[1]Полезная модель относится к области биохимии и молекулярной биологии, а именно к микрофлюидным чипам для энзиматического синтеза олигонуклеотидов.
[2]Микрофлюидные методы оперируют очень малыми объемами газов, жидкостей, микропузырьков, микрокапель и других структур с границей раздела сред, с кристаллическими и полимерными допантами, даже с отдельными биологическими объектами такими как ферменты, олигонуклеотиды и клетки, за которыми можно наблюдать в процессе исследования, синтеза, а также с высокой точностью манипулировать процессами, протекающими внутри микрофлюидных устройств. Основной функцией микрофлюидного устройства является управление микро-, нано- и пиколитровыми объемами реактивов, в полностью изолированных, закрытых системах, что позволяет избегать контаминации, а также осуществлять с высокой скоростью подготовку проб и экспериментов с минимальными затратами расходников.
[3]Из уровня техники известна микрофлюидная система для прокачивания реактивов, которая снабжена пассивными клапанами, открывающимися только в одном направлении за счёт деформации мембраны при избыточным давлении (см. патент US7241421B2, кл. B01L3/00, опубл. 10.07.2007). Недостатками известного устройства являются ограниченная функциональность и невозможность повторного использования.
[4]Наиболее близким по технической сущности к предлагаемой полезной модели является микрофлюидный чип для энзиматического синтеза олигонуклеотидных последовательностей, содержащий основание с профилированными желобами и крышку с мембраной, формирующие систему проточных каналов с управляемыми клапанами, образованными ступенчатыми выступами в указанных желобах и прилежащим участком мембраны, причём указанная система содержит единый канал подачи промывочного раствора, подведенные к нему каналы подачи нуклеотид трифосфатов и реакционный отсек в виде камер, содержащих твердую фазу с прикреплёнными к ней праймерами (см. патент US8222023B2, кл. C12M1/34, опубл. 17.07.2012). Основным недостатком известного устройства является его ограниченная функциональность, обусловленная одновременным открытием или закрытием всех клапанов, ведущих к камерам реакционного отсека, что позволяет в одном чипе формировать последовательности только одного вида.
[5]Технической проблемой является устранение указанных недостатков и создание многоразового устройства, реализующего последовательную подачу и отведение малых объёмов реактивов для проведения ферментативного синтеза олигонуклеотидов на твердой фазе, при котором исключаются неконтролируемые изменения подаваемых объёмов (в том числе перекрёстное смешение проб и реагентов), их концентраций и скорости подачи, которое позволяет дозировать подачу реактивов, уменьшить их расход в силу уменьшения не эффективно используемого объема жидкости (мертвого объема), а также реализует возможность управления параметрами синтезируемой последовательности и одновременного синтеза нескольких независимых последовательностей, при этом увеличив их полезный выход.
[6]Технический результат заключается в расширении функциональных возможностей микрофлюидного чипа. Поставленная проблема решается, а технический результат достигается тем, что в микрофлюидном чипе для энзиматического синтеза олигонуклеотидных последовательностей, содержащем основание с профилированными желобами и крышку с мембраной, формирующие систему проточных каналов с управляемыми клапанами, образованными ступенчатыми выступами в указанных желобах и прилежащим участком мембраны, причём указанная система содержит единый канал подачи промывочного раствора, подведенные к нему каналы подачи нуклеотид трифосфатов и реакционный отсек в виде камер, содержащих твердую фазу с прикреплёнными к ней праймерами, каждая такая камера реакционного отсека подведена к собственному отводному каналу через полупроницаемый клапан, выполненный с возможностью пропускания жидкости и запирания твердой фазы, причём каждый канал подачи нуклеотид трифосфатов и каждая камера реакционного отсека подведены к единому проточному каналу через собственный независимый управляемый клапан. Праймеры на свободном конце предпочтительно снабжены защитной группой, а к проточному каналу перед реакционным отсеком через собственный независимый управляемый клапан подведен канал подачи деблокирующего реагента, снимающего эту защитную группу. При этом канал подачи деблокирующего реагента, выполнен таким образом, что площадь его поперечного сечения составляет не более половины площади поперечного сечения проточного канала. Каждый канал подачи нуклеотидов предпочтительно тоже выполнен таким образом, что площадь его поперечного сечения составляет не более половины площади поперечного сечения проточного канала. К проточному каналу перед реакционным отсеком через собственный независимый управляемый клапан может быть подведен канал подачи реактива, отделяющего синтезированную олигонуклеотидную последовательность от твердой фазы. Полупроницаемый клапан и отводные каналы предпочтительно выполнены таким образом, чтобы обеспечить возможность выгрузки и повторной загрузки твердой фазы. Твердая фаза предпочтительно выполнена в виде стеклянных микросфер. Мембрана может быть выполнена эластичной, а управляемые клапаны образованы полостями в крышке, которые снабжены коннекторами, обеспечивающими возможность герметичного подключения к пневматическому рукаву. Мембрана также может быть выполнена из электрополимерного материала, а управляемые клапаны образованы установленными в крышке электродами. Основание и крышка с мембраной предпочтительно выполнены из оптически прозрачного в видимой части спектра материала.
