Способ получения пептидов с последовательностью актг-человека,содержащих в -конечном положении аминооксикислоту

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ

С ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ АКТГ-ЧЕЛОВЕКА,

СОДЕРЖАЩИХ В N-KOHE4HOM ПОЛОЖЕНИИ

а-АМИНООКСИКИСЛОТУ

слойыой хроматографии проводились на силикагеле по Шталю со следующими системами растворителей.

Этилацетат - (пиридин - уксусная кислота - вода 20 : 6 : 1 1) 8 : 2.

Этнлацетат - (пиридин - уксусная кнслота - вода 20:6: 11) 6:4.

Этил ацетат-пиридин муравьиная кислота --вода 50:20:6:5,5.

Хлороформ - метанол 98 : 2.

Хлороформ - метанол 95 : 5.

П р и м ер 1. Аминооксиацетил -- тирозил - серил - метиопил - глутамил - гистидил -

-фенилаланил - аргинил - трпптофил -

-глицил - лизил - пролил - валил - глицил - лизил -- лизил - аргинил-пролил-

-валил - лизил - валпл - тирозил - пролил - аспарагинил - аланил - глицил -

-глутаминовая кислота.

0,600 г (0,143 моля) БОС - аминооксиацетил - тирозил - серил - метионил - у - OBut - глутамил-гистидил-фенилаланил-

-аргпипл - триптофил - глицил-s-ВОС-

-лизил - пролил - валил - глицил - е - -ВОС --лизил -- 8 - ВОС - лизил - аргинил - аргинпл - пролил - валил-s-ВОС-

-лизил - валил - OBut - тирозил - нролил - OBut - аспартил-аланил - глицил -

-у-OBut - глутамил - OBut-3HCl растворяют в смеси из 4,8 мл трифторуксусиой кислоты , 0,6 мл воды и 0,6 мл анизола. Раствор оставляют стоять при комнатной температуре в течение I час, а затем разбавляют 60 мл эфира. Выиавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат в вакууме над пятиокисью фосфора и гидроокисью калия. Получают 0,538 г (87%) замещенного трифторацетата октакозапептида.

Полученный трифторацетат октакозапептида пропускают через колонку с Дауэкс 1X8 в ацетатной форме. Ацетат октакозапеитида наносят иа колонку с ионообменником Ватман СМ-51, разделение проводят с помощью аммопийацетатного буфера (0,01 М, рН 4,5; 0,4 М, рН 6,7). Содержащие целевое вещество фракции собирают и лиофилизуют. Получают 0,22 г (34%) октакозанентида.

Аминокислотный анализ показал следующее соотношеппе комионентов: лизин 4,05 (4); гпстидин 0,93 (1); аргииин 3,08 (3); аспарагин 0,99 (1); серии 0,79 (1); глутаминовая кислота 2,05 (2); пролин 3,09 (3); глицин 3,04 (3); аланин 0,92 (1); валин 3,12 (3); метионин 0,60 (1); тирозин 1,88 (2); феиилаланин 0,85

(1).

Применяемый в качестве исходного вещества гидрохлорид защищенного октакозаиеитида получают следующим образом:

А. грет-Бути локсикарбониламинооксиуксусная кислота.

316,0 г (2,27 моль) грет-бутилоксикарбонилгидроксиламина растворяют в 2680 мл этанола и к раствору при охлаждении добавляют 207,8 г (5,19 моль) гидроокиси натрия и 350,4 г (2,52 моль) монобромуксусной кислоты . Реакционную смесь кипятят в течение 20 мин, затем отгоняют растворитель. Остаток растворяют в 1940 мл воды и подкисляют до рН 3 концентрироваиной НС1. После 2 час охлаждения и перемешивания отфильтровывают выделившиеся кристаллы. Сырой продукт (419 г) кристаллизуют из смеси хлороформа и н-гексапа. Выход 388,8 г (86%): т. ил. 115- 116°С.

Пайдено, %: С 43,9; П 6,9; N 7,1. CynisNOs.

Вычислено, %: С 44,0; И 6,8; N 7,2. Б. 7рсг-Бутилоксикарбонил-аминооксиацетил - тирозил - сери.л -- - мегионил - NH-

-NH2.

