[2]Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к патологической анатомии.
[3]Известно, что точное установление срока давности инфаркта миокарда имеет большое значение для патологоанатома.
[4]Известен способ макроскопической диагностики ранних сроков инфаркта миокарда, основанный на взаимодействии теллурита калия с дегидрогеназами тканей. Вне зоны инфаркта теллурит калия окрашивает миокард в серый или черный цвет, при этом зона некроза остается неокрашенной, за счет разрушения указанных ферментов в зоне инфаркта миокарда (Пальцев М.А., Аничков Н.М. Патологическая анатомия. В 2-х т., Т.2, Ч.1. - М.: Медицина, 2001. - С.82).
[5]Недостатком известного способа является отсутствие возможности дифференцированного определения срока наступления инфаркта миокарда. Известный способ позволяет выявить только некротическую стадию инфаркта миокарда (срок от 2-х часов до 3-х суток), поскольку после наступления стадии организации активность дегидрогеназ в ткани постепенно восстанавливается.
[6]Кроме того, применение данного способа затрудняет получение качественных образцов для гистологического и иммуногистологического исследования и снижает качество документирования морфологических изменений в миокарде за счет того, что красители стойко окрашивают ткань в серый цвет. При дальнейшем обязательном исследовании материала эта окраска мешает окрашиванию стандартными красителями.
[7]Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ диагностики ишемического некроза сердечной мышцы (Пат. 2094806 Российская Федерация, МПК G01N 33/68, G01N 33/50, Способ диагностики некроза в гистологических срезах / Козлов Д.В.; заявитель и патентообладатель Новокузнецк, гос. ин-т усовершенствования врачей, - №94005367/14; заявл. 14.02.1994; опубл. 27.10.1997).
[8]Известный способ осуществляют следующим образом. Фрагменты сердечной мышцы фиксируют 15% водным нейтральным раствором формалина в течение суток при комнатной температуре. В последующем материал подвергают парафиновой заливке, после чего готовят гистологические срезы, которые депарафинируют обработкой в трех порциях о-ксилола и последующим прогреванием в термостате при 37°С в течение 3 часов. Обезвоживание срезов достигают 3-х минутной обработкой в каждой из четырех порций этанола (абсолютный, 96% 70% и 56%). Далее срезы на 5 минут переводят в 0,05 М забуференный физиологический раствор с рН 7,6. Блокирование эндогенной пероксидазы осуществляют свежим раствором 3% перекиси водорода в течение 10 минут, промывают забуференным физиологическим раствором 5 минут. Далее срезы выдерживают под каплей 5%-ного раствора лошадиного сывороточного альбумина. После этого избыток альбумина стряхивают и аккуратно обтирают предметные стекла вокруг срезов. На последние наносят каплю афинно-очищенных кроличьих первичных антител против ассоциированного с беременностью альфаз-гликопротеина в концентрации 8 мкг/мл. Инкубацию срезов осуществляют в течение 30 минут при 37°С во влажной камере, после чего дважды отмывают забуференным физиологическим раствором. Инкубируют гистологические срезы во вторичных биотинилированных антителах в разведении 10 мкг на 1 мл забуференного физиологического раствора в течение 30 минут, после чего отмывают забуференным физиологическим раствором 5 минут. Затем обрабатывают срезы комплексом авидин-пероксидаза в течение 30 минут и отмывают забуференным физиологическим раствором. Иммунологическое проявление осуществляют в 0,03% растворе субстрата на основе диаминобензидина (ДАБ хромогена) в течение 10 мин. Реакцию останавливают ополаскиванием срезов в двух порциях дистиллированной воды. Ядра клеток докрашивают гематоксилином в течение 3 мин. Далее срезы проводят через свежие спирты восходящей концентрации (56% 70% 96%, абсолютный этанол) и три порции о-ксилола, затем заключают в бальзам.
[9]При исследовании готовых микропрепаратов отмечают четкое окрашивание очагов ишемического некроза сердечной мышцы в зоне инфаркта миокарда. Очаг некроза имеет коричневый цвет, а остальные ткани - желто-серую окраску.
[10]Недостатком известного способа, как и аналогичного, является отсутствие возможности точного определения срока давности инфаркта миокарда, поскольку способ-прототип позволяет идентифицировать только некротическую его стадию.
