[1]Полезная модель относится к области экспериментальной физиологии и медицины, в частности к устройствам для моделирования действия неблагоприятных факторов среды и стрессоров в эксперименте, а именно к автоматизированной установке для проведения экспериментальных исследований депрессии на мелких лабораторных грызунах путем моделирования состояния «выученной беспомощности» с использованием неизбегаемого рандомизированного чрезкожного электроболевого раздражения.
[2]Моделирование депрессивных состояний на животных необходимо для изучения нейробиологических механизмов, лежащих в основе тревожно-депрессивных расстройств и действия антидепрессантов, животные модели также нужны для проведения доклинических испытаний лекарственных средств и терапевтических воздействий, оценки уязвимости и устойчивости к стрессам.
[3]Методы с электроболевым раздражением широко используются в экспериментах на животных для моделирования аверсивной ситуации при изучении процессов памяти, научения, принятия решений. Десятилетиями в физиологии применяются различные методики условно-рефлекторного обучения лабораторных животных при помощи электрифицированного пола, например, условным реакциям активного или пассивного избегания. Известны установки для такого обучения грызунов, это, в основном, челночные камеры Шаттл-бокс, представляющие собой небольшую камеру, разделенную на 2 отсека с гильотинной дверцей или норовидным отверстием между ними, с раздельным полом из прутьев или электрической сетки, где задача животного - научиться избегать тока, перебегая в другой отсек по шумовому или световому сигналу [1-2]. Существуют отдельные высокотехнологичные однокамерные [3] или трансформируемые [4] электростимулирующие устройства для обучения сложным инструментальным навыкам избегания и, в большей степени, для индивидуального автоматизированного тестирования когнитивных способностей и разных форм поведения, когда животное отслеживается с помощью датчиков веса, фотоэлектрических систем и т.п.
[4]В 1967 году в классической челночной камере на собаках был обнаружен феномен «выученной беспомощности» - после длительной не зависящей от усилий невозможности избежать электростимуляции животные перестают питаться, даже когда возможность появляется [5]. Опыт неконтролируемости неприятных событий уменьшает стремление к борьбе, мотивацию, вызывает появление отчаяния, которые характерны для пациентов с депрессией. К 1975 году парадигма «выученной беспомощности» оформилась как модель депрессии и на крысах [6], но для неизбегаемого шока и проверки отсутствия навыков избегания по-прежнему использовали двухкамерный Шаттл-бокс, что давало множество ложноотрицательных результатов. Дальнейшая валидация модели [7] показала, что рандомизация стимулов, увеличение размеров камеры и длительности воздействия, предотвращение случайного избегания животными тока, а также усложнение тестирования существенно повысило эффективность и достоверность модели. На сегодня парадигма «выученной беспомощности» является наиболее широко изученной и применяемой моделью депрессии на животных, поскольку воспроизводит ее этиологию, клинически значимые симптомы и ответ на лечение. Наиболее эффективные и часто используемые тесты для оценки поведения отчаяния у грызунов - тест плавания по Порсолту и тест с подвешиванием за хвост - не требуют челночной камеры, как и остальные ключевые тесты на депрессивное поведение у животных, такие как измерение ангедонии, оценка ориентировочно-исследовательского поведения в приподнятом крестообразном лабиринте и открытом поле, а также тестирование базальной и стрессорной активности гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой гормональной системы и ее отрицательной обратной связи, демонстрирующих сходные нарушения у пациентов с депрессией и у животных в парадигме «выученной беспомощности».
