[2]Изобретение относится к химии, а именно к способам получения стабильных водных растворов фуллеренов, которые могут быть использованы для изготовления лекарственных и косметических средств на основе фуллеренов.
[4]Фуллерены обладают широким спектром биологической активности. Из проявляемых фуллеренами биологических свойств сегодня наибольший интерес представляют противоопухолевая, антивирусная, антибактериальная, антиоксидантная, нейропротективная активность. При этом фуллерен С60 не проявляет заметную токсичность. Однако, получение препаратов на основе фуллеренов для медицинского применения затрудняется из-за того, что фуллерены нерастворимы в воде.
[5]Кристаллический фуллерен С60 имеет растворимость в воде менее 10-11г/л, а растворители, в которых он хорошо растворяется (толуол, бензол, дихлорбензол), токсичны для человека и животных. Одним из наиболее характерных свойств немодифицированного фуллерена является его склонность к агрегации [Безмельницын В. Н., Елецкий А. В., Окунь М. В. Фуллерены в растворах. Успехи физ. наук, 1998, 168:1195-1120; Yuriy I. Prylutskyy Y.I., Buchelnikov A.S. , Voronin D.P., Kostjukov V.V., Ritterc U., Parkinson J.A., Evstigneev M.P. C60 fullerene aggregation in aqueous solution. Phys Chem Chem Phys 2013,15(23):9351-60]. При этом свойства получаемых водных растворов фуллерена (далее ВРФ), размер частиц, дзета-потенциал, временная стабильность, рН коагуляции и др., зависят от метода их получения. Наличие отрицательного заряда на поверхности фуллереновых кластеров играет важную роль в стабилизации его водных дисперсий, при существенном изменении рН и ионной силы среды фуллерен в растворе легко агрегирует и осаждается. Высушивание (получение сухого остатка) дисперсии, либо путем упаривания, либо лиофилизацией, обычно ведет к потере водной растворимости оставшегося фуллеренового материала.
[6]Известные способы образования стабильных ВРФ основаны на переносе фуллерена из органического раствора (бензол, толуол, тетрагидрофуран) в водную фазу («метод с заменой растворителя») с применением ультразвука. Органический растворитель постепенно вытесняют путем продувки смеси инертным газом, или интенсивной ультразвуковой обработкой, обеспечивающей нагрев системы и испарение растворителя [обзор Мчедлов-Петросян Н. О. Растворы фуллерена С60: коллоидный аспект. Хiмiя, фiзика та технологiя поверхнi, 2010, Т. 1, №1, 19-37г.; Deguchi Sh., Mukai S.-A. Top-down preparation of dispersions of C60 nanoparticles in organic solvents. Chemistry Letters, 2006; 35(4): 396-397; Andrievsky G. V., Kosevich M. V., Vovk O. M., Shelkovsky V. S., Vashcenko L. A. On the production of an aqueous colloidal solution of fullerenes. J. Chem. Soc., 1995, 12, 1281-128215]. Обычно, в результате, образуется коллоидный раствор от желтого до бордово-коричневого цвета, содержащий гидратированные кластеры из молекул С60, и/или нанокристаллы фуллерена, размер которых зависит от особенностей метода и колеблется в нанометровом диапазоне (10-1000 нм). Этот метод, однако, плохо подходит для создания растворов для медицинского применения, поскольку технология его изготовления включает использование токсичных для человека и животных растворителей, а также мало поддаётся стандартизации из-за низкой воспроизводимости результатов ультразвуковой обработки (зависимость от мощности и времени озвучивания, объема и геометрии сосуда с раствором). При этом выход фуллерена в водную фазу довольно низкий. Несмотря на манипуляции по удалению следов ароматического растворителя, полностью от них избавиться практически трудно, ввиду их специфического (π-стэкинг) взаимодействия с молекулами фуллерена [Konarev D.V., Litvinov A.L., Kovaltvsky A.Yu., Drichko N.V., Coppens R.N., Lubovskaya R.N. Molecular complexes of fullerene C60 with aromatic hydrocarbons: Crystal structures of (TPE)2C60 and DPA·C60. Synthetic Metals, 2003, 133-134, 675-677].
