Способ получения антибиотиков

Изобретение относится к снособу получения антибиотиков биологическим путем с .использованием в качестве грибов-продуцентов представителей класса Streiptomyces и культивированием последних .на питательных средах, содержащих источники углерода, азота и минеральных элементов.

Для получения комплекса полиоксинов J, К и L общей форМулы

О

R-CO

1

COHNCH

jNCH I 0

неон

ОН он

I носи

I

CHjOCONHa

в которой R - гидроксил, когда или 0; и R означает

СООН СНз-СН мкогда /г 0; в качестве гриба-продуцента берут Streptomyces cacaoi var. asoensis штаммы АТСС 19093 и АТСС 19094 и полученную смесь полиоксинов J, К и L разделяют. Культивирование штаммов |ведут в аэробных условиях глубинным методом лри перемешивании питательной среды, содержащей источники углерода, азота и минеральных элементов, предпочтительно при температуре 25-35°С в

течение времени, достаточного для достижения максимального выхода готовых продуктов .

В качестве источннка углерода используют крахмал, декстрины, глюкозу, глицерин, мальтозу и фруктозу.

В качестве источника азота применяют мясные экстракты, пептон, кукурузный экстракт, соевую муку, размолотый арахис, хлопковый жмых и дрожжи.

В качестве источника минеральных элементов берут хлористый натрий, хлористый калий , .карбонат кальция и фосфаты.

Разделение нолученной смеси .иолиоксинов J, К и L производят на колонках с целлюлоЗОЙ с использова-нием смеси растворителей: бутанола, уксусной кислоты и воды, взятых в соотношении соответственно 4:1:2.