[5]Автоматизированные устройства, специально предназначенные для моделирования состояния «выученной беспомощности» посредством электрокожного раздражения, заявителю неизвестны. Наиболее близким к заявляемому техническому решению является имеющийся в продаже аппаратно-программный комплекс «Шелтер» [8], производства ООО «Нейроботикс», который предназначен для автоматизированного определения когнитивных функций (обучаемость и память) лабораторных животных на основе реакции избегания электрокожного раздражителя. «Шелтер» представляет собой камеру из черного плексигласа с электрифицированным съемным полом, которая при установке перегородки с норовидным отверстием разделяется на 2 отсека и становится челночной камерой. Устройство снабжено стимуляционно-регистрирующим блоком, включающим автотрансформатор, ИК видеокамеру, регулируемые источники световых и звуковых сигналов и управляющий модуль. Модуль связан проводами с напольной электросеткой и с компьютером с соответствующим программным обеспечением, что позволяет проводить автоматизированное тестирование грызунов на реакции активного или пассивного избегания, а, приобретя дополнительные модули, и в некоторых других тестах.
[6]Основным недостатком данного технического решения является непредназначенность для автоматизированного моделирования у грызунов депрессии в парадигме «выученной беспомощности», а именно:
[7]- Отсутствие аппаратного или программного рандомизатора электрических стимулов, нерегулярность и непредсказуемость которых необходима для эффективности модели.
[8]- Отсутствие у экспериментатора доступа снаружи камеры к токопроводящим прутьям пола для устранения замыкания цепи фекальными болюсами или прекращения размещения животного на однофазных электродах и избегания стимуляции в ходе длительного эксперимента.
[9]- Базовая комплектация камеры непрозрачными стенками, не позволяющими наблюдать за животными, замечая и предотвращая случайное избегание стимуляции и регулируя ее интенсивность.
[10]- Замкнутость камеры, рассчитанной на 2-5 минутное тестирование животных, приводит к затруднению доступа свежего воздуха при выработке «беспомощности» в течение часа.
[11]- Невозможность надежно разделить камеру на изолированные отсеки для стимуляции более чем одного животного.
[12]- Отсутствие фиксации стимуляционно-регистрирующего модуля на крышке камеры.
[13]- Избыточная для моделирования «выученной беспомощности» техническая сложность и высокая стоимость устройства, предназначенного для автоматической фиксации и обработки поведенческих реакций, содержащего ИК видеокамеру, регулируемые источники световых и звуковых сигналов и дополнительные модули, укомплектованного сложным видеообрабатывающим ПО, для которого требуется отдельный высокопроизводительный компьютер.
[14]Технической проблемой является отсутствие возможности эффективно автоматизированно моделировать состояние «выученной беспомощности» на лабораторных грызунах за счет непредсказуемого неизбегаемого длительного импульсного электроболевого раздражения одновременно у нескольких животных.
[15]Технической задачей является разработка эффективной, надежной, удобной и недорогой автоматизированной установки, специально предназначенной для проведения экспериментальных исследований депрессии на мелких лабораторных грызунах путем моделирования состояния «выученной беспомощности» с использованием рандомизированного чрезкожного электроболевого раздражения, которая бы одновременно обеспечивала непредсказуемость и неизбегаемость электростимуляции, возможность одновременной работы с несколькими животными, доступ воздуха в камеру и наблюдение за животными при длительных экспериментах.
[16]Проблема разрешается за счет того, что устройство включает камеру с электрифицированным решетчатым полом, с последовательно подсоединенными к ней управляющим блоком и регулируемым автотрансформатором, управляющий блок устройства содержит счетчик и индикатор числа импульсов, а также реле и микроконтроллер с внутренним программным обеспечением для рандомизации подачи тока от автотрансформатора на пол камеры. При этом камера разделена сплошными перегородками на индивидуальные отсеки, имеющие хотя бы одну прозрачную внешнюю стенку, закрывающиеся крышками, снабженными запорными механизмами, а токопроводящий решетчатый пол располагается на ножках или опорах для доступа снизу.
[17]Каждый индивидуальный отсек может быть оснащен откидной крышкой сверху, которую удобно выполнить из прозрачного материала.
[18]Передняя и задняя стенки камеры могут быть выполнены прозрачными, а боковые стенки и внутренние перегородки отсеков матовыми, что облегчает наблюдение и обеспечивает одинаковые стрессорные условия для каждого животного.
