[1]Техническое решение относится к области экологической и
промышленной (профилактической) токсикологии, а именно, к
аналитическому определению токсичности с применением биосенсора.
Изобретение может быть использовано для быстрой оценки индекса
токсичности образцов материалов, изделий и упаковок, включая полимеры и
полимерсодержашие материалы и изделия, а также товары для детей,
изготовленных из полимерных и текстильных материалов, материалов,
контактирующих с пищевыми продуктами (за исключением - целлюлозно-
бумажной продукции).
[2]Известен способ токсиколого-гигиенической оценки материалов, изделий
и объектов окружающей среды, основанный на применении спермы крупного
рогатого скота (КРС) (Биотестирование продукции из полимерных и других
материалов.: Методические указания. - М.: Информационно-издательский
центр Госкомсанэпиднадзора России, 1996. -11 с.). Тест-объектом является КРС,
а тест-реакцией - двигательная активность КСР. Оценка токсичности
производится с применением анализатора токсичности АТ-05, принцип работы
которого основан на анализе микроскопических видеоизображений суспензии
сперматозоидов.
[3]Известен способ определения токсичности полимеров, материалов и
изделий с помощью, основанный на способности специфических
микроорганизмов изменять интенсивность спонтанной биолюминесценции при
наличии в анализируемых пробах токсических веществ различной химической
природы (MP 01.018-07 Методика определения токсичности химических
веществ, полимеров, материалов и изделий с помощью биотеста "Эколюм", MP
от 15.06.2007 N 01.018-07), что регистрирует прибор экологического
(токсикологического) контроля «БИОТОКС».
[4]Оба способа совместно с устройствами позволяет определять острую токсичность. Недостатками этих способов оценки токсичности являются ложноположительные или ложноотрицательные результаты биотестирования, вызванные как специфической реакцией тест-объекта на воздействие токсикантов, так и другими факторами внешней среды. Вследствие этого предпочтительно комплексное использование нескольких биотестов, взаимно дополняющих друг друга по чувствительности к различным группам веществ. Рекомендуется проводить одновременное применение нескольких систем биотестирования, использующих разные жизненные функции (тест-реакции) тест-организмов. Применение дыхательной активности микроорганизмов в качестве тест-реакции на присутствие токсикантов в комбинации с оксиметрами позволяет расширить возможности применения биотестирования.
[5]Наиболее близкими по своим признакам способ и устройство для оценки токсичности, принятыми за прототип являются способ экспресс-определения индекса токсичности с применением биосенсора, описанные в работе авторов изобретения:Чепкова И.Ф., Ануфриев М.А., Понаморева О.Н., Алферов В.А., Решетилов А.Н., Щеглова В.А., Петрова С.Н. Применение биосенсора на основе иммобилизованных микроорганизмов для оценки токсичности продукции бытового назначения и товаров для детей. //Токсикологический вестник. 2010. V. 100, № 1, С. 34-40.
[6]Способ оценки токсичности основан на регистрации дыхательной активности целых клеток микроорганизмов, иммобилизованных на поверхности кислородного электрода. Измерительная система для оценки токсичности состояла из гальванопотенциостата, кислородного электрода и биораспознающего элемента на основе иммобилизованных в агаровый гель целых клеток бактерий Escherichia coli К-12. К недостаткам прототипа относится следующее: 1) аналитический сигнал представлен значениями силы тока (нА), поэтому изменение дыхательной активности целых клеток микроорганизмов выражают как изменение силы тока во времени (нА/мин), а не изменение потребления кислорода (г O2/дм3*мин), что затрудняет
[7]интерпретацию результатов; 2) требуется время для адаптации микроорганизмов в течение суток после иммобилизации в агаровый гель (СКО более 7 %); 3) среднее время проведения единичного измерения с учетом троекратного промывания рецепторного элемента буферным раствором 10-15 мин; 4) неоднородность распределения целых клеток микроорганизмов в агаровом геле приводила к снижению воспроизводимости результатов; 5) стабильность биосенсора (при СКО не более 7%) - не более 14 дней; 6) отсутствие стандартного образца положительного контроля, что не позволяет контролировать качество биосенсорного анализа; 7) отсутствие четкого критерия оценки токсичности.
[8]Задачей предлагаемого технического решения является упрощение способа оценки токсичности продукции из полимерных и текстильных материалов и улучшение достоверности результатов санитарно-гигиенической экспертизы путем увеличения стабильности биораспознающего элемента биосенсора и сравнительной оценке дыхательной активности иммобилизованных микроорганизмов в присутствии анализируемых проб.