Если R-гидроксил, а , то этот антибиотик называется полиоксином J; если R GOOHN обоЗНача-ет N, а , т антибиотик называется полиоксином К; если R-гидроксил, а п 0, то антибиотик назы вается полиоксищом L. Штаммы АТСС 19093 и АТСС 19094 явля ются мутантами S. cacaoi и относятся к груп пе S. griseus. Второй штамм почти идентичен первому, но отличается по окраске на обрат ной стороне агара Чалека. Ниже приводится более -подробная характе ристика обоих штаммов (типы 1 и 2). I,Наблюдения под микроскопом. Хороший рост .наблюдается 1при 20-32°С. Воздушный -мицелий .мон0 подиально развет влен на синтетическом и протеинсодержашем агарах. Опорофоры образуют открытые опирали и не скручиваются. Форма и размер спор асимметричная стержиеподобная (1,5-1,80 ,5--0,7 мк) или овальная (1,2-1,0-1,0- 0,7 мк), .паверяность спор гладкая. II.Культуральные признаки S. cacaoi var asoensis. Агар Чапека, 27°С. Тип 1 хорошо растет в бесвдетном виде или бело-желтом и образует обильный воздушный мицелий, который по виду порошкообразен и Меняется от белого до дымчато-серого. Обратная сторона бледно-оливко1ВО-желтая без растворимого -пигмента. Тип 2 образует воздушный мицелий, который по виду порош-кообразен и меняется от белого до дымчато-серого. Обратная сторона с желтым оттен-ком бледно-розового цвета. Глицериновый агар Чапека, 27°С: Тип 1 растет хорошо, бледно-оливково-темно-желтого -цвета. Образуется незначительное количество (или вовсе не образуется) тонкого белого воздушного мицелия. Обратная сторона бледно-оливково-желтая или кремовая, без растворимого пигмента. У типа 2 не образуется воздушного мицелия , остальное, «а-к у типа 1. -Питательный агар, 27°С: Тип 1 растет хорошо, скручен, дымчато-серый , образуется незначительное количество воздушного мицелия, цвет которого меняется от белого до светло-серого. Обратная сторона коричневато-желтого -цвета п дает коричневый растворимый пигмент. Тип 2 растет, как тип 1, образует незначительное количество воздушного мицелия белого или беловато-серого цвета. Получается меньше растворимого шигмента, чем у типа 1. Глюкозопептоновый агар, 27°С: Тип 1 имеет цвет от кремового до светло-серо-оливкового . Образуется небольшое количество серого воздушного мицелия «ли вовсе не образуется. Обратная сторона светло-коричневая и дает светло-коричневый пигмент. Тип 2 растет скудно со слабым образованием белого или светло-серого воздушного мицелия в по-следний период выращивания. Обратная сторона оливково-желтая. Глюкозоаопарагиновый агар, 27°С: Ти-п 1 растет скрученным и меняет окраску от белой до желтой, образует воздушный мицелнй от белого до светло-серого или серого цвета. Обратная сторона бронзово-желтая и не дает растворимого пигмента. Тип 2 дает незначительный рост воздушного мнцелня, но идет незначительное образова иe бело-серого воздушного мицелия. Крахмальный агар, 27°С: Тип 1 растет хоро-шо, бесцветный -или оливкоБо-коричневый , образ-ует -большое количество порошкообразного светло-мышиного воздушного мицелия. Обратная сторона оливково-желтая и не дает растворимого пигмента. Гидролнзующая активность по крахмалу нормальная . Тип 2 - то же, что для типа 1. Кальциймалеатный агар, 27°С: Тип 1 растет бесцветным или светло-коричневым и желтым, образует обильный воздушный мицелий мышиного цвета. Обратная сторона кремово-л елтая и дает некоторое количество светлого желто-коричневого растворнмого пигмента. Тип 2 - то же, что тип 1. Тирознновый агар, 27°С: Тип 1 дает рост слабый, коричневый цвет и не образует -воздуш-ного мицелия. Обратная сторона кремового цвета и не дает растворимого пигмента. Тип 2 - то же, что ти-н 1. Янчноальбумкновый агар, 27°С: Тип 1 растет хорошо, бесцветный или белый, е образует значительных количеств воздушого мицелия, но иногда в последний период ыраш,ивания дает очень небольшой белый оздушный мнцелий. Обратная сторона беая и не дает растворимого пигмента. Тип 2 - то же, что тип 1. Агар на овсяной муке, 27°С: Тин 1 растет оливково-желтого цвета и обазует некоторое количество светло-серого оздушного мицелия. Иногда не образуется оздушный мицелий. Обратная сторона бесветна и не дает растворимого нигдмента. Тип 2 - то же, что тип 1. Картофельная масса, 27°С: Тип 1 ра-стет хорошо, темно-оливковый цвет, бразует бледно-серый воздушный 1мицелий. реда меняет цвет до светло-дымчато-серого. Тип 2 - то , что тип 1. Желатиновая культура, полученная путем нокуляции уколом, 18°С: Тип 1 растет хорошо со слабым ожижением елатины. Образуется в небольшом количеве темно-коричневый растворимый пигмент. Тип 2 не дает ожижения желати-ны. Глюкозный бульон, 27°С: Тин 1 растет хорошо на поверхности и под верхностью ра-створа и дает растворимый ричневый пигмент. Тип 2 - то же, что тип 1.

Тип 1 растет хорошо «а поверхности и на дне раствора и образует на поверхности тонкие пленки вместе с небольшим количеством белого воздушного мицелия. Не образует растворимого пигмента.

Тип 2 1не дает лленок на поверхности.

Образование мела-нина: оба типа 1 и 2 не образуют.

Восстановление нитратов: оба типа 1 и 2 слегка полол ительны.

Целлюлозная среда.

На синтетическом «ультуральном растворе, содерл ашем в качестве источника углерода целлюлозу, роста лет.

Питательный агар (мясо, лептон и глюкоза ).

Тип 1 растет хорошо, светло-оливково-желтого цвета, скручен, образует незначительное количество белого воздушного мицелия, который ииогда не образуется. Обратная сторона культуры окрашена в белый цвет, тип 1 дает небольшое количество черного растворимого пигмента.

Тип 2 растет хорошо, кремово-желтого цвета без образования воздушного мицелия. Обратная сторона гладкая. Тип 2 подобен типу во других отношениях.

Лефлеровокая сыворотка, 27°С:

Тип 1 растет хорошо, оливково-желтый цвет, сильно скручен и ,не образует мицелия. Образует растворимый пигмент в небольшом количестве.

Тип 2 - то же, что тип 1.

Лекмусовое молоко, 27°С:

Тип 1 растет, образуя коричневые кружки на поверхности .и не вызывает коагуляции или пептонизации. На 20-й день после начала выращивания рН 4,0-5,0.