[19]Оснащение предлагаемого автоматизированного устройства управляющим блоком, в котором микроконтроллер под управлением встроенного ПО циклично замыкает реле, обеспечивая передачу импульсного тока от источника напряжения на пол клетки, и выключает на случайный промежуток времени в заданных пределах, обеспечивает рандомизацию подачи тока и непредсказуемость электростимуляции. Расположение электрифицированного пола стимуляционной камеры над поверхностью стола на опорах позволяет экспериментатору снаружи устранять замыкания цепи фекальными болюсами или сдвигать замершее на однофазных электродах животное и облегчает доступ воздуха в камеру, что, вместе с выполнением наружной стенки камеры прозрачной, позволяет контролировать и регулировать наличие и интенсивность реакции животных на раздражение и обеспечивает неизбегаемость электростимуляции. Разделение электростимуляционной камеры сплошными перегородками на несколько индивидуальных отсеков, сверху снабженных собственными крышками с замками или защелками, не дающими животным выпрыгнуть из камеры и избежать электроболевого раздражения и позволяющими извлекать и помещать их по одному безопасно для экспериментатора, позволяет одновременно вырабатывать условно-рефлекторную «выученную беспомощность» у нескольких животных.
[20]Технический результат состоит в обеспечении возможности проведения автоматизированных экспериментальных исследований депрессии, эффективности и удобства проведения автоматизированных экспериментальных исследований депрессии путем моделирования состояния «выученной беспомощности» с использованием длительного неизбегаемого рандомизированного чрезкожного электроболевого раздражения одновременно на нескольких лабораторных грызунах, что снижает трудозатраты и повышает повторяемость результатов исследований.
[21]На фиг. 1 приведена принципиальная схема разработанного устройства.
[22]На фиг. 2 представлена фотография, иллюстрирующая вариант исполнения и применение разработанного устройства для моделирования состояния «выученной беспомощности» у лабораторных крыс.
[23]Устройство состоит из камеры для животных 1 (фиг. 1), выполненной из материалов, не впитывающих запах и стойких к моче и спирту, разделенной сплошными перегородками на индивидуальные отсеки для работы с несколькими животными одновременно. В варианте исполнения для крыс внутренние габаритные размеры каждого отсека для эффективной выработки условно-рефлекторной «выученной беспомощности» рекомендуются не менее 30×20×35 см. Для обеспечения легкого и безопасного доступа к внутреннему пространству камеры для смены животных и очистки каждый отсек оснащен индивидуальной откидной верхней крышкой 2, снабженной запирающим механизмом 3 для предотвращения побега животных. Минимум одна наружная стенка каждого отсека должна быть прозрачной для наблюдения за ходом эксперимента, в варианте исполнения, представленном на фиг. 2, прозрачными выполнены передняя и задняя стенки камеры и крышки отсеков, а боковые стенки и перегородки из непрозрачного светлого материала, что усиливает стрессорное воздействие на предпочитающих темноту грызунов, не позволяет им видеть соседей, обеспечивает одинаковые условия для каждого животного и облегчает наблюдение. Камера снабжена решетчатым электродным полом 4 (фиг. 1) для аверсивной электростимуляции лап животного, в качестве контактных электродов используются прутья из токопроводящих металлов или сплавов, достаточно устойчивых к агрессивным воздействиям, (напр., медь, латунь, нержавеющая сталь). Использование электродной поверхности в виде одной металлической пластины (сетки и пр.) нецелесообразно, так как приводит к низкой величине электрического тока, протекающего через животное, и к недостаточному электроболевому раздражению. Удобно выполнить пол из параллельных металлических прутов с подачей напряжения фаза/ноль через 1 прут, для крыс расстояние между осями прутов 15-18 мм, оптимальный диаметр прутов