[7]Известны также способы получения ВРФ путем прямого механического диспергирования порошка фуллерита (кристаллы фуллерена) в водной среде, часто его сочетают с растиранием фуллерена в ступке и озвучиванием [Labille J., Brant J. A., Villiéras F., Pelletier M., Wiesner M. R., Bottero J.-Y. Affinity of C60 fullerenes with water. Fullerenes, Nanotubes, and Carbon Nanostructures, 2006, 14(2-3):307-14]. Такой способ имеет довольно малую эффективность, требует очень длительного перемешивания (от нескольких суток до многих месяцев), а выход фуллерена в раствор очень низкий.
[8]Известен также способ образования водорастворимых нековалентных комплексов между фуллереном и амфифильным полимером. Наиболее известный пример – комплекс С60 с поливинилпирролидоном (ПВП), который также получают через совместное растворение обоих компонентов в органическом растворителе (толуол), его упаривании и растворением остатка в воде. Водные дисперсии С60/ПВП окрашены в желто-коричневые цвета, а содержание фуллерена в них достигает максимум 0,5-1%, в зависимости от условий получения и молекулярной массы ПВП. Показано, что такие дисперсии проявляют антиоксидантную активность, сравнимую с чистым фуллереном [Пиотровский Л. Б., Киселев О. И. Фуллерены в биологии. СПб: Росток; 2006; Yamakoshi Y. N., Yagami T., Fukuhara K., Sueyoshi S., Miyata N. Solubilization of fullerenes into water with polyvinylpyrrolidone applicable to biological tests. J. Chem. Soc. Chem. Commun., 1994; 517-518]. Однако, эффективность солюбилизации фуллерена этим методом довольно умеренная [Torres V.M., Posa M., Srdjenovic B., Simplicio A.L. Solubilization of fullerene C60 in micellar solution of different solubilizers. Colloid and Surfaces B:Biointerfaces, 2011, 82, 46-53], и кроме того, эти методики также требуют применения токсичных растворителей (толуол). Также показано, что ПВП обладает некоторой токсичностью при парентеральном введении.
[9]Известно применение поверхностно-активных веществ (ПАВ) для солюбилизации фуллерена с образованием мицеллярных растворов. В то же время показано, что ионные и неионные ПАВ (Твин) ухудшают антиоксидантную активность фуллерена, лишь Тритон Х-100 позволяет сохранять его активность на уровне свободного фуллерена [Torres V.M., Posa M., Srdjenovic B., Simplicio A.L. Solubilization of fullerene C60 in micellar solution of different solubilizers. Colloid and Surfaces B:Biointerfaces, 2011, 82, 46-53].
[10]Химическая модификация фуллерена также позволяет получить его водорастворимые формы, однако при этом часто снижается их электронно-акцепторная способность, что негативно сказывается на его антиоксидантных свойствах, важных в медицинском плане. Кроме того, получение таких соединений очень затруднительно и стоимость таких производных очень высока.
[11]Ближайшим аналогом (прототипом) настоящего изобретения является техническое решение, известное из патента RU2548971. В патенте раскрывается способ получения водных нанодисперсий фуллерена. Водную дисперсию фуллерена получают растворением кристаллов фуллерита C60 в N-метилпирролидоне (МП). Полученный раствор смешивают с водой и стабилизатором, в качестве которого используют аминокислоту, моносахарид, пептид, поливинилпирролидон или глицерин. Затем проводят диализ полученной смеси. После диализа раствор можно концентрировать, например, путем упаривания в вакууме. Однако данный способ очень медленный (удаление МП путем диализа занимает >5 суток), характеризуется большим расходом дистиллированной/деионизованной воды (ДВ), причем концентрация фуллерена в водной среде после диализа ограничена физическими причинами до ~130-200 мг/л. Кроме того, высокая длительность процесса сильно увеличивает риск микробной контаминации, а также агломерации наночастиц с их преждевременным осаждением. Концентрирование раствора упариванием очень трудно контролировать из-за спонтанного появления микрочастиц и лавинообразного образования осадка. Таким образом, процесс по диализной технологии имеет существенные ограничения: не позволяет получить раствор с высокой концентрацией С60, имеется риск микробной контаминации и нетехнологичен в масштабном варианте. Дополнительно следует указать, что дисперсия, получаемая диализным способом, нестабильна в присутствии солей, образование осадков наблюдается сразу при ее смешивании с физиологическим раствором или фосфатно-солевым буфером, применяемых для медицинских целей. Причем диализ С60 в растворе вода/МП против указанных солевых сред также приводит к образованию осадков, что не позволяет использовать получаемые растворы в медицинских целях.