[7]На фиг.1 представлена схема предлагаемого микрофлюидного чипа;
[8]на фиг.2 – камера его реакционного отсека;
[9]на фиг.3 – поперечное сечение канала с пневматически управляемым клапаном;
[10]на фиг.4 – схема расположения каналов и элементов реакционного отсека;
[11]на фиг.5 – схема расположения полостей в крышке для формирования пневматически управляемых клапанов.
[12]Предлагаемый микрофлюидный чип для энзиматического синтеза олигонуклеотидных последовательностей представляет собой сборный корпус, образованный основанием 1, крышкой 2 и расположенной между ними мембраной 3. Элементы 1-3 выполняют из оптически прозрачных в видимой части спектра материалов, например, полидиметилсилоксан (ПДМС) для обеспечения возможности визуального наблюдения за реакциями в чипе с помощью флуоресцентной микроскопии. Размеры чипа обусловлены требуемыми реакционными объёмами и габаритами обслуживающего оборудования установки-контроллера. Все материалы являются химически инертными для протекающих реактивов внутри. Могут быть применены материалы, такие как силикон, ПДМС, ПММА, тефлон и другие, но не ограничены ими. В зависимости от применяемого материала могут изменяться методы сборки микрофлюидного устройства.
[13]В основании 1 выполнены профилированные желоба, которые в сборе с крышкой 2 и мембраной 3, формируют систему проточных каналов 4 с управляемыми клапанами 5. Каналы 4 снабжены входными технологическими отверстиями 6 для подключения входных капилляров. Указанная система содержит единый канал 4’ подачи промывочного раствора, подведенные к нему каналы 4’’ подачи нуклеотид трифосфатов, канал 4’’’ подачи деблокирующего реагента и канал 4’’’’ подачи реактива, отделяющего синтезированную олигонуклеотидную последовательность. Единый канал 4’ подачи промывочного раствора ведёт к реакционному отсеку, который выполнен в виде камер 7, содержащих твердую фазу с прикреплёнными к ней праймерами (затравочными последовательностями, которые на свободном конце снабжены защитной группой, снимаемой деблокирующим реагентом, для предотвращения неконтролируемых реакций). Твердая фаза предназначена для увеличения площади поверхности, на которой протекает синтез олигонуклеотидов, и предпочтительно представляет собой стеклянные микросферы 8, но так же может быть выполнена в виде функционализированной поверхности, наностолбиков и т.п. Каждая камера 7 подведена к собственному отводному каналу 9 через полупроницаемый клапан 10. Для расширения функциональных возможностей чипа и синтезирования различных последовательностей (в том числе одновременно в разных камерах 7) каждый канал 4’’, 4’’’, 4’’’’ и каждая камера 7 подведены к единому каналу 4’ подачи промывочного раствора через собственный независимый управляемый клапан 5, что гарантировано предотвращает перекрёстное смешение реагентов и позволяет контролировать поступление реактивов в реакционный отсек.