1.72 г (9,0 ммолей) г/7ет-бутилоксикарбопиламинооксиуксусной кислоты и 4,50 г (10 ммоль) хлоргидрата метилового эфира тирозил - серил - метиопина растворяют в

10 мл диметилформамида. Раствор охлаждают до и обрабатывают 1,11 мл (10 ммоль) метилморфолина, а затем 1,85 г (0,9 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 час при 0°С

и оставляют стоять при комнатной темнературе до следующего дня. После этого выпавшую дппиклогексил мочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают, а остаток растворяют в 200 мл этилацетата. Раствор промывают 1 н.

НС1 (2X100), 8%-ным раствором КПСОз (2X100). водой (1X100), затем сушат и упаривают . По.тученный метиловый эфир тетранептида (4,5 г) растворяют в 45 мл метанола, раствор смешивают с 1,26 .мл (26,0 ммоль)

гидразингидрата и реакционную смесь оставляют стоять на ночь при комнатной температуре . После этого раствор упаривают, остаток растирают с этилацетатом, отфильтровывают, осадок промывают этилацетатом и эфиром и

высушивают пад копцентрированной серной кислотой. Получают 3,30 г (62,5%) гидразида защищенного тетрапептида. Температура плавления перекристаллизованного из воды прод,укта около 137°С.

Найдено, %: С 49,0; Н 6,6; N 14,4.

С24Пз8Мб09.

Вычислено, %: С 49,1; П 6,5; N 14,4. Б. Хлоргидрат трег-бутилоксикарбонил - алппю - оксиацетил - тирозил - серил -

- метионил - у - OBut - глутамил, гистидил - фенилаланил-аргинил - триптофил- - глицил-е-ВОС - лизил - пролил - ва .лил - глицина. 0,41 г (0,70 ммоль) г/7ег-бутилоксикарбоНИЛ-аминооксиацетил - тирозил - серил- метионин - растворяют в 5 мл диметилформалшда . В охлажденный до -20°С раствор по каплям вливают 0,4 мл этилацетата, насыщенного НС1 (4,4 н.), а затем 0,105 мл

(0,85 ммоль) г/ ег-бутилнитрита. Реакционную смесь перемешивают при -10°С в течение 5 мин, затем охлаждают до -20°С и к ней добавляют раствор 0,96 г (0,70 ммоль) 7-But-глутамил-гистидил-фенилаланил-