[12]Высокая концентрация фуллерена в растворе особенно важна при получении лечебных композиций, например мазей, кремов, шампуней, где имеется существенное снижение концентрации лекарственной субстанции за счет наполнителей и сопутствующих компонентов.
[13]Таким образом, существует потребность в разработке новых эффективных способов получения стабильных водных растворов фуллерена, характеризующихся производительностью процесса и обеспечивающих получение растворов с высокой концентрацией фуллерена.
[14]Раскрытие изобретения
[15]Задачей данного изобретения является разработка нового эффективного способа получения водного раствора фуллерена (в частности, С60), характеризующегося высокой стабильностью и высокой концентрацией фуллерена.
[16]Техническим результатом изобретения является разработка нового эффективного способа получения водного раствора фуллерена (в частности, С60), характеризующегося высокой стабильностью и широким диапазоном концентраций фуллерена в пределах от 50 до 3000 мг/л, а также высокой коллоидной стабильностью раствора в присутствии солей, в частности в присутствии фосфатно-солевого буфера и физраствора. Указанный способ хорошо масштабируем, характеризуется более низким расходом дистиллированной/деионизованной воды по сравнению с прототипом, сокращением времени проведения процесса.
[17]Указанный технический результат достигается посредством осуществления способа получения водного раствора фуллерена, включающего:
[18]а) растворение кристаллического фуллерена в N-метилирролидоне;
[19]б) смешивание раствора, полученного на стадии а, с водой и/или водным раствором стабилизатора;
[20]в) проведение тангенциальной поточной ультрафильтрации раствора фуллерена в смеси N-метилпирролидон-вода, полученного на стадии б.
[21]В частных вариантах воплощения изобретения, стабилизатор представляет собой биосовместимый неионогенный ПАВ, моносахарид и/или аминокислоту. В частных вариантах воплощения изобретения может быть использована комбинация нескольких стабилизаторов.
[22]В частных вариантах воплощения изобретения, стабилизатор представляет собой плуроник F-127, L-аланин, рамнозу, глицерин, твин 20 и/или твин 80.
[23]В частных вариантах воплощения изобретения, способ дополнительно включает стадию исчерпывающего диализа перед стадией в.
[24]В частных вариантах воплощения изобретения, водный раствор фуллерена имеет концентрацию 50 - 3000 мг/л.
[25]В частных вариантах воплощения изобретения, фуллерен представляет собой С60.
[26]В частных вариантах воплощения изобретения, фуллерен представляет собой С70.
[27]В частных вариантах воплощения изобретения, фуллерен представляет собой эндофуллерен Gd@C82.
[28]В частных вариантах воплощения изобретения проведение тангенциальной поточной ультрафильтрации осуществляют с помощью полупроницаемой мембраны из регенерированной целлюлозы или с помощью полисульфоновой мембраны.
[29]Краткое описание чертежей
[30]Фигура 1. Принципиальная схема получения водного раствора фуллерена.
[31]Фигура 2. Принципиальная схема устройства для тангенциальной поточной ультрафильтрации (ТПФ):
[32]1 - ёмкость для вытесняющей/разбавляющей жидкости;
[33]2 – ёмкость для раствора фуллерена в водно-органической смеси;
[34]3 – перистальтический насос;
[35]4 – мембранный модуль;
[37]Фигура 3. УФ-Вид-спектр поглощения С60 в МП (кривая 1), в смеси МП-вода (кривая 2) и финальный раствор ВРФ после ультрафильтрации (кривая 3).
[38]Фигура 4. УФ-Вид-спектр ВРФ, полученного способом по изобретению (концентрация 1,5 мг/мл, разведение в 100 раз водой дистиллированной).
[39]Фигура 5. Спектр поглощения фильтрата (прошедшего через мембрану) при окончании процесса ТПФ по изобретению.
[40]Фигура 6. Размер частиц С60 в ВРФ, получаемых: методом диализа, 110 мг/л (А), методом ТПФ, 1800 мг/л (Б) и комбинацией – методом диализа и ТПФ, 770 мг/л (В).
[41]Фигура 7.Размер частиц С60 в ВРФ, полученном методом ТПФ, через 43 часа после получения.
[42]Фигура 8. ИК-Фурье-спектр сухого образца после лиофильного высушивания раствора ВРФ, полученного способом по изобретению.