[14]Клапаны 5 образованы ступенчатыми выступами 11, выполненными в профиле дна желобов каналов 4, и прилежащим участком мембраны 3. Мембрана 3 может быть выполнена из электрополимера или просто эластичного материала (например, эластомера), который за счет упругих деформаций перекрывает или наоборот открывает поток над выступом 11. Для случая электрополимера в крышке 2 устанавливают электроды (на чертежах не показано), которые и образуют управляемые клапаны 5.
[15]В случае обычной эластичной мембраны 3 управляемые клапаны могут быть выполнены пневматическими и образованы полостями 12 в крышке 2, в которые нагнетается воздух из пневматического рукава, герметично подключенного к специальному коннектору.
[16]Полупроницаемый клапан 10 при этом может также быть выполнен пневматическим, но не содержать противолежащего выступа 11 – тогда между мембраной 3 и дном желоба остаётся небольшой зазор, обеспечивающий прохождение жидкости (отработанных реагентов), но запирание твёрдой фазы в виде микросфер 8, имеющих больший радиус, чем размер протока. В этом случае при снятии давления с клапана 10 обеспечивается возможность выгрузки и повторной загрузки микросфер 8 через отводные каналы 9 и выходные отверстия 13, которые для этого выполняют достаточно широкими. Данная особенность позволяет загружать в чип твердую фазу несколько раз и делает микрофлюидное устройство многоразовым. Клапан 10 закрыт на протяжении всего синтеза олигонуклеотидов и открывается только для изъятия отработанных микросфер 8 после этапа расщепления и финальной очистки микрофлюидного чипа от продуктов реакции ферментативного синтеза олигонуклеотидов.
[17]Для предотвращения попадание микросфер 8 в канал 4’ подачи промывочного раствора соответствующий вход камер 7 снабжён микрофлюидными ловушками 14. Данное решение позволяет снизить гидродинамическое сопротивление без риска контаминации растущих последовательностей.
[18]Каналы 4’’, 4’’’, 4’’’’ выполняют площадью поперечного сечения, составляющей не более половины площади поперечного сечения канала 4’ подачи промывочного раствора, что позволяет снизить гидродинамическое сопротивление системы, поскольку при добавлении полупроницаемых клапанов 10 общее гидродинамическое сопротивление возрастает и увеличивает необходимое для прокачивания давление, что, в свою очередь, повышает требования к размерам и прочностным характеристикам чипа.
[19]Количество вводных отверстий каналов 4, реакционных камер 7 и клапанов 5, 10 может быть больше чем представлено на чертежах. Увеличение количества функциональных деталей микрофлюидного устройства может быть необходимо для оптимизации синтеза и автоматизации работы с микрофлюидным устройством. Подача реактивов осуществляется внутрь микрофлюидного чипа с помощью создания разряжения или избытка давления жидкости на входе и выходе из микрофлюидного чипа.
[20]Сборка предлагаемого микрофлюидного чипа осуществляется в следующем порядке.
[21]Сначала изготавливают мастер-формы основания 1, крышки 2 и мембраны 3 для заливки, может использоваться, например, 3D печать, лазерная гравировка или литография. Из всех методов литография обладает наиболее высоким разрешением и рекомендуется для создания подобных мастер-форм. Для формирования рельефа мастер-формы использовалась метод трёхстадийного плазмохимического травления (Bosch Process), с магнетронным напылением металлической маски.
