[1]Изобретение относится к области фармакологии и медицины, а именно к новым фармацевтическим композициям и фармацевтическим наборам для лечения бактериальных инфекций и нового способа лечения заболеваний, связанных с бактериальными инфекциями, в том числе туберкулеза.
[2]До последнего времени изыскания в области терапии туберкулеза шли по направлению поиска новых действующих веществ и их комбинаций с известными лекарственными средствами (WO 1995/13807, опубл. 26.05.1995; ЕР 0650728 A1, опубл. 03.05.1995; EP 0398165 А1, опубл. 22.11.1990; US 5399558, опубл. 21.03.1995) либо создания новых лекарственных форм для таких известных лекарственных средств, как изониазид, рифампицин, этамбутол (WO 88/006038, опубл. 25.08.1988; US 5811088, опубл. 22.091998; RU 2143900 C1, опубл. 10.01.2000; RU 2087146 C1, опубл. 20.081997; RU 2125451 C1, опубл. 27.01.1999).
[3]Известна эффективная группа антибиотиков рифамицинов, относящихся к классу анзамицинов, образуемых при биосинтезе одним из видов актиномицетов, а также их полусинтетические производные. Наиболее широкими спектрами антимикробного действия и хорошей всасываемостью обладают, например, Рифампицин и Рифалазил - полусинтетические производные рифамицина SV.
[4]
[5]К Рифампицину чувствительны многие грамположительные микроорганизмы (минимальная подавляющая концентрация 0,001-0,1 мкг/мл) и большое число грамотрицательных бактерий (минимальная подавляющая концентрация 1-10 мкг/мл). В низких концентрациях действует на Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium complex, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Helicobacter pylory, Clostridium difficile, Bructlla spp., Legionella pntumophila, Rickettsia typhi, Mycobacterium leprae, Staphylococcus aureus, в т.ч. на метициллинрезистентные штаммы, Staphylococcus epidermidis, стрептококки; в высоких концентрациях - на некоторые грамотрицательные микроорганизмы (Escherichia coli, Klebsiella, Proteus, Neisseria meningitides, Neisseria gonorrhoeae, в т.ч. бета-лактамазообразующие). Активен в отношении Haemophilus influenza (в т.ч. устойчивых к Ампициллину и Хлорамфениколу), Haemophilus ducreyi и других грамположительных анаэробов. Уникальным свойством Рифампицина является высокая активность против микобактерий туберкулеза (минимальная подавляющая концентрация 0,005-0,5 мкг/мл), что определяет ведущее место этого антибиотика в основных схемах лечения туберкулеза. Рифампицин обладает высокой активностью против грамположительных кокков, в т.ч. множественноустойчивых, включая так называемые метициллинрезистентные. Более 95% пиогенных стрептококков, устойчивых к пенициллину и другим антибиотикам, а также пневмококки чувствительны к Рифампицину. К Рифампицину высокочувствительны возбудители сибирской язвы и патогенные клостридии. Рифампицин активен против многих штаммов бактероидов, протеев, провиденсий, возбудителей болезни легионеров, бруцеллеза. Рифампицин является одним из наиболее активных препаратов в лечении лепры. Он превосходит тетрациклины по активности в отношении хламидий - возбудителей трахомы, пситтакоза, лимфогранулемы. Рифампицин высокоэффективен против риккетсий Провачека.
[6]Механизм антимикробного действия Рифампицина отличается от всех других антибиотиков. Он подавляет синтез РНК путем образования комплекса с ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Этот эффект достаточно избирателен. Рифампицин действует бактерицидно на бактерии, находящиеся в стадии пролиферации, проникает внутрь клетки, подавляя находящегося там возбудителя. Устойчивость к Рифампицину быстро развивается, в процессе лечения. Для преодоления развития устойчивости к Рифампицину препарат назначают в сочетании с другими антибиотиками.