[43]Определения и термины
[44]Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения.
[45]В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
[46]Под термином «фуллерен» понимают соединение, представляющее собой выпуклые замкнутые многогранники, составленные из чётного числа трёхкоординированных атомов углерода, в частности соединения С60, С70. Если в состав молекулы фуллерена помимо атомов углерода, входят атомы других химических элементов, то такие фуллерены называются эндоэдральными (эндофуллерен), если атомы расположены внутри углеродного каркаса, или экзоэдральными (экзофуллерен), если атомы снаружи.
[47]Подробное раскрытие изобретения
[48]В отличие от белков и других крупных биополимеров, гидрофобные молекулы фуллеренов обладают очень высокой склонностью к агрегации и сильной адгезией к различным материалам. Эти особенности сильно затрудняют манипуляции с этим веществом, особенно в водных средах. Хотя диализный метод позволяет получать водные растворы С60(дВРФ), однако верхний потолок концентраций С60ограничен 100-130 мг/л ввиду принципиальных физических ограничений (доннановское равновесие). Для дальнейшего концентрирования необходимо применять упаривание воды (в вакууме), что часто ведет к осаждению фуллеренового материала. Не удается получать стабильные растворы с концентрацией выше чем 150-200 мг/л, между тем это важно для получения лекарственных композиций на основе фуллерена, растворов, гелей, мазей. Кроме того, дВРФ не терпит присутствия солей, например, смешивание такого раствора с буферным физиологически раствором, приводит к быстрой ассоциации молекул фуллерена и образованию осадка. Между тем стабильность в солевой среде очень важна в случае медицинского применения, например при парентеральном введении. Данное изобретение позволяет преодолеть указанные недостатки.
[49]В начальных экспериментах, в попытках повысить производительность процесса путем повышения скорости потока жидкости через мембрану, вместо диализа авторы изобретения использовали метод тупиковой (статической) ультрафильтрации (dead-end ultrafiltration method) с ячейками и мембранами компании Amicon. Для этого применяли мембраны с различной гидрофобностью и отсечкой по молекулярной массе (из регенерируемой целлюлозы, метил-целлюлозы, 10, 30, 50 кДа), причем процесс проводили под давлением аргона с перемешиванием раствора на магнитной мешалке. Однако независимо от изменения параметров во всех случаев наблюдали массивное образование осадка фуллерена на поверхности мембраны, потери фуллерена составляли более 70%. Даже введение в раствор неионогенного ПАВ, плуроника F-127, ненамного снижало адсорбцию С60 и его накопление на мембране.
[50]Неожиданно было обнаружено, что указанные проблемы позволяет преодолеть использование тангенциальной поточной фильтрации (ТПФ), одной из разновидностей ультрафильтрации. Физически, конечная цель процесса состоит в удалении органического растворителя (МП) из водно-органического раствора фуллерена C60. По сравнению с диализом, режим ТПФ резко отличается гидродинамикой процесса. За счет высокой скорости циркулирующего потока жидкости над поверхностью полупроницаемой мембраны наночастицы фуллерена не накапливаются в порах мембраны, поэтому формирование осадка из агрегированных частиц фуллерена затрудняется, хотя не отменяется вовсе. Пористость мембраны влияет на скорость фильтрации, от 3 кД до 100 кД скорость повышается с увеличением диаметра пор.
[51]Используемое устройство для ТПФ изображено на фиг. 2, оно представляет собой систему, состоящую из резервуара для ультра/диа-фильтрации (РД), куда помещается исходный раствор С60 в смеси вода-МП. Перистальтический насос прокачивает этот раствор через циркулирующий контур мембранного модуля с полупроницаемой мембраной (30÷ 100 кДа). При этом молекулы МП и воды, в отличие от фуллерена, свободно проходят через мембрану в специальный сборник. Для поддержания объема в РД и постепенного понижения в нем концентрации МП ДВ подаётся в РД со скоростью, равной скорости удаления фильтрата. В итоге, через определенное время практически весь растворенный МП удаляется из раствора фуллерена. Если далее продолжать процесс, без подачи ДВ, то происходит концентрирование раствора фуллерена, с получением ВРФ нужной концентрации. Такую систему легко автоматизировать, установив контролирующий датчик оптической плотности (193 нм) перед сборником ПМ и датчик уровня жидкости в РД. Процесс прекращается при достижении оптической плотности менее 0.1 оптических единиц (1 см кювета, 193 нм) (Фиг. 5) и затем уровня жидкости в РД (ретентата). Концентрацию получаемого водного раствора фуллерена можно регулировать в гораздо более широких пределах (от 50 до 3000 мг/л) по сравнению с диапазоном концентраций, получаемом при использовании диализного метода (порог – 130 мг С60/л), причем её получают без использования в способе дополнительных методов концентрирования раствора.