-аргинил - тринтофил - глицил-в-ВОС- -лизни-пролил-валил-глицина и 0,48 мл (2,8 ммоль) диизопропиламина в 8 мл диметнлформамида . Реакционную смесь перемешивают при температуре от - 5 до в течение 1 чае и оетавляют етоять на ночь при . После этого раетвор упаривают, а остаток перетирают с 8%-ным раствором двууглекислого натрия. Осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат. Получают 0,93 г (69%) защищепного тетрадекапептида. Последиий суспензируют в 6 мл метанола и обрабатывают раствором .лоргидрата ниридииа. приготовленного из 1,35 мл пиридина п 1.35 мл ,ентрированиой соляной кислоты. Полученный раствор разбавляют 50 мл воды, выпавгиий хлоргидрат тетрадекапентида отфильтровывают , промывают водой, а затем суигат. Вы.ход 0,78 г (57%); т. ил. 202-204 0; Rr 0,18. C9oHi32N2iO24ClS (1959,66). Г. т/оег-Бутилоксикарбоннл-аминооксиацетил - гирозил - серил --- метионил - у--OBut - глутамил - гистидил -- фенилаланил - аргиннл - трннтофил -- глицгм -е - -вое - лизил - F - вое - лизнл аргинил - аргинил - нролил - валил - Р - -вое - лизил - валил - OBut---тиpoзнл--нролил--аепартил -- аланил -- г.ицил--V -OBut - глутамил -- OBut-ЗНС. 0,346 г (0,176 миллимоль) хлоргидрата г оет-бутилоксикарбонил-аминооксиацетил- -тирозил - сери;1 - метнонил - v OBut- - -глутамил - гистидил - феинлаланнл-аргиннл - тринтофил - глтнтил - е - ВОС - -лизил-пролил-валнл - глицниа. 0,400 г (0,176 ммоль) g - ВОС - лизил-е--ВОС- -лизил - Е - ВОС - лизнл - аргинил - -аргинил - пролил - валил - Е - ВОС - -лиЗИЛ - валил - тирозил - ирол«л -Р- -OBut - аснартил - аланнл - глицнл - -глутамил--OBut-ЗНС1 иО,281г (1,05 ммоль) пентахлорфенола растворяют в 3,3 мл диметилформамида и к раствору добавляют 0,025 мл (0,18 моль) трнэтиламина, а затем 0,074 г (0,36 Л1моль) днциклогексилкарбодимнда . Реакционную смесь оставляют етоять при комнатной температуре двое суток, затем отфильтровывают вЕянавшую дициклогексилмочевину , а фильтрат разбавляют 30 мл эфира . Выпавший нродукт отфильтровывают, промывают эфиром, а затем сушат. Гидрохлорид занлищенного октакозапептида получают с выходом 0.640 г (87%); т. пл. 208-212 С; R 0,22. С19.4Нз1,К.иО49С1з (4182,29). П р и м е р 2. Аминооксипропнонил - тирозил - серил - метионил - глутамил - гистидил - фенилаланнл - аргинил - тринтофил - глицил - лизил - пролил - валил - - глицил - лнзил - лизил - аргнннл - аргинил - нролил - валил - лизнл -- -тирозил - пролил - аспартил-аланил - глицн; - глутамнновая кислота. ГУ „ ,1О ,,,,л Л -T-MXJT- глл-т-тг чг.т./«тпа рил - метионил - у - OBut - гл тампл - --- гистидил -- феиилалаипл -- аргинил - -триптофнл - глнцил - S - ВОС-лизил- -пролил - валил - глицил - 8 - ВОС- -лизил-Е-ВОС-лизил - аргинил - аргинил-иролил-валил-е-ВОС - лизил-валил-OBut-тнрозил - пролил-Р-OBut - -аспартил-алаиил-глицил - у - OBut- -глутамнл-OBut-ЗНС растворяют в смеси из 4,8 мл трифторуксуспой кис.юты, 0,6 м,1 гюды и 0,6 м, анизола. Раствор оставляют стоят) в течепис 1 час npii к()л;н:;т:;о; тол;1;ерагуре. а затем разбав.чяют 60 мл эфира. Вы.1елииипп1ея осадок отфильтровы: ают, промывают эфиром и сушат в вакууме над пигиокисью фосфора и гидроок1 сью калия. Трифторацетат зашищеиного октакозапептидй получают с выходом 0.532 г (86,5%). Полученный сырой трнфторацстат рас воряют в 10 Л1Л воды и пропускают через колонк с Дауэкс 1X8 в ацетатной форме. Получениый раствор, содержаидий ацетат окгакозапептида, ианосптся на колонку, занол.нсннхю ионообменной смолой Ватман СД1-52. Разделение провод ;т с помслцыо градие1ггиого элюирования аммо11нйацетатцым буферов (0.01 У, рП 4,5; 0,4 . рП 6.7). Фракцнн, содержащне целевой продукт, лиофнлизуют. Получают 0,23 г (42%) октакозапептнда. Соотношение тирозин -ется 2,10. .- м П1окис.ютный ана.П;з показал содержание колпюнентов в следуктщсм соотношении: лизин 3,89 (4); гистт1дин0,97 (1); арпп-пш 3,00 (3); аснарагин 1,10 (1); серии 0,97 (П; глутаминовая кислота 1,9-1 (2) глицин 3.06 (3); аланин 2,84 (31; метнон1ш 0,68 (П: фенилаланни 1,06 (1). Примененный в качестве исходного вещества тригидрохлорнд защнщеглюго октакозанептида нолучают ,им образом. А. 7/;ег-Бутноксикарбон л - L-a-аминоокснпропионовую кислоту получают нз 4,09 г (29 ммоль) О-сх.-бромпронионовой кнслоты, 3,62 г (65 ммоль) гндроокнсн калн.ч и 4,39 г (33 лшль) грсг-бутилокснкарбо1П1л -- гидроксиламина ло способу, указанному в примере 1. Сырой нродукт растворяют в эфире и обрабатывают 6,3 мл (32 ммоль) дициклогексилам1П1а . Полу ч а ОТ днцнклогекс 1ламонийну10 еоль трсг-бутилоксикарбонил-Ь - о: - аминоокснпронноновой кнслоты с выходом 6,7 г (60%), т. пл. 157С. Дициклогексиламонийную еоль суспендируют в эфире, суспензию встряхивают с 0,2 и. серной кислотой, эфирную фазу упаривают и получают 3,05 г (50%) г/оег-бутилоксикарбопил-L - ос - аминооксипропиоиовой кислоты , т. пл. ПО-112 С; (, этанол). Найдено. РЛ : С 46,6; П 7,5; N 6.8. ГЛ-Т,.Пг.

