ДНК-МИКРОЧИП ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНО - ГЕНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ЧЕЛОВЕКА

Устройство относится к биотехнологии, а именно к молекулярно-генетическим исследованиям человека с помощью ДНК-микрочипа. Уникальный набор олигонуклеотидных зондов позволяет определять мутации и/или полиморфизмы и включен в ДНК-микрочип, который может быть использован для диагностики наиболее часто встречающихся неследственных и/или мультифакторных заболеваний с наследственной составляющей в этнических группах и/или популяции людей, населяющих Российскую Федерацию. Использование ДНК-микрочипа позволит повысить информативность, точность и сократить сроки исследования.

ДНК-микрочип для молекулярно-генетического исследования человека, принадлежащего к этнической группе, проживающей на территории Российской Федерации, представляющий собой стеклянную пластину с нанесенными на нее олигонуклеотидными зондами, содержащими участки ДНК, позволяющими диагностировать не менее 10 генетических заболеваний, имеющих частоту выше 1 случая 50 тысяч населения, из следующего перечня: муковисцидоз, фенилкетонурия, галактоземия, поясно-конечностная мышечная дистрофия, нейропатия Шарко-Мари-Тута, семейная дисаутономия, спастическая параплегия Сильвера, торсионная дистония ДОФА-независимая, пароксизмальная некинезиогенная дискинезия, миотония Томсена, точечная хондродисплазия, гиперкалиемический периодический паралич, нормокалиемический периодический паралич, гипокалиемический периодический паралич, нейрофиброматоз I типа, болезнь Вильсона-Коновалова, ларинго-онихо-кутанный синдром, нефротический синдром финского типа, периодическая болезнь, синдром SLOS, дефицит MCAD, болезнь Гоше, болезнь Помпе, болезнь Гурлера, болезнь Тея-Сакса, дефицит альфа-1-аминотрипсина, злокачественная гипертермия, болезнь Кэнаван, болезнь Нимана-Пика АВ, непереносимость лактозы, синдром истощения митохондриальной ДНК, синдром Лея, синдром MELAS, атрофия зрительного нерва Лебера, болезнь Штаргардта 1 типа, атрофия зрительного нерва с глухотой, аутосомно-доминантная глухота, наследственная тугоухость, синдром Пендреда, дефицит аденозин-дезаминазы, бета-талассемия, адренолейкодистрофия, острая перемежающаяся порфирия, LQT синдром, наследственные прионные болезни, диастрофическая дисплазия, ихтиоз вульгарный, поликистоз почек аутосомно-рецессивный, семейная частичная липодистрофия типа Данниган, предрасположенность к поздним гестозам, предрасположенность к инсульту, предрасположенность к тромбофилии, предрасположенность к остеопорозу, регуляцию детоксикации ксенобиотиков, регуляцию метаболизма варфарина, болезнь Крона, регуляцию метаболизма алкоголя, гемохроматоз, болезнь Унферрихта-Лундборга, синдром Крузона, синдром Пфайфера, дефицит биотинидазы, нейрональный цероидный липофусциноз 1 типа, спинальная амиотрофия, адреногенитальный синдром, особенность регуляции проникновения ВИЧ в клетку, мужское бесплодие, аутосомно-рецессивный остеопетроз, аутосомно-рецессивный эритроцитоз.

Область техники

Полезная модель относятся к биотехнологии, а именно к молекулярно-генетическим исследованиям человека для диагностики наследственных заболеваний, предрасположенности к мультифакторным заболеваниям, имеющим генетическую составляющую, и персональной генетически-детерминированной реакции на фармацевтические препараты.

Приблизительно половина всех случаев наследования болезней происходит, когда мать и отец не страдают наследственными заболеваниями, однако являются скрытыми носителями поврежденных генов. Если ребенок наследует от каждого родителя такой поврежденный ген, это приведет к развитию болезни. Риск рождения больного ребенка у родителей-носителей составляет 25%, что с медико-генетической точки зрения характеризуется как высокий. Руководствуясь информацией о собственных генетических особенностях, полученной с помощью молекулярно-генетических исследований, а также используя современные возможности репродуктивной медицины, будущие родители смогут избежать рисков зачатия ребенка, больного тяжелым или смертельным наследственным заболеванием, и родить здорового ребенка.