[52]Дополнительно настоящее изобретение включает вариант получения ВРФ, в котором предлагается применять комбинацию диализного метода с ультрафильтрационным методом (ТПФ). На первой стадии, получают ВРФ с концентрацией 100-130 мг С60/л, на второй – с помощью ТПФ, получают концентрат 500-2000 мг С60/л. Такой способ имеет преимущество, если требуется получить ВРФ с наночастицами С60 меньшего размера (80-200 нм), т.к. метод концентрирования с использованием ТПФ приводит к ВРФ с частицами С60 более крупного размера (Фиг. 6).
[53]Как известно, водные растворы фуллерена нестабильны в присутствии солей, между тем решение этой проблемы важно, если учитывать их медицинское применение. Например, для парентерального введения необходимо применять растворы, изотоничные плазме крови, поскольку бессолевые среды, содержащие фуллерен, обладает некоторой гемолитической активностью [Шершакова Н.Н., Андреев С.М., Пургина Д.Д., Макарова Э.А., Башкатова Е.Н., Хаитов М.Р. Изучение гемолитической активности фуллерена С60. Иммунология, 2016, 37 (4):212-215]. Однако, прямое смешивание ВРФ с физиологическим раствором (0.9% NaCI) или фосфат-солевым буфером (ФСБ) ведет к быстрому образованию осадка фуллерена из-за нейтрализации отрицательного заряда на частицах С60 и их дестабилизации. Поэтому такие дисперсии нежелательно вводить внутривенно из-за опасности образования тромбов. Решение этой проблемы основано на дополнительном введении в раствор (ВРФ) биосовместимых неионогенных ПАВ: твины, полоксамеры, сложные эфиры сахарозы. С этой целью в данном изобретении, в частности, использованы в качестве стабилизаторов полоксамеры Р188 (Pluronic® F-68), Р407 (Pluronic® F-127), твины 20 и 80, пальмитат сахарозы. В некоторых частных вариантах воплощения изобретения ПАВ используют при массовых соотношениях ПАВ:фуллерен равном 1:1-4.
[54]Анализ ВРФ, получаемых с применением указанных ПАВ, показал, что использование стабилизаторов позволяет резко снижать адсорбцию фуллерена на ультрафильтрационной мембране и приводит к высокой концентрации С60 в финальном ВРФ, вплоть до 2-3 г/л. Следует также отметить, что с ростом концентрации размер частиц С60 также заметно повышается, особенно при концентрациях выше 1 г С60/л (2-3 раза).
[55]Известен способ получения водно-солевых дисперсий фуллерена, включающий растворение кристаллов фуллерена C60 в N-метилпирролидоне, фильтрование полученного раствора от нерастворимых частиц и его смешивание с раствором стабилизатора, в качестве которого используют плуроник F127 и L121, и последующий диализ полученной смеси [RU2630561]. Однако недостатком этого способа является невозможность достичь высокой концентрации фуллерена в конечном растворе, она ограничена верхним потолком 100-130 мг С60/л из-за установления трансмембранного равновесия при отсутствии внешнего давления (доннановский эффект). Другие недостатки связаны с самим процессом диализа, о которых было сказано выше.
[56]Таким образом, применение технологии ТПФ позволяет получать устойчивые во времени (по меньшей мере, в течение 6 месяцев при 100С) растворы фуллерена с параметрами, характерными для ВРФ, а именно, размерами частиц 80-100 нм в среде ДВ и 60-100 нм в водной среде, содержащей ПАВ. УФ-Вид-спектральные особенности для обоих типов были идентичны (220-225, 260-265, 340-345 нм, см. фиг. 5).
[57]Осуществление изобретения
[58]Возможность объективного достижения технического результата при осуществлении изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера. Следует понимать, что эти и все приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.