[11]К недостаткам известного способа следует отнести и то, что период полувыведения комплексов ассоциированного с беременностью альфа2-гликопротеина с протеиназами не превышает 2 минут. Следовательно, уже через полчаса практически все комплексы ферментов с ассоциированным с беременностью альфа2-гликопротеином достигают органов-мишеней, в частности печени, где и метаболизируются. Вне кровеносных сосудов это распределение имеет иные характеристики, поскольку высокая молекулярная масса комплексов препятствует их поступлению в кровеносные сосуды (Зорин Н.А. Ассоциированный с беременностью АЛЬФА-2-ГЛИКОПРОТЕИН. НОВОСТИ "Вектор-Бест", N 9, Сентябрь, 1998. Цит. По ссылке http://www.vector-best.ru/nvb/st9_5.htm 29.04.12 г.). Следовательно, выявление комплексов в пограничной зоне инфаркта миокарда ограничено очень коротким сроком; выявление комплексов возможно только в зоне некроза, т.е. вне зон сохранного кровоснабжения.
[12]Задачей заявляемого изобретения является разработка способа определения срока давности инфаркта миокарда при патоморфологических исследованиях.
[13]Техническим результатом предлагаемого способа является определение срока давности инфаркта миокарда от 2-х часов до 30 суток.
[14]Технический результат достигается тем, что способ патоморфологического определения давности наступления инфаркта миокарда включает фиксацию образца ткани, помещение его в парафин, изготовление срезов, их депарафинизацию и прогревание, отмывание в буферном растворе, инкубирование во влажной камере с реагентом и обработку проявляющим агентом, дегидратацию и заключение в среду.
[15]Основным отличительным приемом заявляемого способа является то, что в качестве реагента используют антитела к матриксной металлопротеазе 9 в разведении 1:100-1:250.
[16]Отличительным приемом предлагаемого способа также является и то, что инкубацию с реагентом проводят при температуре +25°С и относительной влажности 100%. Длительность инкубации составляет 60 минут.
[17]Отличия заявляемого способа заключаются и в том, что при микроскопическом выявлении в препарате ярко окрашенных нейтрофилов в сосудах периинфарктной зоны и ярко окрашенных нейтрофилов в зоне инфаркта устанавливают срок давности инфаркта от 2-х часов до 1-х суток, при выявлении дегрануляции нейтрофилов и яркой окраски внеклеточного матрикса в зоне инфаркта - от 1-х до 2-х суток, а при выявлении окрашенных клеток фибробластического ряда в пограничной зоне инфаркта - от 3-х до 30-ти суток.
[18]Сопоставительный анализ заявляемого технического решения с прототипом позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию изобретения «новизна».
[19]Заявляемый способ обеспечивает достижение усматриваемого заявителем технического результата, а именно - обеспечение возможности определения при патоморфологических исследованиях срока давности инфаркта миокарда от 2-х часов до 30 суток при одновременном снижении трудоемкости и длительность исследования.
[20]Так, авторами заявляемого способа установлено, что используемые первичные антитела связываются с веществами, синтезируемыми нейтрофилами, фиброкластами, а также с веществами во внеклеточном матриксе в строго определенные временные промежутки после развития инфаркта миокарда. Поэтому использование при иммуногистохимическом окрашивании гистологических препаратов, в качестве первичных антител к матриксной металлопротеазе 9, позволило авторам заявляемого способа дифференцировать сроки давности наступления инфаркта миокарда при патоморфологическом исследовании.
[21]Преимуществом предлагаемого способа является также то, что он позволяет выявить не только некротическую стадию инфаркта миокарда, но и стадию организации, что определяет его сильную сторону по сравнению с прототипом.
[22]Изложенное позволяет сделать вывод о соответствии технического решения критерию «изобретательский уровень».
[23]Способ, составляющий заявляемое изобретение, предназначен для использования в медицине. Возможность его осуществления подтверждена описанными в заявке приемами и средствами. Это дает основание считать, что заявляемое техническое решение соответствует критерию изобретения «промышленная применимость».
[24]Сущность заявляемого способа поясняется примером конкретного выполнения. Приведенный ниже пример служит для иллюстрации, но не ограничивает данное изобретение.
[26]Объектом исследования явился патологоанатомический материал 30 больных, погибших от острого инфаркта миокарда. Во всех случаях диагностирован первичный острый трансмуральный инфаркт миокарда. Средний возраст - 63.7 года. Мужчин - 18, женщин - 12. По срокам наступления инфаркта больные распределились следующим образом: 16 больных погибли в срок до 3-х суток; 14 больных - в сроки от 3-х суток до 1 месяца.