[7]Установлен синергизм Рифампицина с Эритромицином (в отношении стафилококков), с Тетрациклином (в отношении сальмонелл, эшерихий, шигелл), с Новобиоцином (в отношении сальмонелл). В отношении многих микроорганизмов выявлен синергидный или аддитивный эффект с Триметопримом. Поэтому применяют фиксированные сочетания Рифампицина с Триметопримом (препарат рифаприм). При лечении туберкулеза Рифампицин назначают лишь с другими туберкулостатиками (стрептомицином, этамбутолом, изониазидом). Рифампицин обладает высокой эффективностью при приеме внутрь: в некоторых тканях обнаруживается в концентрациях, превышающих наблюдаемую в сыворотке крови. Он проникает через гематоэнцефалический барьер, плацентарный барьер, клеточные мембраны; выводится главным образом с желчью.
[8]Рифалазил, также известный как КРМ-1648 или benzoxazinorifamycin [US 4690919, опубл. 01.09.1987; US 4983602, опубл. 08.01.1991; US 6316433, 13.11.2001; US 6566354, опубл. 20.05.2003], обладает антибактериальной активностью в отношении широкого спектра патогенов (включая Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium complex, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Helicobacter pylory Clostridium difficile, микобактерии, метициллинорезистентные штаммы Staphylococcus aureus и другие грамположительные полирезистентные бактерии и внутрибольничные инфекции), длительным периодом полувыведения (более 100 часов), а также высоким проникновением в клетки (>300:1). Все вышеизложенное свидетельствует о более высокой эффективности Рифалазила по сравнению со стандартными схемами терапии при целом ряде заболеваний, в том числе при туберкулезе и негонококковых уретритах.
[9]Рифалазил используют также для комбинированного лечения бактериальных инфекций, например, совместно с бета-лактамными ингибиторами, аминогликазидами, тетрациклинами, липопептидами, макролидами, кетолидами, линкозамидами, стрептогаминами, сульфаниламидами, оксазолидинонами, хинолонами, ципрофлоксацином и др. [US 20110117154, опубл. 19.05.2011].
[10]Рифабутин, так же как и вышеописанные препараты, обладает широким спектром антибактериального действия [http://www.rlsnet.ru/mnn_index_id_2345.htm]. Селективно ингибирует ДНК-зависимую РНК-полимеразу у чувствительных штаммов Высокоэффективен в отношении вне- и внутриклеточно расположенных Mycobacterium spp., b т.ч. Mycobacterium tuberculosis, комплекса Mycobacterium avium-intracellulare, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium xenopi. Более активен, чем Рифампицин, в отношении внутриклеточных микобактерий туберкулеза (при концентрациях, в 2,5 раза меньших). Для лечения активного туберкулеза применяется применять в комбинации с другими противотуберкулезными средствами. Оказывает иммуностимулирующее действие.
[11]Рифаксимин [http://www.rlsnet.ru/tn_index_id_36028.htm#opisanie-lekarstvennoj-formy] является антибактериальным препаратом широкого спектра действия. Необратимо связывается с бета субъединицей фермента бактерий, ДНК-зависимой РНК полимеразой и, следовательно, ингибирует синтез РНК и белков бактерий. В результате необратимого связывания с ферментом Рифаксимин проявляет бактерицидные свойства в отношении чувствительных бактерий. Препарат обладает широким спектром противомикробной активности, включающим большинство грамотрицательных и грамположительных, аэробных и анаэробных бактерий, вызывающих желудочно-кишечные инфекции, включая диарею путешественников. Высокоэффективен в отношении аэробов Staphylococcus spp., Enterococcus spp. и анаэробов Peptostreptococcus spp. и др. Препарат применяется для лечение желудочно-кишечных инфекций, вызываемых бактериями, чувствительными к рифаксимину, в т.ч. острых желудочно-кишечных инфекций, диареи путешественников, синдрома избыточного роста микроорганизмов в кишечнике, печеночной энцефалопатии, неосложненного дивертикулезного заболевания ободочной кишки и хронического воспаления кишечника.
[12]Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) указывает на необходимость создания новых комбинированных противотуберкулезных препаратов, содержащих специально подобранный набор лекарственных веществ с фиксированными дозам в одной таблетке, обеспечивающих оптимальный терапевтический эффект (Consilium Medicum, 1999, т.2, с.170-171. Ремедиум, 2000, 7, 8).