[59]Пример 1. (Диализный метод с последующим концентрированием методом ТПФ). 20 мг кристаллического С60(99.5%, НеоТекПродакт, Россия) растворяют в 25 мл МП, используя магнитную мешалку, и полученный раствор смешивают с 100 мл ДВ. Полученный темно-красный прозрачный раствор перемешивают 1 ч и затем его переносят в диализную трубку (SpectraPor, 6-8 кДа, Spectrum Laboratories Inc.) и подвергают исчерпывающему диализу против ДВ, используя 5 смен через 24 часа по 5 л. В результате получали прозрачный, коричневато-желтый раствор (Фиг. 3, кривая 3). Окончание процесса определяется по оптическому поглощению фильтрата при длине волны 193 нм, соответствующей максимуму поглощения для МП (ε193= 30000). При этом остаточное содержание МП в ВРФ намного ниже 10 ppm. Этим же методом определяют концентрацию фуллерена С60 в ВРФ при длине волны 340 нм (ε340= 50200). Получено 185 мл ВРФ, концентрация С60 составляла 105 мг/л, размер частиц 60-80 нм (Фиг. 7). Процесс занимает 5 суток и требует 25 л ДВ для трансформации 20 мг фуллерена. Полученный раствор подвергают ультрафильтрации без добавления вытесняющего раствора до снижения объёма ретентата до 20 мл, концентрация конечного раствора после стадии ТПФ составляет 1000 мг/л.
[60]Пример 2. (ТПФ) 20 мг порошка фуллерена С60 растворяют в 25 мл N-метилпирролидона (МП) (99.5%, НеоТекПродакт) при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке в течение 2 часов, раствор тёмно-фиолетового цвета фильтруют через стекловолоконный фильтр (3-5 мкм), его электронный спектр имеет два пика при длине 260 и 335 нм. Затем фильтрат смешивают со 100 мл ДВ. Полученный буро-коричневый раствор переносят в емкость для ультрафильтрации (РД, емкость 2 на Фиг. 2). Схема установки для ультрафильтрации представлена на фигуре 2. В ёмкость для вытесняющей/разбавляющей жидкости (емкость 1 на Фиг. 2) вносят ДВ. Раствор фуллерена в водно-органической смеси из емкости 2 непрерывно подается перистальтическим насосом 3 в мембранный модуль 4 в режиме рециркуляции. Фильтрат поступает в приемник/слив 5, где постепенно накапливается удаляемый компонент МП. Получаемый конечный продукт, ВРФ, или ретентат, остается в емкости 2. Мембранный модуль содержит полупроницаемую мембрану из регенерированной целлюлозы с порами отсечки по молекулярной массе до 100 кДа. Контроль над процессом основан на спектрофотометрии (снижение поглощения при 193 нм). Уровень жидкости в емкости 2 поддерживается на одном уровне, объем 125 мл, т. е. в данном примере процесс идет без дополнительного концентрирования раствора. Для удаления МП было достаточно 3 л вытесняющей жидкости (ДВ). При скорости потока 10 мл/мин процесс занял около 5 часов. В итоге получено 125 мл ВРФ, концентрация фуллерена С60 составляла 152 мг/л. Результаты спектрофотометрии полученного ВРФ (ретентат) и фильтрата представлены на фигурах 3, 4 и 5. Спектр поглощения ВРФ примера 2 аналогичен спектру ВРФ, полученного в примере 1 (содержат три пика в области 218-224, 263-270 и 340-347 нм и широкую полосу поглощения в области 400-600 нм). Размеры частиц фуллерена в полученном ВРФ, измеренные методом фотокорреляционной спектроскопии (Photocor Compact-Z, Россия) находятся в диапазоне 45-60 нм (Фиг. 6, а).
[61]ИК-Фурье-спектр лиофильно высушенного ВРФ показывает четыре полосы колебаний, типичных для скелета фуллерена при 1427, 1181, 575 и 525 см-1, а также широкие полосы поглощения в районе 3500-3200, обусловленные присутствием воды (колебания O–H). Наличие полос при 2917 (колебания C–H связи), 1598 (амидный C=O) и в области 1180-1000 (C–O) см-1, связано с наличием гидроксилов и молекулы МП (донорно-акцепторный комплекс МП/С60) (Фиг. 8). Масс-спектрометрия (MALDI-TOF) ВРФ показывает наличие в спектре одного пика с m/z =720±0.9. ВРФ можно подвергать термической стерилизации в течение 15-30 минут при температуре 120оС.