около 5-6 мм. Решетка пола должна быть приподнята над поверхностью стола на опорах 5, оставляющих зазор, позволяющий экспериментатору снизу устранять замыкания цепи фекальными болюсами или сдвигать замершее на однофазных электродах животное и облегчающий доступ воздуха в камеру. Удобным вариантом исполнения является использование в качестве опор нижних участков боковых стенок камеры и перегородок, ввинчивание электродных прутов непосредственно в переднюю и заднюю стенку камеры и прорезание арок доступа в стенках ниже прутьев. Токопроводящий пол камеры соединяется кабелем с управляющим блоком 6, выполненным на базе микроконтроллера с внутренним программным обеспечением, который циклично замыкает реле, обеспечивая передачу импульсного тока от регулируемого источника переменного напряжения 7 (автотрансформатора) на пол клетки, и выключает на случайный промежуток времени в программно заданных пределах, то есть представляет собой рандомизатор. Такой блок-рандомизатор удобно оснастить счетчиком числа импульсных пакетов с цифровым индикатором, а в его программное обеспечение ввести возможность перенастройки и обновления, посредством «перепрошивки» с внешнего компьютера. В качестве регулируемого источника напряжения 7 удобно взять лабораторный автотрансформатор регулируемый (ЛАТР), или аналог предназначенный для регулировки (уменьшения) напряжения электрического тока, поданного от сети переменного тока с частотой 50 Гц, который обеспечивает напряжение от 0 до 240 В, силу тока от 0,1 до 2 мА, и с помощью которого тонко настраивается интенсивность воздействия на животных. Хорошо себя зарекомендовавшим эффективным алгоритмом моделирования депрессии является стимуляция в замкнутой камере неконтролируемыми рандомизированными ударами током (~1 мА, 50 Гц, 15 с) в течение часа, для чего управляющий блок (рандомизатор) программируется на цикличное включение импульсного (1 импульс в секунду) тока на 15 секунд, после чего выключение на случайный промежуток времени от 1 до 45 секунд в пределах 1 минуты, так за 1 час каждое животное получает по 60 пакетных ударов.
[24]Устройство удобно в использовании и повышает эффективность исследований за счет автоматизации и возможности моделирования состояния «выученной беспомощности» одновременно у нескольких животных.
[25]Существенным преимуществом предлагаемой полезной модели является то, что она представляет собой устройство, приспособленное специально для моделирования «выученной беспомощности» на лабораторных грызунах с использованием неизбегаемого рандомизированного длительного чрезкожного электроболевого раздражения, без излишних дополнительных функций, и потому существенно дешевле и проще в изготовлении и эксплуатации.
[26]Список используемой литературы
[27]1. Патент КНР CN 217336897 (CN 202221070604.XU) «Shuttle box for animal experiment» «Челночная камера для экспериментов над животными» (А01К 1/03, А01К 1/035, А01К 15/02, опубл. 09.02.2022).
[28]2. Патент РФ RU 2494673 C1 «Установка для чрезкожного электроболевого раздражения лабораторных животных» (А61 В 5/16, G09B23/28, опубл. 10.10.2013).
[29]3. Патент РФ RU 2432902 C2 «Проблемная камера для измерения индивидуального уровня когнитивных способностей крыс» (А61 В 5/16, G09B 23/28, опубл. 10.11.2011).
[30]4. https://www.panlab.com/en/products/shuttle-box-panlab (обращение 02.2024).
[31]5. Seligman М.Е., Maier S.F. Failure to escape traumatic shock. J Exp Psychol. 1967. 74(1): 1-9. https://doi.Org/l0.1037/h0024514.
[32]6. Seligman M.E., Beagley G. Learned helplessness in the rat. J Comp Physiol Psychol. 1975. 88(2):534-41. https://doi.org/10.1037/h0076430.
[33]7. Vollmayr В., Henn F.A. Learned helplessness in the rat: improvements in validity and reliability. Brain Res Brain Res Protoc. 2001. 8(l):l-7. https://doi.org/10.1016/sl385-299x(01)00067-8.
[34]8. https://neurobotics.ru/catalog/fiziologiya-zhivotnyix/povedencheskie-testyi/shelter/ (обращение 03.2024).