[13]Авторы данного изобретения неожиданно обнаружили, что рифамицины, в том числе Рифампицин и Рифалазил, в комбинации с индукторами интерферона, по сравнению с одним рифамицином или одним индуктором интерферона, проявляют высокий синергизм - более чем на порядок выше антиинфекционную активность.
[14]Предметом данного изобретения является фармацевтическая композиция в виде таблеток капсул или инъекций, помещенных в приемлемую упаковку, для лечения заболеваний, обусловленных бактериальными и внутрибольничными инфекциями, включающая рифамицин и индуктор интерферона в фармакологически эффективных дозах.
[15]Предпочтительным является использование в качестве Рифамицина Рифампицин, Рифалазил, Рифапентин, Рифаксимин или Рифабутин, а в качестве индуктора интерферона:
[16]Циклоферон, Ларифан, Амиксин, Гипорамин, Бропиримина, Имиквимода (Imiquimod), Резикуимода или IМО-2125.
[17]Индуктор интерферона Бропиримин описан в заявке WO 2007133800, опубл. 22.11.2007; Резикуимод описан в заявке US 20050239733, опубл. 27.10.2005; IMO-2125 описан в "IMO-2125, an agonist of TLR9, that induces endogenous IFN-alpha up-regulates broader range of gene expression profiles compared to exogenously added IFN-alpha in human PBMCS". J Hepatol 2010, 52 (Suppl. I): Abst 692.
[18]Более предпочтительной является фармацевтическая композиция, включающая в качестве рифамицина Рифампицин и в качестве индуктора интерферона Циклоферон.
[19]Также более предпочтительной является фармацевтическая композиция, включающая в качестве рифамицина Рифалазил и в качестве индуктора интерферона Циклоферон.
[20]В соответствии с данным изобретением фармацевтическая композиция предназначена для лечения заболеваний обусловленных Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium complex, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Helicobacter pylory.
[21]Фармацевтическая композиция также может содержать в качестве вспомогательных компонентов стабилизаторы, носители, разбавители и прочие добавки, обычно используемые для образования лекарственных форм.
[22]Предметом данного изобретения является фармацевтический набор, помещенный в приемлемую упаковку, для лечения заболеваний обусловленных бактериальными и внутрибольничными инфекциями, включающий в фармакологически эффективных дозах рифамицин в виде таблеток, капсул или инъекций, индуктор интерферона в виде таблеток капсул, или инъекций и инструкцию для администрирования компонентов этого фармацевтического набора.
[23]Предпочтительным является фармацевтический набор, предназначенный для лечения заболеваний, обусловленных Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium complex, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Helicobacter pylory.
[24]Предпочтительно фармацевтический набор включает в качестве рифамицина Рифампицин, Рифалазил, Рифапентин, Рифаксимин или Рифабутин, а в качестве индуктора интерферона Циклоферон, Ларифан, Амиксин, Гипорамин, Бропиримин, Имиквимод, Резикуимод или IMO-2125.
[25]Более предпочтительным является фармацевтический набор, включающий в фармакологически эффективных дозах Рифампицин в виде таблеток, капсул или инъекций, Циклоферон в виде таблеток, капсул или инъекций и инструкцию для администрирования компонентов этого фармацевтического набора.
[26]Также более предпочтительным является фармацевтический набор, включающий в фармакологически эффективных дозах Рифалазил в виде таблеток, капсул или инъекций, Циклоферон в виде таблеток, капсул или инъекций и инструкцию для администрирования компонентов этого фармацевтического набора.
[27]Предметом данного изобретения является также способ лечения заболеваний, связанных с бактериальными и внутрибольничными инфекциями, чувствительными к рифамицину, путем введения субъекту фармакологически эффективного количества новой фармацевтической композиции или эффективного количества комбинации рифамицина и индуктора интерферона из нового фармацевтического набора.
[28]Предметом данного изобретения является также способ лечения туберкулеза, туберкулеза, осложненного СПИДом, и других заболеваний, обусловленных Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium complex, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia trachomatis, Helicobacter pylory.
[29]Изобретение поясняется чертежами.