[22]Характерные размеры каналов 4 могут варьироваться от 1 до 500 мкм в ширину, а глубина каналов от 200 нм до 100 мкм. Длина основания 1, крышки 2 и мембраны 3 должна быть сравнима друг с другом и лежать в диапазоне от 20 до 100 мм. Толщина чипа лежит в диапазоне от 3 до 10 мм и зависит от предполагаемого расхода реактивов в секунду, а также толщины каналов 4. Ширина чипа составляет около 10 мм и более, с целью упрощения размещения вводов и выводов для управления пневматическими клапанами 5 и трубок с реагентами. Для создания функциональных элементов чипа, в подходящую мастер-форму заливают любым оптически прозрачным полимером, инертным к реактивам ферментативного синтеза олигонуклеотидов. Обычно применяется полидиметилсилоксан (ПДМС), но также возможно применение силикона, ПММА и других материалов для заливки. В данном примере создавался чип на основе ПДМС при соотношении отвердителя к мономеру 1:10. Не отверждённую смесь дегазируют в термовакуумном шкафу для удаления воздушных пузырьков, что позволяет с лучшей точностью повторить структуру мастер-формы. Полимеризация ПДМС происходит в термовакуумном шкафу при температуре 70-95 градусов в течение 2-4 часов. Вводные отверстия 6 каналов 4 – сквозные и формируются ручным сверлом с плоско заточенной иглой. Слои склеиваются плазмохимическим методом в кислородной среде, для формирования наиболее чистого соединения слоёв без внесения дополнительных материалов или адгезива, но не ограничиваются только плазмохимическими методами. Совмещение слоёв производится по реперным точкам и клапанам. При склеивании нужно убедиться, что выступы 11 не касаются разделительной мембраны 3, чего можно достичь на этапе литографии, сделав выступ 11 ниже, или модифицировать участки соприкосновения таким образом, чтобы плазмохимическая обработка материала не затронула выделенный участок ПДМС или после обработки на данном участке слоя образовалась защитная плёнка препятствующая склеиванию. Это может быть выполнено с помощью нанесения фоторезиста или любого другого покрытия на выбранные участки канала 4 или мембраны 3.
[23]После сборки чипа, в вводные отверстия 6 и отверстия пневматических полостей 12 вставляют плоско заточенные иглы-коннекторы, по которым осуществляется подача реактивов или воздуха.
[24]Мембрану 3 изготавливают из ПДМС (Dow Corning Sylgard 184) толщиной не более 200 мкм. Основание 1 и крышку 2 изготавливают из ПДМС (Dow Corning Sylgard 184) толщиной не более 4 мм.
[25] Камеры 7 выполняют размером не более 3 мм в ширину и не боле 2 см в длину. Количество камер 7 может быть обусловлено требованиями параллельного синтеза нескольких различных последовательностей олигонуклеотидов одновременно или необходимым объёмом нарабатываемого материала.
[26]Ко всем коннекторам полостей 12 через пневматические рукава подключается насос, способный нагнетать или откачивать воздух, тем самым позволяя управлять клапанами 5 и 10.
[27]Предлагаемый микрофлюидный чип работает следующим образом.
[28]Ферментативный синтез на твердой фазе должен происходить в соответствии со следующими этапами:
[29]внесение твердой фазы с привязанными к ним праймерами (начальными последовательностями), которые имеют защитную группу на свободном конце не позволяющую присоединения и удлинения предварительной короткой последовательности;
[30]очистка, т.е. удаление среды носителя твердой фазы и остаточных реактивов, разблокирование свободного конца праймера;
[31]связывание, т.е. введение буфера или любого другого раствора носителя, содержащего ферменты, выполняющие роль удлинения последовательности и их блокировки, обычно для связывания используют 1X Terminal transferase reaction buffer, terminal transferase, dNTP-3’-ONH2;
[32]разблокирование, т.е. удаление остатков предыдущего фермента введения реагентов для удаления ферментной блокировки (как правило, используют ферменты щелочной фосфатазы и NaNO2), после чего повторяется этап связывания до момента получения желаемой последовательности;
[33]расщепление, т.е. финальный этап синтеза, при котором происходит удаление полученной последовательности с твердой фазы и сбора результата синтеза.
[34]При реализации ферментативного синтеза на твёрдой подложке с помощью предлагаемого чипа в изначальном положении все управляемые клапаны 5 закрыты. При формировании вакуума в полости 12, мембрана 3 отклоняется в сторону меньшего давления и отрывается от выступа 11, после чего поток соответствующей жидкости свободно проходит через открытый клапан 5.
[35]Полупроницаемые клапаны 10 в изначальном положении открыты. При формировании избыточного давления в полости 12, мембрана 3 отклоняется в сторону области с меньшим давлением и частично перекрывает область клапана 10, увеличивая гидравлическое сопротивление и не позволяя микросферам 8 покинуть реакционную камеру 7.