Описание уровня техники

Известен ДНК-микрочип для скрининга новорожденных на такие наследственные заболевания, как муковисцидоз, врожденный гипотиреоз, галактоземия, фенилкетонурия за один анализ крови. Присутствие или отсутствие мутаций ДНК определяют с помощью гибридизации полученных фрагментов на специализированном олигонуклеотидном биочипе. Для этого используют амплификацию РАН, CFTR, РАХ8, GALT генов и получение одноцепочного флюоресцентно меченного продукта методом ник-трансляции и рестрикции, приготавливают биочип для скрининга новорожденных на заболевания, содержащий набор иммобилизованных определенных олигонуклеотидов. Интерпретацию результатов гибридизации осуществляют путем сравнения интенсивности флюоресцентных сигналов, полученных при совершенной и несовершенной гибридизации. Несмотря на то, что такое исследование позволяет получить новый ускоренный метод массового скрининга новорожденных на наличие предрасположенности к моногенным заболеваниям, он обладает ограниченной информативностью.

Описание сущности полезной модели

Задачей настоящей разработки является создание устройства ДНК-микрочипа для исследования ДНК человека на наличие большого количества мутаций и/или полиморфизмов.

Основной отличительной особенностью микрочипа является первый этап его разработки - определение мутаций и/или полиморфизмов, которые могут быть выявлены с его помощью. На данном этапе, исходят из генетических особенностей популяций, населяющих Российскую Федерацию: диагностикум (микрочип) позволяет детектировать наиболее частые мутации и/или полиморфизмы, ассоциированные с наиболее частыми на данной территории наследственными и мультифакторными заболеваниями с наследственной составляющей. Таким образом, эффективность и информативность диагностики людей длительное время проживающих на территории РФ с помощью такого диагностикума увеличивается по сравнению с прямыми аналогами, за счет способа подбора выявляемых мутаций, а не за счет увеличения их количества.

Состав мутаций, выявляемых с помощью микрочипа, оптимизирован и строго специфичен для этнических групп населяющих Россию на протяжении долгого времени. Таким образом, эффективность и информативность генетической диагностики наследственных заболеваний с применением данного ДНК-микрочипа гораздо выше, чем с применением имеющихся аналогов.

В ходе исследований было установлено, что именно с отбором исследуемых мутаций связана эффективность и информативность диагностики на конкретной территории, которые увеличиваются за счет того, что для диагностики взяты самые распространенные и специфичные для этой территории мутации.

ДНК-микрочип для молекулярно-генетического исследования человека, принадлежащего к этнической группе, проживающей на территории Российской Федерации представляет собой стеклянную пластину с нанесенными на нее олигонуклеотидными зондами, содержащими участки ДНК, позволяющими диагностировать не менее 10 генетических заболеваний, имеющих частоту выше 1 случая 50 тысяч населения из перечня, представленного в табл. 1.

Исследование менее 10 заболеваний в одном скрининге снижает эффективность работы при данном использования ДНК-микрочипа, и резко снижает его информативность.

В случае массовой диагностики менее часто встречающихся наследственных заболеваний снижается ее целесообразность с точки зрения профилактики наследственных заболеваний, так как они будут встречаться слишком редко.

ДНК-микрочип получают методом печати олигонуклеотидных зондов, содержащих участки ДНК, позволяющие детектировать выбранные мутации и/или полиморфизмы на стеклянной пластине, покрытой аминосиланом или другим адгезивом нуклеиновых кислот (см. WO 2004073988).

Отличительной особенностью разработанного нами способа является этап предварительного отбора мутаций по установленному нами алгоритму. Способ позволяет получить уникальный микрочип для молекулярно-генетической диагностики человека, принадлежащего к этнической группе, проживающей на территории РФ в течении долгого времени и повысить точность и информативность исследования.

Способ получения ДНК-микрочипа для молекулярно-генетического исследования человека, проживающего на выбранной территории или в выбранной популяции, включает:

I) формирование перечня наследственных заболеваний с частотой встречаемости выше 1 случая 50 тысяч населения Российской Федерации.

II) получение олигонуклеотидных зондов, содержащих ДНК- участки позволяющие детектировать отобранные заболевания;

III) нанесение олигонуклеотидных зондов на стеклянную пластину, покрытую аминосиланом или другим адгезивом нуклеиновых кислот, при этом одна из сторон пластины обработана таким образом, что распространение в ней лазерного луча происходит за счет эффекта полного внутреннего отражения.

Предпочтительно, чтобы зонды были подобраны таким образом, чтобы точно детектировать мутацию или полиморфизм, указанный, как по смысловой, так и по антисмысловой цепи ДНК.

Для детекции мутаций и полиморфизмов зонды отбирают согласно следующим критериям:

- отсутствие внутренней вторичной структуры;

- способность участвовать в специфичной элонгации фрагментов генов, содержащих участки, позволяющие в дальнейшем идентифицировать мутации и полиморфные варианты генов.

Настоящее устройство микрочип может использоваться в составе комплекта для молекулярно-генетической диагностики на основе реакции элонгации праймеров на ДНК-микроматрицах.