[9]Способ оценки токсичности товаров из полимерных и текстильных материалов, заключающийся в том, что используют биосенсор на основе кислородного электрода, иммобилизуют целые клетки микроорганизмов на поверхность кислородного электрода, измеряют дыхательную активность микроорганизмов в присутствии пробы, оценивают токсичность проб, причем иммобилизуют целые клетки бактерий E.coli К-12 на поверхность кислородного электрода с помощью полупроницаемой мембраны, измеряют дыхательную активность с помощью термооксиметра, дополнительно используют стандартные образцы положительного и отрицательного контроля, рассчитывают индекс токсичности по следующей формуле:
[10]Т = (Rпроб - Rотр) / (Rпол - Roтp),
[11]где Т - индекс токсичности,
[12]Rпроб - ответ биосенсора на образец анализируемой пробы, О2мкг/дм3*с;
[13]Rпол - ответ биосенсора на образец положительного контроля, O2мкг/дм3*с;
[14]Rотр - ответ биосенсора на образец отрицательного контроля, O2мкг/дм3*с,
[15]и оценивают токсичность пробы по величине индекса токсичности (Т):
[16]| Индекс токсичности (Т) | Степень токсичности образца |
| менее 1.0 | нетоксичен |
| 1.0-10.0 | токсичен |
| более 10.0 | сильнотоксичен |
[17]Предложенный способ оценки токсичности характеризуется простотой, быстрым временем анализа (выполняется за 10 минут), достоверностью результатов, а устройство для его реализации - длительным временем функционирования (не менее 30 дней) без потери активности микроорганизмов, иммобилизованных на поверхности кислородного электрода.
[18]Сущность предлагаемого изобретения поясняется рисунками и примерами. На фиг. 1 представлено предлагаемое устройство для оценки токсичности бытовой продукции. На фиг. 2 представлена последовательность действий для иммобилизации целых клеток микроорганизмов на кислородном электроде с помощью полупроницаемой мембраны и схема устройства кислородного электрода с иммобилизованными клетками микроорганизмов.
[19]Предлагаемое устройство содержит магнитную мешалку 1, на которой расположена измерительная кювета 2 с буферным раствором 3, в которую помещен кислородный электрод 4 с иммобилизованными микроорганизмами 5, термооксиметр 6 соединен с кислородным электродом 4 и компьютером 7.
[20]Кислородный электрод с иммобилизованными клетками микроорганизмов состоит из индикаторного электрода (платиновая проволока, запаянная в стекло) 8, электрода сравнения (серебряная проволока, покрытая хлоридом серебра) 9, корпуса электрода 10, газопроницаемой полиэтиленовой мембраны 11, суспензии клеток
[21]микроорганизмов 12; полупроницаемой мембраны 13, фиксирующего кольца 14. На полиэтиленовую мембрану 11 наносят суспензию клеток микроорганизмов 12 объемом 10,0 мм3. Полупроницаемую мембрану 13 с порами размером 0,2 мкм помещают сверху и фиксируют кольцом 14, обрезают излишки мембраны 13 и собирают электрод. Электрод 4 соединяют с термооксиметром 6 и помещают в измерительную кювету 2, заполненную буферным раствором 3. Способ оценки токсичности заключается в том, что регистрируют дыхательную активность иммобилизованных микроорганизмов с помощью термооксиметра, добавляют определенный объем контрольных или анализируемой проб (водных вытяжек из полимерных или текстильных материалов) и регистрируют изменение дыхательной активности микроорганизмов с помощью термооксиметра 6, результаты изменения содержания кислорода (ответ биосенсора R) выводятся на монитор компьютера 7. Проводят расчет индекса токсичности по формуле:
[22]Т = (Rпроб - Rотр) / (Rпол - Roтp),
[23]где Т - индекс токсичности;
[24]Rпpoб - ответ биосенсора на образец анализируемой пробы, O2мкг/дм3*с;
[25]Rпол - ответ биосенсора на образец положительного контроля (раствор ацетальдегида 2,0 мг/дм3), O2мкг/дм3*с;
[26]Rотр - ответ биосенсора на образец отрицательного контроля (дистиллированная вода), O2мкг/дм3*с.
[27]Токсичность оценивают по величине индекса токсичности:
[28]| Индекс токсичности (Т) | Степень токсичности образца |
| менее 1.0 | нетоксичен |
| 1.0-10.0 | токсичен |
| более 10.0 | сильнотоксичен |
[29]Наличие причинно-следственной связи между совокупностью существенных признаков заявляемого объекта и достигаемым техническим результатом показано в таблице 1.
[30]Пример. 1. Подготовка проб. Из рабочих образцов текстильных материалов и одежды вырезают элементарные образцы массой (3,00 ± 0,01) г. Испытуемые товары из полимерных материалов и резины измельчают на кусочки сечением (3х3)-(5х5) мм и отбирают элементарные образцы массой (3,00 ± 0,01) г. Элементарные образцы перемещают в стаканчики для взвешивания (бюксы) диаметром 30 мм с притертой пробкой, заливают 10 см дистиллированной воды, тщательно перемешивают, добиваясь полного смачивания образцов водой. Экстракцию всех образцов проводят в суховоздушном термостате при температуре 37°С в течение 1 ч.