[36]Для начала процесса управляющий клапан 5 канала 4’ подачи промывочного раствора открывают путем создания вакуума с помощью насоса подключенного к соответствующему пневматическому рукаву. Управляемые клапаны 5 каналов 4’’, 4’’’, 4’’’’ находятся в изначальном состоянии. Необходимое для открытия клапана значение вакуума, создаваемого насосом, определяется толщиной мембраны 3, её жесткостью и размерами клапана 5.
[37]Через выходные отверстия 13 отводных каналов 9 поступает среда носитель, содержащая твердую фазу, при этом открыты только полупроницаемые клапаны 10 и управляющие клапаны 5 канала 4’ подачи промывочного раствора и камер 7. Объем и скорости потоков подаваемых реактивов зависят от геометрических параметров микрофлюидных каналов 4, мертвых объемов трубок, коннекторов и внутреннего объема реакционного отсека. После заполнения камер 7 микросферами 8 полупроницаемые клапаны 10 закрываются путем подачи избыточного давления, а подача среды носителя и твердой фазы через отводные каналы 9. При необходимости трубки, подсоединённые к отводным каналам 9, заменяют, а микрофлюидное устройство промывают. Для промывки через входное отверстие 6 канала 4’ подачи промывочного раствора пропускается среда носитель или любая допустимая жидкость (обычно для промывки используются деионизированная вода и протеолитические ферменты), не вступающая в реакцию с рабочими поверхностями чипа, праймерами и твердой фазой.
[38]Для разблокирования защитной группы, блокирующей свободный конец праймеров на микросферах 8, через канал 4’’’ подачи деблокирующего реагента подают реагенты для снятия этой защитной группы, для чего открывают соответствующий клапан 5. Клапаны 5 на входе в камеры 7 также остаются открытым. После окончания ввода реагента клапан 5 канала 4’’’ закрывают путём увеличения давления в соответствующей полости 12. Этап разблокирования лучше проводить при пониженных температурах, но не ниже 10 ºC.
[39]Для процедуры удлинения последовательностей в выбранные камеры 7, подают ферменты с соответствующим нуклеотидом. Для этого открывают соответствующие клапаны 5 камер 7 и каналов 4’’ подачи различных нуклеотид трифосфатов. Для улучшения процесса удлинения последовательности возможно внедрение дополнительного нагрева в систему, для этого устройство можно разместить в термоциклируемой системе с температурой нагрева до 50 ºC.
[40]Этап отделения синтезированных олигонуклеотидных последовательностей от твердой фазы осуществляется путём подачи через канал 4’’’’ подачи реактива, разрушающего линкер, связывающий микросферу 8 с присоединённым концом праймера. Этот канал 4’’’’ аналогичным образом отделен от проточного канала 4’ управляемым клапаном 5, открываемым с помощью создания вакуума в соответствующей полости 12. Затем через входное отверстие 6 канала 4’ подачи промывочного раствора пропускается среда носитель, выводя синтезированные олигонуклеотидные последовательности отводные каналы 9. После сбора готовых последовательностей полупроницаемые клапаны 10 открывают и удаляют отработанные микросферы 8 из камер 7 через отводные каналы 9 путем подачи больших потоков жидкости через канал 4’ подачи промывочного раствора. После чего чип снова готов к использованию.
[41]Насосы или любые другие источники внешнего давления или вакуума способные прокачивать реагенты по трубкам и микрофлюидным каналам, а также управлять давлением в пневматических каналах, нагревательные элементы, электроника, подающая сигналы для управления насосами, а также насосы воплощены в отдельных функциональных частях установки-контроллера, обслуживающей предлагаемый микрофлюидный чип.
[42]Таким образом, предложенная конструкция микрофлюидного чипа позволяет значительно расширить его функциональные возможности за счёт управляемой избирательной подачи в различные камеры 7 различных нуклеотидов и параллельного синтеза нескольких различных последовательностей, а также позволяет использовать праймеры с защитными группами, исключающими неконтролируемое протекание реакций.