Разработанный ДНК-микрочип в составе комплекта позволяет единовременно выявлять носительство мутаций и/или полиморфизмов, ассоциированных с наследственными заболеваниями, и применяется для молекулярно-генетической диагностики наследственных заболеваний; предрасположенности к мультифакторным заболеваниям, имеющим генетическую составляющую, и персональной генетически-детерминированной реакции на фармацевтические препараты.

Комплект для молекулярно-генетического исследования человека, проживающего на территории РФ, включает:

- Набор ферментов и реактивов для подготовки матрицы реакции элонгации праймеров на микрочипе (англ. Arrayed Primer Extention - APEX), состоящий из ДНК-полимеразы, раствора магния, растворов дизоксинуклеотидов, урацил-N-гликозилазы, щелочной фосфатазы креветки.

- Праймеры для реакции ПЦР мультиплексные.

- Набор для очистки продуктов ПЦР

- Набор для реакции АРЕХ: ДНК-полимеразы, раствора магния, растворов флуоресцентно-меченных дидезоксинуклеотидов для элонгации цепи

- ДНК - микрочип, адаптированный для молекулярно-генетического исследования людей, проживающих на определенной географической территории.

Применение наборов на основе технологии АРЕХ описано в US 20070134691.

В качестве метода анализа ДНК-микрочипа был выбран способ, описанный в EP 1088214, что позволяет повысить точность, упростить методику генетической диагностики и сделать ее экономически выгодной.

Способ молекулярно-генетического исследования человека, принадлежащего к этносу, проживающуму на выбранной территории в течение долгого времени, или в выбранной популяции, предусматривает использование нового комплекта для диагностики и регистрацию результатов анализа путем сравнения интенсивности флюоресцентных сигналов, при облучении ДНК-микрочипа лазерами различной длины волны.

Осуществление полезной модели.

Перечень и последовательность зондов, содержащих участки, позволяющие в дальнейшем идентифицировать мутации и полиморфные варианты генов, указанные в Таблице 1, представлена в Таблице 2.

Микрочип отличается нуклеотидной последовательностью зондов, закрепленных на ДНК-микрочипе для прохождения реакции элонгации праймеров на чипе (англ.. Arrayed Primer Extention - APEX). В ходе реакции амплифицированные и фрагментированные участки генома, содержащие анализируемые мутации, денатурируются и наносятся на ДНК-микрочип (Рис. 1).

На рис. 1 показана схема работы ДНК-микрочипа. ДНК-микрочип представляет собой стеклянную пластину с закрепленными на ней одноцепочечными зондами ДНК. В ходе проведения генетической диагностики ДНК пациента амплифицируется, фрагментируется и наносится на микрочип. Затем зонд достраивается на один флуоресцентно меченный нуклеотид, причем в качестве матрицы используется ДНК пациента, которая в дальнейшем отмывается.

Заявленный ДНК-микрочип используется в составе комплекта (см. таблицу 3) для диагностики наследственных заболеваний, осуществляемой в несколько этапов (Рис. 1):

1) Получение геномной ДНК человека непосредственно из клинического образца (цельной периферической или пуповинной крови, или эритроцитарной массы или другого биологического образца).

2) Амплификация участков ДНК, содержащих мутации и полиморфизмы с использованием специфично подобранных праймеров.

3) Очистка продуктов ПЦР.

4) Фрагментация продуктов ПЦР.

5) Гибридизация полученных одноцепочечных фрагментов на ДНК-микрочипе, с последующим достраиванием зондов на один специфично-меченный флуоресцентным маркером нуклеотид в месте мутации. При этом в качестве матрицы используются образцы анализируемой ДНК.

6) Регистрация результатов анализа путем сравнения интенсивности свечения флюоресцентных сигналов, при облучении ДНК-микрочипа лазерами различной длины волны.

Проведение ПЦР и фрагментации ДНК.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) используется для амплификации (увеличения копийности) участков геномной ДНК, несущих целевые мутации или однонуклеотидные полиморфизмы (SNP).

Часть дТТФ заменяется в ПЦР-миксе на дУТФ, что обеспечивает возможность дальнейшей фрагментации с помощью Урацил N-Гликозилазы (UNG). Продукты ПЦР объединяют, концентрируют и очищают от не встроившихся дНТФ с помощью щелочной фосфатазы креветок (SAP). После обработки SAP и UNG образцы нагревают для инактивации ферментов и расщепления ДНК в месте встройки урацила. Фрагментация длинных продуктов ПЦР обеспечивает лучшую гибридизацию с комплементарными олигонуклеотидами, иммобилизованными на стекле.