[62]Если сравнивать расход ДВ и времени в примерах 1 (диализ) и 2 (метод ТПФ) при получении ВРФ, содержащей С60 в сравнимой концентрации, то соотношение расхода воды составляет 25:3, соответственно. Таким образом, метод ТПФ по сравнению с диализом дает более чем 8-кратную экономию по воде, сокращение по времени проведения процесса– 24-кратное.
[63]Пример 3. Эксперимент проводят согласно методике, приведенной в примере 2, однако в качестве вытесняющей жидкости и для разведения первичного раствора C60 в МП вместо ДВ используют 0,02% раствор L-аланина (как стабилизатор) в ДВ. Исходные загрузки: С60 – 100 мг, МП – 125 мл, 0,02% раствор L-аланина – 500 мл. После удаления МП, как описано в примере 2, уровень ретентата в емкости 2 снижают с целью его концентрирования до 36.4 мл (примерно в 17-18 раз) путем циркуляции через мембранный модуль ретентата без подачи вытесняющего раствора. В итоге получают ВРФ с концентрацией 2.52 г/л и средним размером частиц 280 нм. Потери С60 за счет адсорбции на мембране и транзит – 8.3 мг.
[64]Спектры полученного ВРФ (ретентата) и фильтрата (слива) полностью аналогичны спектрам ретентата и фильтрата, получаемые по примеру 2. Концентрация С60 – 2,52 мг/мл
[65]Пример 4. Эксперимент проводят согласно методике, приведенной в примере 2, используя 80 мг С60 в смеси 100 мл МП и 400 мл ДВ, однако затем проводят концентрирование ретентата. После удаления ПМ, как описано в примере 2, уровень ретентата в емкости 2 снижают с целью его концентрирования примерно в 10 раз (конечный объем ретентата 40-42 мл), путем циркуляции через мембранный модуль ретентата без подачи вытесняющей ДВ. В итоге получают около 40 мл ВРФ с концентрацией 1800 мг/л (фиг.8), содержащей 72 мг С60 (8 мг С60 адсорбционные потери) и размером частиц около 200 нм.
[66]Пример 5. Эксперимент проводят по методике, приведенной в примере 2 с последующим концентрированием, однако в качестве вытесняющей жидкости и для разведения первичного раствора (С60 в МП) используют 0.08% раствор биосовместимого плуроника F-127 (Sigma-Aldrich) в 0.1 М фосфатном буфере с рН 7.4. Исходя из 200 мг С60 получают 59 мл ВРФ с концентрацией С60 3.14 г/л. Максимум поглощения плуроника располагается при 190-195 нм, что несколько влияет на форму спектра в области 220 нм, но не меняет профиль спектра в области 240-600 нм. Другие физико-химические свойства полученного ВРФ не отличаются от ВРФ, полученного в примере 2.
[67]Пример 6. Эксперимент проводят по методике, указанной в примере 2, однако с использованием полисульфоновой мембраны для ТПФ. Объём загрузки – 20 мг С60, 25 мл МП, 50 мл 0,02% раствора L-аланина. Выходная концентрация – 0,92 мг/мл в 20 мл. Потери на мембране составляют 0,16 мг С60. Спектральные характеристики полученного ВРФ не отличаются от ВРФ, полученного в примере 1.
[68]Пример 7. Эксперимент проводят по методике, описанной в примере 3, однако с использованием стабилизатора твин 20 вместо стабилизатора плуроника F-127. Объём загрузки – 20 мг С60, 25 мл МП, 50 мл 0,01% раствора твин 20. Выходная концентрация – 0,98 мг/мл в 20 мл. Потери на мембране составляют 0,04 мг С60. Спектральные характеристики полученного ВРФ не отличаются от ВРФ, полученного в примере 2.
[69]Пример 8. Эксперимент проводят по методике, описанной в примере 3, однако с использованием стабилизатора твин 80 вместо стабилизатора плуроника F-127. Объём загрузки – 20 мг С60, 25 мл МП, 50 мл 0,01% раствора твин 80. Выходная концентрация – 0,97 мг/мл в 20 мл. Потери на мембране составляют 0,06 мг С60. Спектральные характеристики полученного ВРФ не отличаются от ВРФ, полученного в примере 2.
[70]Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.