Б. трег-Бутилоксикарбонил - сс-аминооксипропионил - тирозил - серил - метнонил -

-N2H3.

1,44 г (7,0 ммоль) грег-бутилоксикарбоНИЛ - 06 - аМИНООКСИПрОПИОНОВОЙ кислоты II

3,50 г (7,8 ммоль) хлоргидрата метилового эфира тирозил - серил - метионина растворяют в 12 мл димстилформамида.

Раствор охлаждают до 0°С и обрабатывают 0,85 мл (7,8 ммоль) N-метилморфолина, затем смешивают с 1,48 г (7,2 ммоль) дициклогекснлкарбодиимида . Реакционную смесь при 0°С леремешивают в течение 1 час и оставляют стоять ночь при комнатной температуре. Отфильтровывают выпавшую дициклогексилмочсвину , фильтрат упаривают, а остаток перетирают с зтилацетатом. Продукт отфильтровывают , промывают этилацетатом и эфиром, а затем высушивают над концентрированной серной кислотой. Гидразид защищенного тетрапептида получают с выходом 2,1 г (50%); т. пл. 147°С (после перекристаллизации из воды ) ; R I 0,43.

Найдено, %: С 49,6; Н 6,7.

С25Н4оНбО95.

Вычислепо, %: С 50,0; Н 6,7. В. Хлоргидрат грег-бутилоксикарбонил-аамипооксипропионил - тирозил - серил -

-метионил - Y - О But - глутамил - гистидил - фенилаланил - арганил - трлптофил - глицил - 8 - БОС - лизил - пролил - валил - глицина.

0,266 г (0,44 моль) грег-бутилоксикарбонил - а. - аминооксипронионил - тирозил -

-серил - метионил - N2H3 растворяют в 3,2 мл диметилформамида ц раствор охлаждают до -20°С. При перемешивании по каплям вводят 0,41 мл этилацетата, насыщенного НС1 (4,4 Н.), затем 0,07 мл (0,59 ммоль) трет-бутилнитрита . Реакционную смесь церемешивают при -10°С в течение 5 мин затем охлаждают до - 20°С и добавляют к ней раствор 0,600 г (0,438 ммоль) глутамил - гистидил -

-фенилаланил - аргинил - триптофил -

-глицил - 8 - вое - лизил - пролил -

-валил - глицина, и 0,31 г (1,8 ммоль) диизопропилэтиламина в 5 мл диметилформамида . Реакционную смесь в течение 1 час неремешивают при температуре от -5 до 0°С, а затем оставляют стоять ночь при 0°С. На следующий день диметилформамид отгоняют, а остаток перетирают с 8%-ным раствором двууглекислого натрия. После фильтрования, промывки водой и последующей сушки получают 0,70 г (81%) защищенного тетрадекапептида. Из 1 мл пиридина и 1 мл концентрированной соляной кислоты готовят раствор хлоргидрата пиридина и добавляют его к суспендированному в 5 мл метанола защищенному тетрадекапептиду . Полученный таким образом раствор разбавляют 50 мл воды, выпавший осадок оттида получают с выходом 0,513 г (59,5%); т. пл. 200 -202Т; Rf 0,19.

Г. грег-Бутилоксикарбопил - а-аминооксипропнопил - тирозмл - серил - метионнл -

-- у - -OBut - глутамил - гистидил - фе}П1лалани ,-1 - аргинил - триптофил - глицил - е - вое - лизил - пролил - валил - глицил - 8 -- БОС -- лизи;г - аргинил - аргинил-пролил-валил - 8 -ВОС-

-лизил - валил - OBut - тирозил - пролил - аспартил - аланил - глицил - - - -OBut -- глутамил - OBut.3HCl.