Проведение реакции APEX

Непосредственно перед реакцией элонгации праймеров на чипе (англ. Arrayed Primer Extention - APEX) фрагментированные продукты ПЦР денатурируют и переносят в реакционной смеси на разработанный чип (массив олигонуклеотидов на стекле). Реакционная смесь содержит буфер, одноцепочечные ДНК, термостабильную ДНК-полимеразу и 4 различных, индивидуально меченных флуорофорами терминаторных нуклеотидов.

Матрице-зависимая ДНК полимеразная реакция проводится при постепенно увеличивающейся температуре для того, чтобы минимизировать образования олигонуклеотидами нежелательных вторичных структур, кроме того, обеспечить эффективную гибридизацию с целевыми фрагментами ДНК и поддержать на высоком уровне активность полимеразы. После инкубации, свободный и не присоединенный ковалентными связями материал отмывается, что обеспечивает наилучшее соотношение сигнал-шум.

Детекция

Обработанные слайды, несущие на себе массив олигонуклеотидов, прошедших реакцию APEX, сканируют в микрочиповом сканере Genorama® QuattroImager™ (см. EP 1088214). 4 лазера (поодиночке) используют для возбуждения разных красителей. 4 хорошо спектрально разделенных красителя возбуждают с помощью полного внутреннего отражения лазерного луча в толще стеклянного слайда, работающего как световод. Свет, излучаемый флуорофорами в ответ на возбуждение, регистрируют с помощью ПЗС-камеры.

Поскольку для каждой реакции используют 4 различных красителя, для каждого микрочипа снимают 4 различных изображения излученного света. Каждый снимок соответствует своему красителю, соответственно отражает паттерн встраивания на чипе одного из 4 терминаторных нуклеотидов.

Анализ изображений и информации.

Сканирование сопровождается анализом с помощью Genorama® Genotyping Software™ («лазерный диск для генотипирования») для перевода информации о паттерне флуоресценции в нуклеотидную последовательность. Сначала нормируются интенсивности сигналов соответствующих красителей нуклеотидов-терминаторов. Сравниваются интенсивности сигналов в каждой точке расположения олигонуклеотидов во всех четырех изображениях и наиболее интенсивный сигнал интерпретируется как соответствующий нуклеотид. В зависимости от того, встраивание какого нуклеотида произошло в точке мутации, делают вывод о статусе ее носительства у конкретного пациента.

Таким образом, уникальный набор мутаций и полиморфизмов, может быть генотипирован с помощью разработанного микрочипа.

Обеспечена высокая специфичность (98%) и чувствительность (96%) при использовании в составе комплекта данного микрочипа для генетической диагностики при помощи реакции элонгации праймеров на ДНК-микроматрицах.

Данный микрочип позволяет детектировать мутации и полиморфизмы, а также ассоциированные с ними наследственные моногенные заболевания и предрасположенности к мультифакторным заболеваниям, включая муковисцидоз в одном исследовании, приведенные в таблице 1. ДНК-микрочип сфокусирован на популяцию России, и предназначен для диагностики наиболее частых мутаций, ассоциированных с наследственными заболеваниями, и наиболее частых полимофризмов, ассоциированных с предрасположенностью к мультифакторным болезням и распространенных на территории Российской Федерации.

Клинические примеры

Клинический пример 1.

Больная Р-ва. Материалом для скринингового исследования служил образец эритроцитарной массы пуповинной крови.

Нами было проведено молекулярно-генетическое типирование с помощью заявляемого ДНК-микрочипа на 216 мутаций.

С помощью предлагаемого ДНК-микрочипа у больной Р-вой была выявлена ассоциированная с галактоземией мутация в гомозиготной форме с. - 119 del/del в гене CALT.

Клинический пример 2.

Больная К-ва. Материалом для скринингового исследования служил образец периферической крови.

Нами было проведено молекулярно-генетическое типирование с помощью заявляемого ДНК-микрочипа на 216 мутаций.

С помощью предлагаемого ДНК-микрочипа у больной К-вой была выявлена ассоциированная с Наследственной нейропатией зрительного нерва Лебера мутация в митохондриальном геноме. m. 1527А в гене MTCYB.

Клинический пример 3.

Больной С-ян. Материалом для скринингового исследования служил образец эритроцитарной массы пуповинной крови.

Нами было проведено молекулярно-генетическое типирование с помощью заявляемого ДНК-микрочипа на 216 мутаций.

С помощью предлагаемого ДНК-микрочипа у больного С-яна была выявлена ассоциированная с периодической болезнью мутация в гомозиготной форме с. 442 C/C в гене MEFV.

ДНК-микрочип может применяться для молекулярно-генетической диагностики в больницах, клинико-диагностических лабораториях и научно-исследовательских институтах. Данные исследования позволят здоровым людям получить информацию о своих генетических особенностях для поддержания собственного здоровья, а также предупредить рождение в их семье детей с тяжелой наследственной патологией.