[30]На фиг.1 представлены результаты испытаний противотуберкулезной активности тестируемых препаратов на модели мышей, зараженных Mycobacterium tuberculosis (острая туберкулезная инфекция).
[31]Обозначения на фиг.1: Т3-титры микобактерий на день 3 (момент заражения); Т10 - титры микобактерий на день 10 (начало введения препаратов); Т31 - (CMC)- титры микобактерий в контроле (CMC) на день 31 (окончание введения препаратов); RMP - Рифампицин; R - Рифалазил; C - Циклоферон, CFU - (colonie-forming units)-инфекфионные (колониеобразующие) единицы в легких мыши.
[32]На фиг.2 представлены результаты испытаний активности тестируемых препаратов на модели мышей, зараженных Helicobacter pylori (инфицирует различные области желудка и двенадцатиперстной кишки)
[33]Обозначения на фиг.2: T1 - титры бактерий на день 1 (начало введения плацебо и препаратов); Т3 - титры бактерий на день 3; Т7 - (CMC)- титры бактерий в контроле (CMC) на день 7 (окончание введения препаратов); RMP - Рифампицин; R - Рифалазил; C - Циклоферон, CFU - (colonie-forming units)- инфекционные (колоние-образующие) единицы в желудке мыши.
[34]Изобретение иллюстрируется, но не ограничивается следующими примерами.
[35]Пример 1. Фармацевтический набор. Фармацевтический набор включает 7 таблеток Рифампицина, содержащих по 250 мг активной субстанции, 7-16 таблеток Циклоферона, содержащих по 300 мг активной субстанции, и инструкцию по применению.
[36]Пример 2. Фармацевтический набор. Фармацевтический набор включает 7 таблеток Рифалазила, содержащих по 25 мг активной субстанции, 7-16 таблеток Циклоферона, содержащих по 150 мг активной субстанции, и инструкцию по применению.
[37]Пример 3. Получение фармацевтических композиций. Смешивают один из рифамицинов и один из индукторов интерферона, в соотношении указанном в таблице, с соответствующими компонентами. Получают фармацевтические композиции.
[38]| | Рифамицин, мг | Индуктор интерферона, мг |
| 3а | Рифампицин - 150-500 (300)* | Циклоферон - 50-450 (300*) |
| 3б | Рифампицин - 150-500 (300)* | Имиквимод - 50-100 (25*) |
| 3в | Рифалазил-5-50 (25*) | Циклоферон - 50-450 (150*) |
| 3г | 5-50 (25*) | Амиксин-100-500 (150*) |
| 3д | 5-50 (25*) | Гипорамин - 20-200 (100*) |
| 3е | 5-50 (25*) | Бропиримин - 500-3000 (750*) |
| 3ж | 5-50 (25*) | Резикуимод - 0.05-5.0 (1*) |
| 3з | 5-50 (25*) | IMO-2125 - 5.0-50 (15*) |
| 3и | 5-50 (25*) | Имиквимод - 50-100 (25*) |
| 3к | 5-50 (25*) | Ларифан - 0,05-5.0 (0.1*) |
| * Предпочтительный состав |
[39]Пример 4. Получение лекарственного средства в форме таблеток. Смешивают 11200 мг крахмала, 11200 мг измельченной лактозы, 2800 мг талька, 1000 мг Рифалазила и 6000 мг Циклоферона. Полученный брусок измельчают в гранулы и просеивают через сита, собирая гранулы размером 14-16 меш. Полученные гранулы таблетируют в подходящую форму таблетки весом 370 мг каждая.
[40]Пример 5. Получение лекарственного средства в форме капсул. Тщательно смешивают Рифалазил и Циклоферон с порошком лактозы в соотношении 1:6:4. Полученную порошкообразную смесь упаковывают по 275 мг в желатиновые капсулы подходящего размера.
[41]Пример 6. Получение лекарственного средства в инъекционной форме. Растворяют 0,15 г Рифампицина и 0,15 г Циклоферона в 2,5 мл стерильной воды для инъекций, энергично встряхивают ампулу с порошком до полного растворения, полученный раствор разводят в 125 мл 5% раствора глюкозы. Получают инъекционный раствор для внутриывенного введения.