0,348 г (0,176 ммоль) хлоргидрата грет-бутилоксикарбонил - а-аминооксипропионил-

-тирозил - серил - метионил - у-OBut- -глутамил - гистидил - фенилаланил-аргиннл - триптофил - глиццл - 8 -ВОС -

-лизил - пролил - валкл - глицина 0,400 г (0,176 ммолей) - е - ВОС - лизил -- лизил - аргинил - аргинил - пролил - валил - 8 - ВОС - лпзил - валил - OBut -

-тирозил - пролил - |3 - OBut - аспартил - аланил - глицил - - OBut - глутамил - OBut-3HCl и 0,281 г (1,05 ммоль) пентахлорфенола растворяют в 3,3 мл диметилформамида . К раствору добавляют 0,025 мл (0,18 ммоль) триэтиламина, затем 0,074 г (0,36 ммоль) дициклогексилкарбодиимида (DCC). Реакционную смесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение двух суток, затем отфильтровывают дициклогексилкарбамид , а фильтрат разбавляют 30 мл эфира. Выделившийся продукт отфнльтровывают , промывают эфиром, а затем сушат . Хлоргидрат защищенного октакозанептида получают с выходом 0,658 г (89%); т. пл. 175-177°С; R 0,25.

Пример 3. Аминооксипропионил - тирозил - серил - метионил - глутамил - гистидил - фенилаланил - аргинил - триптофил - глицил - лизил - пролил - валил -

-глицил - лизил - лизил - аргинил - аргинил - пролил - валил - лизил - валил -

-тирозил - пролил - аспартил -- аланил- -глицил - глутаминовая кислота.

0,600 г (0,142 ммоль) грег-б тилоксикарбонил - D - и-аминооксипропионил - тирозил - сери.л - мстиопил - глутамил - гистидил - фенплаланил - аргинил - триптофил - глицил - е - ВОС - лизил - пролил - валил - глицил - в - ВОС - лизил - в - БОС - лизил - аргипил - аргиНИЛ - пролил - валил - 8 - ВОС - лизил - валил - OBut - тирозил - пролил -

