилами СП 1.3.3118-13 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)". - Рег. N 32325 от 19.05.2014, регламентирующими работу с возбудителями особо опасных инфекций.
[40]При учете результатов опытов, проведенных в 3-х повторностях, оказалось, что роста дрожжевых клеток Н. capsulatum на питательном агаре Сабуро, как и FT-агаре в течение срока наблюдения (5 сут) зарегистрировано ни в одном случае не было. Количество выросших колоний Н. capsulatum var. capsulatum 6651 на предлагаемой среде при расчетной посевной дозе 1⋅102 клеток микромицетов составляло 65 кл/чашку (65%), в то время как на агаре Френсиса, приготовленном на основе мясного бульона - 17 кл/чашку (17%), т.е. показатель прорастания в последнем случае не соответствовал требуемым при контроле биологических показателей питательным нормативам [3]. При этом по показателю стабильности основных свойств микроорганизма все колонии на предлагаемой среде характеризовались крупными размерами, блестящей поверхностью, ровными краями, в то время как на среде Френсиса такой однородностью культуры не отличались (рис. 2. Рост дрожжевых клеток Н. capsulatum var. capsulatum 6651 на предлагаемой среде (слева) и агаре Френсиса (справа) при одних и тех же условиях посева и культивирования).
[41]На агаре Френсиса, приготовленном по традиционной рецептуре, был отмечен рост типичных колоний дрожжеподобных клеток возбудителя гистоплазмоза, однако в количественном выражении на предлагаемой нами среде число колониеобразующих единиц во всех наблюдениях оказывалось достоверно выше (р<0,001 для возбудителей североамериканского гистоплазмоза и р<0,01 для роста клеток возбудителей африканского гистоплазмоза), что подтверждено статистическим анализом с помощью пакета компьютерных программ «MS Office Excel».
[42]Как следует из представленных данных, благодаря полученной среде стало возможным получение дрожжевых клеток возбудителя гистоплазмоза при минимальной посевной дозе, что имеет существенное значение в клинико-лабораторных исследованиях при верификации диагноза.
[43]Таким образом, как для штаммов Н. capsulatum var. capsulatum, так и для возбудителей Н. capsulatum var. duboisii и Н. capsulatum var. farciminosum по ростовым характеристикам предлагаемая среда демонстрирует достоверно явное преимущество (р<0,001 и р<0,01 соответственно) и может быть с полным основанием рекомендована к практическому использованию.
[45]1. Бочкарев М.В., Кашкин П.Н. Гистоплазмоз. / Изд-во «ШТИИНЦА», Кишинев. - 1977. - 150 с.
[46]2. ГОСТ ISO/TS 11133-1-2014 Руководящие указания по приготовлению и производству питательных сред. Часть 1. Общие руководящие указания по обеспечению качества приготовления питательных сред в лаборатории. - М., Стандартинформ, 2015. - 16 с.
[47]3. МУК 4.2.2316-08 Методы контроля бактериологических питательных сред.
[48]4. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. Практическое руководство / Под ред акад. РАМН Г.Г. Онищенко, акад РАМН В.В. Кутырева. - Изд. 2-ое, переработанное и дополненное. - М.: ЗАО «Шико», 2013. - 560 с.
[49]5. Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство. / Под ред. акад. РАМН Г.Г. Онищенко. - М.: ЗАО «МП Гигиена», 2006. - 288 с.
[50]6. Atlas of Clinical Fungi, 2nd ed. / G.S.de Hoog, J. Guarro, J. Gene, M.J. Figueras. - Centraalbureau voor Schimmelcultures // Universitat Rovira I Virgili, 2000. - 1126 p.
[51]7. Kauffman, CA. Histoplasmosis: a clinical and laboratory update / Clin Microbiol Rev. - 2007. - Jan., vol. 20. - pp. 115-132.