Тип 2 растет в виде -кружков на поверхности и вызывает постепенную коагуляцию со слабой пептонизацией. На 20-й день после начала вырашивания рН 7,8-8,0.

III.Физиологические -свойства. Оптимальные условия для роста: рН 6-8

(типы 1 и 2); температура 25-30°С (типы 1 и 2); облигатный аэроб (типы 1 и 2).

Критические условия для возможного роста: рН 9 и 4 (тип 1); 10 и 4 (тип 2); температура 18 и 37°С (типы 1 и 2).

Тирозиназа: реакция слабо положительна (типы 1 и 2).

Пептонизация молока: пт 1 - отрицательна , тип 2 - положительна.

Разложение целлюлозы оба типа 1 и 2 отрицательны.

Хромогенная функция: слабо положительна и иногда отрицательна.

IV.Использование источников углерода. Использование источников углерода, определенное по Т. G. Pritham:

Тип 1 Тип 2

Глюкоза-{-I-|- -f-H-h

Сахароза+ + + -j-|-|Фруктоза Мальтоза Инулин Инозитол Раффиноза

Арабиноза Галактоза Ксилоза Манноза Рамноза

Манзитол Салицин Условные обозначения:

-|-I-|- - хороший рост; ++ -средний рост;

-слабый рост.

Как правило, концентрация антибиотиков в культуре достигает максимума через 40- 120 час культивирования. Поскольку это время максимальной концентрации зависит от условий аэрации и перемешивания даже при одной и той же тем-пературе и среде, желательно в случае определять это время .

Для выделения антибиотиков из культурной среды -применять обычные физикохимические методы. Например, сначала определить мицелий фильтрованием с добавкой способствующего фильтрован-ию вещества , например кислоты или -нейтральной диатом-эвой земли, затем фильтрат сорбировать на активированном угле при кислом или нейтральном значении рН. Антибиотики можно элюировать из активированного угля с помошью растворителя антибиотиков, нанример смеси воды и смешиваюшегося с водой растворителя , нап-ример метанола, этанола, пропанола , бутанола, ацетанола, ацетона, уксусной кислоты или пиридина. Поскольку полисксины являются амфотерными соединениями, они сорбируются на катионообменной или анионообменной смолах и алюируются соответствуюидей кислотой, шелочью или раствором соли. Например, фильтрат культуры после нодкисления можно пропустить через колонну с Доуекс 50 VX8 (тип Н). Полиоксины сорбируются на этой смоле и алюируются с нее водным раствором 5-Vo-Horo хлористого натрия или фосфатным буфером рН 4,3. Подученный таким образом сырой -порошок полиоксинового ком1плекса молшо очистить хроматографией на колонке с помощью ионообменника , например сульфоэтилсефадекса, сульфоэтилцеллюлозы или сульфометилцеллюлозы , или способом зонного электрофореза.

Полное разделение полиоксинов J, К и L быть достигнуто распределительной хроматографией на порошке целлюлозы или

на силикагеле. Ее осуществляют соответствующим р-астворителем, -например смесью воды и смешивающегося с водой растворителя-метанола , этанола, пропанола, бутанола, ацетона , уксусной кислоты, пиридина или 75э/о-ного

элюируют вместе с другими полиоксинами и разделяют.

При перекристаллизации из водного спирта полиоксииы J, К и L получают раздельно в виде бесцветного порошка. Ниже приводятся физи-ко-химические свойства полиоксинов J, К и L.,

Температура разложения: хотя полиоксины J, К и L не дают точной тем-нературы разложения , очевидно, что они постепенно разлагаются без плавления при температуре выше 200°С.

Элементарный состав: вес. %:

J С 41,71Н 5,25N 13,90

К С 44,25Н 5,07N 13,92

L С 40,45Н 5,09N 14,37

Остальное кислород.

Молекулярный вес: J, К и L являются амфотерными соединениями, их молекулярный вес определяют титрованием их эквивалентных Бесов: J 499; К 590; N 495.

Брутто-формула - J : Ci7H23N5Oi2;К :

: CoHsoNeOia; L : Ci6H23N50i2.

Содержание элементов, высчйтамное из молекулярного веса:

J для Cl7H25N50l2.