[42]Пример 7. Определения противотуберкулезной активности тестируемых препаратов на модели мышей, зараженных Mycobacterium tuberculosis (острая туберкулезная инфекция).
[43]Самки мышей линии BALB/c весом 19-20 г. заражались Mycobacterium tuberculosis Erdman (каталог АТСС 35801) в камере для аэрозольной инфекции (Glas-Col, Terra Haute, IN). В распылитель вводили 10 мл суспензии микобактерий, содержащей 5 млн/мл инфекционных (колониеобразующих) единиц. Через 3, 10 и 31 день после инфекции не получавшие тестируемые препараты мыши подвергались эвтаназии при помощи асфиксии углекислым газом, обе половины легких удаляли и гомогенизировали в стерильных условиях в 3 мл стерильного раствора Хэнкса (Hanks Balanced Salt Solution, HBSS). Серийные 10-кратные разведения суспензий в растворе Хэнкса высевали на 6-луночные планшеты с агаром (Middlebrook 7H11). Планшеты инкубировали при 37°С в течение 18-21 дня, после чего определяли титры инфекционных (колониеобразующих) единиц.
[44]Тестируемые вещества (Рифампицин, Рифалазил, Циклоферон, Рифампицин+Циклоферон, Рифалазил + Циклоферон) растворяли в 0,5% карбоксиметилцеллюлозы, и 200 мкл вводили мышам (8 мышей в дозовой группе) внутрижелудочно ежедневно на 10-14, 17-21 и 24-28-й день после инфекции. Всех мышей, получивших тестируемые вещества или плацебо (0,5% карбоксиметилцеллюлозу), подвергали эвтаназии на 31-й день после инфекции и определяли титры инфекционных единиц в гомогенатах легких.
[45]Эвтаназия. Помещают мышей в камеру с углекислым газом. Убеждаются в том, что все животные подверглись эвтаназии. Помещают мышей в 70% раствор этилового спирта на 10 минут.
[46]Получение легочных тканей. Помещают 2-3 стерильные салфетки на операционный столик. Извлекают мышь из раствора спирта, распластывают на столике. Фиксируют при помощи булавок. Делают разрез вдоль диафрагмы и через ребра. Вскрывают грудную клетку, фиксируют ребра по обе стороны при помощи игл (сменить иглы для каждого животного, чтобы избежать контаминации). Аккуратно извлекают легкие и помещают их в пробирку с раствором Хэнкса, которую помещают на лед. Заворачивают оставшиеся части в салфетку и помещают в контейнер для биологических отходов.
[47]Обработка тканей. Обрабатывают гомогенизатор 70% этанолом, затем стерильным физиологическим раствором, протирают стерильной салфеткой. Гомогенизируют образцы легких 10-20 секунд или до тех пор, пока не будут наблюдаться маленькие кусочки тканей. Перед каждым новым образцом обрабатывают гомогенизатор 70% этанолом, затем стерильным физиологическим раствором и протирают стерильной салфеткой. Обрабатывают пробирку с гомогенатом ультразвуком в течение 15 секунд при помощи соникатора. Вносят 100 мкл. гомогената в лунку 24-луночного планшета и перемешивают. Приготавливают серийные 10-кратные разбавления. Вносят по 100 мкл разбавлений в 6-луночные планшеты с агаром. Распределяют разбавления равномерно по поверхность агара и высушивают на воздухе. Переворачивают планшеты с агаром и помещают в инкубатор при 37°С. Инкубируют как минимум 18 дней, после чего подсчитывают колонии микобактерий.
[48]Снижение титров микобактерий в легких мышей после 3-недельной администрации препаратов по сравнению с контролем (CMC) на день 31:
[49]Рифалазил, 2.5 мг/кг/день 87 раз;
[50]Циклоферон, 30 мг/кг/день 1.08 раз;
[51]Рифалазил, 2.5 мг/кг/день + Циклоферон, 30 мг/кг/день 1222 раза;
[52]Рифампицин, 20 мг/кг/день + Циклоферон, 30 мг/кг/день 561 раз.