-OBut-аспартил - аланил - глицил -

-Y - OBut - глутамил - OBut-НС растворяют в смеси из 4,8 мл трифторуксусной кислоты , 0,6 мл воды и 0,6 мл анизола. Раствор оставляют стоять при комнатной температуре в течение 1 час, л затем разбавляют 60 мл эфира. Быцавши; осадок огфцл1)Тровывают, Выход трифторацета октакозапептида составляет 0,546 г (88,5%). Трифторацетат растворяют в 10 мл воды и трифторацетатные ионы с помощью ионообменной смолы Даузкс 1X8 обменивают на ацетатные ионы. Полученный таким образом раствор, содержащий ацетат замещенного октакозапептцда , вносится на колонку, заполненную цонообменной смолой марки Ватман СМ-52. Целевой продукт выделяют градиентным элюированием аммонийацетатным буфером (0,01 М, рН 4,5; 0,4 М, рН 6,7). Фракции, содержащие целевое вещество, собирают и лиофилизуют . Выход октакозапептида составляет 0,245 г (39%). Содержание метионпнсульфоксида 2,57%. Соотнощение тирозина - триптофана равно 2,07. Аминокислотный анализ: лизин 4,35 (4); гиетидин 0,97 (1); аргинин 3,13 (3); аспарагиновая кислота 1,06 (1); серин 1,00 (1); глутаминовая кислота 1,92 (2); пролин 2,90 (3); глицин 3,00 (3); аланин 1,00 (1); валин 2,92 (3); метионин 0,87 (1); тирозин 2,21 (2); фенила л анин 1,06 (1). Пример 4. а-Аминокси - |3 - гидрооксипропионил - тирозил - серил - метионил - глутамил - гистидил-фенилаланил- -аргииил - триптофил - глицил-лизил - -пролил - валил - глицил - лизил - лизил - аргинил - аргинил-пролил -валил- -лизил - валил - тирозил - пролил - аспартил - аланил - глицил - глутаминовая кислота. 0,600 г (0,142 ммоль) г/оет-бутилоксикарбонил - а - аминоокси - р - гидрооксипропионил - тирозил - серил - метионил-7- -OBut - глутамил - гистидил - фенилаланил - аргинил - триптофил - глицил - - - вое - лизил - пролил - валил - -глицил - 8 - вое - лизил - 8 - вое- -лнзил - аргинил - аргинил - пролил - -валил - 8 - вое - лизил - валил - -OBut - тирозил - пролил - р - OBut - -аспартил - ее - аминооксипропионил - -глицил - 7 - OBut - глутамил - OButЗНе растворяют в смеси из 4,8 мл трифторуксусной кислоты 0,16 мл воды и 0,6 мл анизола , емесь оставляют стоять при комнатной температуре в течение часа, а затем разбавляют 60 мл эфира. Выделившийся осадок отфильтровывают , промывают эфиром и сущат над пятиокисью фосфора и гидроокисью калия в вакууме. Получают 0,400 г (65%) трифторацетата замещенного октакозапептида. еырой Трифторацетат растворяют в 8 мл воды и пропускают через колонку с Дауэкс 1X8 в ацетатной форме. Полученный таким образом раствор, содержащий ацетат октакозапептида, наносится на колонку, заполненную ионообменной смолой марки Ватман еМ-52, и элюируется градиентным элюированием аммонийацетатным буфером (0,1 М, рН 4,5; 0,4 М, рН 6,7). Фракции, содержащие целевое вещество, собирают и лиофилизуют. Получают 0.240 г (41,5%) октакозапептида , пептидное содержание которого по измерениям методом поглощения ультрафиолетовых лучей составляет 81,6%. Содержание метионина - сульфоксида 4,4%. еоотнощение тирозина - триптофана равно 2,13. Аминокислотный ана,1из: лизин 3,92 (4); гиетидин 1,00 (1); аргинин 3,15 (3); аспарагин 0,99 (1); серин 0.83 (1); глутаминовая кислота 1,94 (2); пролин 3,00 (3); глицин 3,05 (3), аланин 1,04 (1); валин 2,92 (3); метнопин 0,79 (1); тирозин 1.83 (2): феннлалапин 0.97 Пример 5. й-Амино - я - гидроксипропиоНИЛ - тирозил - серил - метиопил - r;iyтамил - гистидил - фснилаланил - аргинил - трипфтофил - глицил - лизил - пролил - валил - глицил - лизил - лизил - -аргииил - аргинил - проли,т - валил - - лизил - валил - тирозил - пролом -- аспартил - алани,т - глицил - глутамнногззя кислота. 0,600 г (0,142 ммоль) ВОе-D-я-амииоокси-р-гидроксипропцон 1л-тирозил-серил - -метионил-Y OBut-глутамил -гистид1 л- -фенилаланил-аргинил-триптофил - глицил-8-ВОе-лизил-пролил-валил - глицил - е-ВОе - лизил - f-BOe - лизил - -аргинил - аргинил - пролил -- валил ---Е-ВОе - лизил - валил - OBut - ттгрозил - пролил - р - OBut - аспартнл - -аланил - глицил - - глхтамнл - -OBut-3Hei растворяют в смеси из 4,8 мл трифторуксусной кислоты 0,6 мл воды и 0,6 мл анизола. Раствор оставляют в течение 1 час при комнатной температуре, а затем добавляют 60 мл эфира. Выпавший осадок отфильтровывают , промывают эфиром и над нятиокисью фосфора ц гидроокисью калия в вакууме . Трифторацетат замещенного октакозапептида получают с выходом 0,533 г (86,5%). еырой Трифторацетат растворяют в 10 м,т воды и пропускают через колонку с Дауэкс 1X8 в ацетатной форме. Полученный раствор, содержащий ацетат замещенного октакозапептида , наносится на заполненную ионообменной смолой марки Ватман еМ-52 колонку и элюируется аммонийацетатным буфером линейным буферным гpaдиeнтo t, (0,01 М, рН 4,5; 0,4 Л1. рН 6,7). Фракции, содержащие целевое вещество , собирают и лиофилизируют. Получают 0,250 г (43%) октакозапептида, содержащего 81,0% пептида, еодержание мет юнцнсульфоксида 4,4%. еоотнощение тирозина - тринтофана состав,1яет 2,05. Аминокислотный анализ: лизин 3,76 (4); гиетидин 0,8 (1); аргинин 3,05 (3); аснарагин 1,00 (1); серин 0,73 (1); глутаминовая кислота 1,94 (2); пролин 3,00 (3); глищш 2,95 (3): аланнн 1,05 (1), валин 2,82 (3): метнонип 0,78 (1); тирозин 1,6 (2); фенилаланин 0,83 (1). П р и М е р 6. D-a-Аминоокси - (З-гидроксипропионил - гнрози,1 - серил --- lelпoнIIл- -глутамил - гистидил - фенилаланил - - аргинил - триптофил - глицил - лизил-