Вычислено, о/о: С 41,55; Н 5,13; N 14,25; мол. в. 491,41.

К для С2гНзоМбО1з.

Вычислено, о/„: С 45,05; Н 5,16; N 14,33; мол. в. 586,53.

L для Ci6H23N5Oi2.

Вычислено, о/о: С 40,26; Н 4,86; N 14,67; мол. в. 477,40.

Удельное оптическое вращение: J а - +31,7° ( в воде), К -16,5° (С-1 в воде), L ,4° ( в воде).

Ультрафиолетовый спектр поглощения для J, К и L максимум при:

J:0,05 NHC Яшке 264 ммк (, 158)

0,05N NaOH Ямакс 267 ммк (Е™ 133) K:0,05N НС1 Ямакс 259 ммк (Eel 138) 0,05N NaOH А„акс 262 ммк (Eel 109) L:0,05N HCl Ямакс 259 ммк (170) 0,05N.NaOH 1„акс 262 ммк (Eel 132). В результате исследований выяснено, что поглощение для J происходит вследствие наличия в молекуле хромофора тимина. и что поглощение J, К и L происходит вследствие наличия хромофора урацила в их молекулах.

Инфракрасный юпектр поглощения: инфракрасные спектры поглощения для J, К и L измерены «а таблетках бромистого калия. Оанавное поглощение «дет при длинах волн: J 3300-3400, 1680, 1600, 1475, -1408, 1350, 1278, 1125, 1060, 783, 572, К 3300-3400, 1690, 1640, 1470, 1378, 1315, 1283, 1127, 1058, 780, 565 слг-1; L 3300-3400, 1670, 1600, 1460, U12, 1350, 1275, 1120, 1060, 770, 570 с.и).

вальной бумаги N51 (Тойо Роси КО): J 0,08; К 0,22; L 0,08. В этом случае величина Rf для А в качестве стандарта равна 0,19.

Растворимость: J, К и L легко растворимы

в воде, «о трудно растворимы в метаноле, этаноле, ацетане, хлороформе, бензоле и эфире.

Цветные реакции: J, К, L дают положительную нингидринную и диазо-реа:кции и реакцию Tollens и отрицательную реакцию Eehling на 2,4-динитрофенилгидразин, Molish, нитропруоид «атрия хлористого железа и на реакцию Sakaguchi.

Величина Рк:Л, К, L являются амфотерпыми соединениями, каждое из «их имеет по три титруемые группы. Их величины Рк равны: J 3,0; 7,а; 9,9; К 3,0; 7,2; 9,3; L 3,0; 7,1; 9,4. Стойкость: J, К и L несколько нестойки в щелочных растворах, но чрезвычайно стойки

в кислых и нейтральных растворах. При нагревании при 100°С в точение 15 мин не происходит разложения шри рН от 2,0 до 7,0. J, К и L также стойки к ультрафиолетовому освещению. Их фунгицидное действие сохраняется после облучения растворов на расстоянии 30 см ультрафиолетовой лампой мощностью 20 0г в течение 24 час.

Ниже описана биологическая активность -полиоксинов J, К и L.

Антимикробные спектры. В табл. 1 показан антимикробный спектр полиоксинов J, К и L. Минимальную подавляющую концентрацию определяют через 48 час инкубирования в среде ИЗ картофельно-сахарозного агара указанных микроорганизмов.

Эффективность: иолиоксины J, К и L высокоэффективны против Alternaria kikuchiana, Cladosporium fulvum, Gugnardia laricina, Cochliobolus miyabeanus, Sclerotinia cinerea.

Фитотоксичность и токсичность. При испытаниях на растениях риса и различных растениях полиоксины J, К и L нефитотоксичны в концентрации 200 ч./млн. и выше. Следов фитотоксичности не обнаружено даже при

концентрации 800 ч./млн. на растен-иях риса и концентрации 200 ч./млн для других растений, например яблони, груши и томатов.

При испытании на токсичность на мыщах полиоксины J, К и L нетоксичны: при внутренлем влиянии 500 мг1кг, при приеме внутрь 15 г 1кг.

При иопытаНИИ на токсичность на кроликах растворы 400 мг/мл не давали раздражения ири введении в коньюгтивный мешочек кролика .