[53]Как видно из представленных данных, Циклоферон в дозе 30 мг/кг/день не активен, Рифалазил (2.5 мг/кг/день) в 87 раз снижает титры микобактерий в легких мышей после 3-недельной администрации препаратов по сравнению с контролем (CMC) на день 31, а комбинация Рифалазила (2.5 мг/кг/день) с Циклофероном (30 мг/кг/день) дала синергизм и в 1222 раза снизила титры микобактерий в легких мышей после 3-недельной администрации препаратов по сравнению с контролем (CMC) на день 31, таким образом, эта комбинация в 14 раз (1222: 87=14,04) активнее чистого Рифалазила.
[54]Определение активности тестируемых препаратов на модели мышей, зараженных Mycobacterium avium complex (микобактериоз) или Chlamydia pneumonia (пневмония), проводили аналогично описанному выше. Фармацевтические композиции Рифалазил+Циклоферон и Рифампицин+Циклоферон показали синергетический эффект.
[55]Пример 8. Определения активности тестируемых препаратов на модели мышей, зараженных Helicobacter pylori (инфицирует различные области желудка и двенадцатиперстной кишки)
[56]Мыши линии С57В1/6 заражались Helicobacter pylori штамм SS1. Им вводили по 107инфекционных (колониеобразующих) единиц. Через 1, 3 и 7 день после инфицирования не получавшие тестируемые препараты мыши подвергались эвтаназии при помощи асфиксии углекислым газом, желудок удаляли и гомогенизировали в стерильных условиях в 3 мл стерильного раствора Хэнкса (Hanks Balanced Salt Solution, HBSS). Серийные 10-кратные разведения суспензий в растворе Хэнкса высевали на 6-луночные планшеты с агаром (Middlebrook 7H11). Планшеты инкубировали при 37°С, после чего определяли титры инфекционных (колониеобразующих) единиц.
[57]Тестируемые вещества (Рифампицин, Рифалазил, Циклоферон, Рифампицин+Циклоферон, Рифалазил+Циклоферон) растворяли в 0,5% карбоксиметилцеллюлозы, и 200 мкл вводили мышам (5 мышей в дозовой группе) внутрижелудочно по два раза ежедневно в течение 7 дней не менее чем через неделю после инфицирования. Всех мышей, получивших тестируемые вещества или плацебо (0,5% карбоксиметилцеллюлозу), подвергали эвтаназии через 12 часов после последней дозы препарата и определяли титры инфекционных единиц в гомогенатах желудков. Далее исследования и определение активности проводят аналогично примеру 7.
[58]Снижение титров бактерий в желудках мышей после недельной администрации препаратов по сравнению с контролем (CMC) на день 7:
[59]Рифалазил, 1 мг/кг/день 64 раза;
[60]Рифампицин, 20 мг/кг/день 37 раза;
[61]Циклоферон, 30 мг/кг/день 1.03;
[62]раз Рифалазил, 1 мг/кг/день + Циклоферон, 30 мг/кг/день 704 раза;
[63]Рифампицин, 20 мг/кг/день + Циклоферон, 30 мг/кг/день 349 раз.
[64]Как видно из представленных данных, Циклоферон в дозе 30 мг/кг/день не активен, Рифалазил (1 мг/кг/день) в 64 раз и Рифампицин (20 мг/кг/день) в 37 раз снижает титры бактерий в желудках мышей после недельной администрации препаратов по сравнению с контролем (CMC) на день 7, а комбинация Рифалазила (1 мг/кг/день) с Циклофероном (30 мг/кг/день) дала синергизм и в 704 раза снизила титры бактерий в желудках мышей после недельной администрации препаратов по сравнению с контролем (CMC) на день 7, таким образом эта комбинация в 11 раз (704: 64=11) активнее чистого Рифалазила. Комбинация Рифампицина (20 мг/кг/день) с Циклофероном (30 мг/кг/день) также дала синергизм и в 349 раз снизила титры бактерий в желудках мышей после недельной администрации препаратов по сравнению с контролем (CMC) на день 7, таким образом эта комбинация в 9 раз (349: 37=9,43) активнее чистого Рифампицина.