-пролил - валил - глицил - лизил - лизил - аргинил - аргинил - пролил - валил - лизил-валил-тирозил-пролил-аспарагинил-глицил - аланин - глутамил - аспартил - глутамил - серил - аланин.

1,00 г (0,214 ммоль) т/ ег-бутилоксикарбоиил - D-a-аминоокси - (3 - гидрокси - пропионил - тирозил - серил - метионил -

-YOBut - глутамил - гистидил - фенилаланил - аргинил - триптофил - глицил -

-8-ВОС - лизил - пролил - валил - глнцил - g-BOC - лизил - S-BOC - лизил -

-аргинил - аргинил - пролил - валил -

-е-ВОС - лизил - валил - OBut - тирозил - пролил - р - OBut - аспартил-глицил - аланил - Y - OBut - глутамипил -

-OBut - аспартил - OBut - асиартил - Y - OBut - глутамил - серил - аланил -

-OBut-3HCI растворяют в смеси из 8 мл трифторуксусной кислоты, 1 мл воды и 1 мл анизола. Раствор при комнатной температуре оставляют на 1 час, а затем разбавляют 200 мл эфира. Выделившийся осадок отфильтровывают , промывают эфиром и сушат в вакууме над пятиокисью фосфора и гидроокисью калия. Трифторацетат замещенного дотриаконтапептида получают с выходом 0,90 г (88%).

Сырой Трифторацетат растворяют в 20 мл воды и пропускают через колонку с Дауэкс 1X8 в ацетатной форме. Полученный раствор, содержащий ацетат замещенного дотрнакоптапептида , наносится на занолнепную ионообменной смолой Ватман СМ-52 колонку.

Разделение проводят при помощи линейного градиентного элюирования аммонийацетатным буфером (0,01 М, рН 4,5; 0,4 М, рН 6,7). Фракции, содержащие целевое вещество, собирают и лиофилизуют. Пол)чают 0,46 г (46%) дотриаконтаиептида.

12

Предмет изобретения

1.Способ получения пептидов с последовательностью АКТГ-человека, содержащих в N-конечном положении сс-аминооксикислоту, отличающийся тем, что, от пептидов последовательности от АКТГ- до , содержащих в N-конечном положении сс-аминооксикислоту и вместо ряда аминокислот природного человеческого АКТГ другие аминокислоты и защищенных по N-конечной аминооксигрунпе и аминогруппам боковых цепей, а также но конечной карбоксильной группе и карбоксильным группам боковых цепей, отщепляют защитные группы, и полученные соединения переводят в соли или комплексы известным способом.

2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве N-конечпой аминооксикислоты используют аминооксиуксусную кислоту или D- или /,-а-аминооксинропионовую кислоту или D- или L-a-аминоокси-р-оксипропионовую кислоту.

3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве исходного вещества используют пептид, в котором аспарагин в 25 положении замещен аспарагиновой кислотой или глицин в 26 положении замещен на Ala, или аланин в 27 положении замещен на глицин.

4.Способ по пп. 1-3, отличающийся тем, что в качестве исходного вещества используют пептид, в котором аминоокси и аминогруппы защищены г/5ег-бутилоксикарбопильной группой, и карбоксильные группы защищены г/рег-бутильной грунпой.

5.Способ но п. 4, отличающийся тем, что защитные группы удаляют ацидолизом.

6.Способ по пн. 4 и 5, отличающийся тем, что защитные группы отщепляют трифторуксуспой кислотой.