Не обнаружено кожной токсичности. При испытании на токсичность на рыбах полиоксины J, К и L при концентрации 10 ч./млн нетоксичны при экспозиции в течение 75 час.

Суммируя вышеуказанное, Можно сказать, что ПОЛИОКСИНЫ J, К и L являются антибиоти .ками с нредохранительньгми и лечебными свойствами и эффективны против различных Таблица 1 Антимикробный спектр полноксинов J, К ч L фитотоюсичного и токсичного действия. Эти антибиотики полезны в качестве сельскохозяй ствеилых фунгицидов для защиты растений. Пример 1. Готовят культурную сле Дуюш.его состава, г: глюкоза15 кра.хмал50 соевая мука20 сульфат аммония5 сухие дрожжи10 хлористый натрий5 карбонат кальция2 вода1000 мл рН среды доводят до 7,6 и стерилизую при температуре 120°С (в течение 20 лшн. Штамм S. cacaoi var. asoensis, тип 1, АТСС 19093 ВНосят в питательную среду и фермен тируют В «ей при 27°С /при перемешиваиии которое продолжают до достижения макси мального выхода антибиотиков. Проводя анализ, используя ъ качестве тест-организмо Alternaria Kikuchiana, Cochli.obolus miyabea nus. Пр.и выращивании S. cacaoi var. asoensis тип 1 .-в 300 лл колбе Эрленшейера, содержа щей 70 мл среды, максимальный выход дос тигнут через 72-96 час. При в«есении выра щенного бульона в течение 48 час в ферментя ионный резер1вуар, содержаи ий 400 л такой же среды, и ферментации при перемещивании со скоростью 200 и аэрацци 400 л/мин получают максимум антибиотика через 96- 120 час ферментации. Выход 1800 мкг/мл в пересчете на полиоксин В. Выделение и очистку проводят следующим образом. 430 л ферментированного бульона подкисляют до рН 2,0 10з/(,-ной соляной кислотой, затем нагревают до 70°С н добавляют 9 кг диатомовой земли, затем фильтруют на фильтр-прессе. Фильтрат обрабатывают 8 активированного угля и 8 кг диатомной земли . Перемсил1вают и фильтруют. Активированный уголь иромывают 350 л воды. Активные составляющие элюируют дважды ио 100 л 60%-ного ;водного ацетона. Элюированный раствор выпар шают в вакууме. Таким образом , получа от 4 л жидкости. содержащей нужный продукт. Добавляют 50 л ацетона, полученный оса .т,ок сущат при пониженном давлении и получают 920 г сырого порощка коричиевого цвета . 300 г этого порошка растворяют в воде и подкисляют до рН 2,0. Подкисленный раствор пропускают через колонку, заполненную 4,5 л Доуекс VX8 (50-100 мещ, форме Н). После промывания водой антибиотики элюируют 5э/о-ным водиым раствором хлористого натрия. Активные элюаты собирают и обрабатывают активированным углем для удаления неорганических солей. После упаривання элюатов после обработки угля получают 60 г светлокоричневого норощка. Его снова хроматографируют на Доуекс WX8. Порон.1ок растворяют в 0,1 М растворе фосфатного буфера (рН 2,0) и сорбируют колонкой , заполненной 2 л Доуекс 50 VX8 (100-200 мещ), которая была буферирована фосфатным буфером (рН 2,0). Антибиотики злюируют 0,1 Л фосфатным буфером (рП 4,3). Активные элюаты обрабатывают углем для удаления неорганических солей. Получают 35 г светло-желтого порощка. Его очищают хроматографически с помощью сульфоэтилсефадекса , представляющего собой сильно кнслую ионообменную смолу сульфоэтильного типа. Этот порошок помещают в 50 г колонку с сульфоэтилсефедексом (SE-С-25), заранее иромытую буфериым 0,01 Л фосфатным буфером (рН 2,0). Антнбиотики элюируют последовательно, повыщая концентрацию буфера до 0,1 М. Таким образом получают 18 г очищенного белого порощка нолиоксинового комплекса. Разделяют нолиоксины J, К и L следуюнаим образом..... Полученный полисксиновый комплекс растворяют в воде, растБОрпропускают через колонку , заполненную 500 л Амберлита JR- 4В--С1 (-100-200 мещ.).