[31]Пример 2. Приготовление стандартного образца положительного контроля. Стандартная проба положительного контроля - раствор ацетальдегида 2,0 мг/дм3 . Этот раствор готовят из основного раствора ацетальдегида с массовой концентрацией 100 мг/дм3. В мерную колбу вместимостью 50 см3 вносят 1,0 см3 основного раствора, доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают. Для приготовления основного раствора ацетальдегида в мерную колбу вместимостью 100 см3 добавляют 50 см3 дистиллированной воды, охлажденной до (10-15)°С. Затем колбу переносят на аналитические весы и с помощью пипет-дозатора добавляют (0,0100±0,0005) г ацетальдегида. Когда температура раствора в колбе достигнет 20°С, доводят объём до метки дистиллированной водой.
[32]Пример 3. Оценка токсичности. Кислородный электрод с иммобилизованными клетками бактерий E.coli К-12, погружают в измерительную кювету объемом 5 см3 с 1/15 моль/дм3 Na-K-фосфатного буферного раствора со значением рН 7,0 и регистрируют силу тока, отражающего содержание кислорода в среде (фоновое) с термооксиметра. Затем вносят последовательно пробы 100 мм3 : контрольные пробы (стандартные образцы отрицательного и положительного контроля) и анализируемую пробу (водную вытяжку из полимерных или текстильных материалов). Измерения проводят при непрерывном перемешивании с
[33]помощью магнитной мешалки при комнатной температуре. Стандартная проба положительного контроля - раствор ацетальдегида 2,0 мг/дм3. Стандартная отрицательная проба - дистиллированная вода. Между измерениями проб кювету и электрод промывают тремя порциями фонового раствора по 4 см3 с интервалом в 5 мин. Ответы биосенсора, выраженные в О2мкг/дм3*с, используют для расчета индекса токсичности: Т = (Rпроб - Rотр) / (Rпол - Rотр), где Т - индекс токсичности, Rпроб - ответ биосенсора на образец анализируемой пробы, О2мкг/дм3*с; Rпол - ответ биосенсора на образец положительного контроля, О2мкг/дм3*с; Rотр - ответ биосенсора на образец отрицательного контроля, О2мкг/дм3*с. Токсичность пробы оценивают по величине индекса токсичности:
[34]| Индекс токсичности (Т) | Степень токсичности образца |
| менее 1.0 | нетоксичен |
| 1.0-10.0 | токсичен |
| более 10.0 | сильнотоксичен |
[35]Предлагаемый способ оценки токсичности товаров из полимерных и текстильных материалов позволил упростить оценку токсичности и улучшить достоверность результатов санитарно-гигиенической экспертизы благодаря увеличению стабильности биораспознающего элемента до 30 дней функционирования при СКО не более 7%, возможности проведения анализа в первый день после иммобилизации микроорганизмов, использованию для оценки индекса токсичности Т.
[36]| Таблица 1 |
| Сравнение прототипа и предложенного изобретения |
| Виды технического результата и их размерность | Показатели фактические или расчетные | Объяснение улучшения показателей |
| Прототип | Заявляемого устройства |
| Возможность проведения анализа в первый день после иммобилизации микроорганизмов | Требуется время для адаптации микроорганизмов в течение суток (среднеквадратичное отклонение более 7%) | Возможно использование биосенсора для анализа в первый день после иммобилизации микроорганизмов (среднеквадратичное отклонение менее 7%) | В прототипе клетки микроорганизмов при иммобилизации в агаровый гель подвергаются нагреванию до 50-60°С, с учетом того, что хранятся они при низких температурах, такое воздействие высокой температуры приводит к стрессу и требуется время для адаптации. В заявляемом устройстве воздействие высоких температур исключено. |
| Среднее время проведения единичного измерения с учетом троекратного промывания рецепторного | 10-15 мин | 5-10 мин | Разница обусловлена тем, что в заявляемом устройстве нет механической преграды в виде агарового геля (как в прототипе), что увеличивает скорость диффузии кислорода и анализируемых веществ в пробе к ферментным системам клеток, |
| элемента буферным раствором | | | это сокращает время проведения анализа, увеличивает аналитический сигнал и чувствительность анализа |
| Долговременная стабильность, при среднеквадратичное отклонение не более 7% | Не более 14 дней | Не менее 30 дней | В прототипе клетки микроорганизмов вымываются из агарового геля, который постепенно разрушается, агаровый гель взаимодействует с веществами пробы, что снижает сходимость метода и время функционирования иммобилизованных микроорганизмов |