[27]Образцы ткани из зоны инфаркта миокарда и пограничной к ней зоне фиксировали 10% раствором нейтрального формалина и заливали в парафиновые блоки по общепринятой методике (Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. - Л.: Медицина, 1969. - С.13-15, 52-59).
[28]Затем готовили срезы толщиной 5 мкм, которые монтировали на стекла, покрытые поли-L-лизином. Депарафинировали препараты вначале в толуоле - 5 минут, а затем последовательно в спиртах 100°, 96°, 90°, 70° и 50° по 1 минуте. После чего препараты выдерживали в дистиллированной воде в течение 10 минут.
[29]Для демаскирования антигенов препараты помещали в цитратный буфер (рН6.0) и нагревали 8 минут в микроволновой печи мощностью 800W при 100% мощности, а затем 10 минут при 60% мощности. После чего препараты охлаждали до 25°С в цитратном буфере (рН6.0) и промывали дистиллированной водой 2 раза по 5 минут. Образец ткани обводили гидрофобным карандашом Dako Pen (Dako, Code S2002).
[30]Для инактивации эндогенной пероксидазы на каждый препарат наносили по 50 мкл 3%-ной перекиси водорода и выдерживали в течение 5 минут. После чего отмывали Трис-буфером (рН7.6) дважды по 5 минут. Затем наносили 50 мкл 0.4% раствора казеина, инкубировали 5 минут, отмывали Трис-буфером (рН7.6) 2 раза по 5 минут.
[31]Далее на каждый препарат наносили первичные антитела - антитела к ММР9 rabbit monoclonal antibody IgG (Epitomics, Clone ID: EP1254, Cat. N2551-1, Lot YG 11300 IP) в рабочем разведении 1:100-1:250 и инкубировали во влажной камере при температуре 25°С и 100% влажности в течение 1 часа. Потом отмывали Трис-буфером (рН7.6) 2 раза по 5 минут. Затем на препараты наносили по 50 мкл раствора, содержащего 10% сыворотку в Трис-буфере (рН7.6), инкубировали во влажной камере при температуре +25°С в течение 30 минут. Отмывали Трис-буфером (рН7.6) 2 раза по 5 минут. Затем наносили вторичные антитела Novolink Polymer (Novocastra, REF=7112, Lot 711236), меченные пероксидазой, по 50 мкл, инкубировали во влажной камере при температуре +25°С 30 минут. Отмывали Трис-буфером (рН7.6) 2 раза по 5 минут. Добавляли по 50 мкл субстратной смеси, содержащей 50 мкл 1.74% 3'3'-диаминобензидина в 1 мл 0.05% перекиси водорода (Novocastra, REF=RE7105, Lot 710550), выдерживали 5 минут. Отмывали водой. Срезы докрашивали 0.02% раствором гематоксилина 30 секунд. Отмывали водой. Дегидратировали последовательно в спиртах 70°, 90°, 96°, 100° по 1 минуте. Затем в толуоле 5 минут. Помещали в заключающую среду Permanent Slide Mounting Medium (Novocastra, REF=7137, Lot 713708) под покровные стекла. Микроскопическое исследование проводили с использованием светового микроскопа Nikon 80L
[32]Установлено, что при летальных исходах, развившихся в течение нескольких часов после развития инфаркта миокарда, регистрировали ярко окрашенные нейтрофилы в сосудах периинфарктной зоны (Фиг.1, позиция А), а также ярко окрашенные нейтрофилы в зоне инфаркта (Фиг.1, позиция В).
[33]В срок давности инфаркта от 1-х до 2-х суток фиксировали дегрануляцию нейтрофилов, потерю окраски цитоплазмы нейтрофилов. Параллельно с этим была зафиксирована яркая окраска внеклеточного матрикса в зоне инфаркта, что отражает выделение ММР-9 из нейтрофилов в ткани (Фиг.2, позиция С). В случае летальных исходов в более поздние сроки (3-30 суток) отмечали окраску клеток фибробластического ряда в пограничной зоне. При этом максимальная выраженность окраски отмечена на 7-14 сутки (Фиг.3, позиция D).
[34]Авторы отмечают хорошую воспроизводимость предлагаемого способа - при окрашивании серийных срезов в разных партиях достигнуты идентичные результаты окрашивания.
[35]Таким образом, предлагаемый способ позволять четко дифференцировать срок давности наступления инфаркта миокарда при патоморфологическом исследовании. Данный способ может быть использован в медицине, а именно в патологической анатомии.
