[1]Предметом изобретения являются пептиды, в которых аргиниловые остатки АКТГ-активных пептидов с 18-24 остатками аминокислот замещены лизиновыми остатками.
[2]К указанным АКТГ-активным пептидам относятся такие, в которых отдельные аминокислоты природного гормона заменены другими аминокислотами. Так, первая аминокислота, серии, может быть заменена глицином, либо вторая аминокислота, тирозин, - фенилаланином, либо четвертая аминокислота, метионин, - норвалином, лейцином или α-аминомасляной кислотой, либо пятая аминокислота, глутаминовая кислота, заменена глутамином. К этим пептидам относятся также пептиды, в которых отсутствует первая аминокислота - серин.
[3]Пептиды, в которых оба аргиниловых остатка в положениях 17 и 18 заменены на лизиновые остатки, также обладают высоким адренокортикотропным действием, и в то же время отличаются от пептидов Арг17, Арг18 тем, что их легче синтезировать, выход их выше. Особенно следует отметить тетраикосапептид L - серил - L - тирозил - L - серил - L - метионил - L - глутамил - L - гистидил - L - фенилаланил - L - аргинил - L - триптофил - глицил - L - лизил - L - пролил L - валил - глицил - L - лизил - L - лизил - L - лизил - L - лизил - L - пролил - L - валил - L - лизил - L - валил - L - тирозил - L - пролин, а также соответствующее соединение, в котором вместо глутамилового остатка содержится остаток глутамина, соли этих соединений с кислотами, производные и комплексы этих тетраикосапептидов. Здесь и далее все аминокислоты L-ряда.
[4]Новые соединения обладают высокой адренокортикотропной и липолитической активностью, они применяются в медицине и ветеринарии, например, вместо природных гормонов.
[5]Новые пептиды получают известными методами синтеза пептидов с большой длиной цепи последовательным наращиванием пептидной цепи или связыванием небольших пептидных звеньев между собой. Особенно нужно отметить так называемый синтез на твердом носителе.
[6]В качестве способа конденсации пептидов можно использовать, например, карбодиимидный или азидный, способ активированного эфира или ангидридный. Так, можно одну молекулу аминокислоты или пептида в форме эфира связать с другой молекулой аминокислоты или пептида, содержащей защищенную аминогруппу, в присутствии конденсирующего средства, например карбодиимида или галогенфосфита. Эфир аминокислоты или пептида со свободной аминогруппой можно также связать с аминокислотой или пептидом с активированной карбоксильной группой и защищенной аминогруппой, для чего можно использовать галогенангидрид, азид, ангидрид, имидазолид, изоксазолид, или же с активированным эфиром, например с цианметиловым, карбоксиметилтиоловым или нитрофениловым, и, наоборот, аминокислоту или пептид со свободной карбоксильной группой и защищенной аминогруппой можно ввести в реакцию с аминокислотой или пептидом с активированной аминогруппой и защищенной карбоксильной, например с фосфитамидом.
[7]Свободные функциональные группы, не участвующие в реакции, можно защитить, особенно остатками, легко отщепляющимися под действием гидролиза или в результате восстановления. Карбоксильная группа лучше всего защищается этерификацией, например, метанолом, трет-бутанолом, бензиловым или n-нитробензиловым спиртом, или амидированием. Аминогруппы можно, например, защитить тозильной, тритильной, формильной, трифторацетильной, о-нитрофенилсульфенильной, фталильной или карбобензоксильной группами или же окрашенными защитными группами, например n-фенилазобензилоксикарбонильной или n-(n-примметоксифенилазо)-бензилокси-карбонильной, в особенности трет-бутилокси-карбонильным остатком. Для защиты аминогруппы в гуанидинной группировке аргинина подходит нитрогруппа; эта аминогруппа аргинина не обязательно должна быть защищена при реакции. Иминогруппа гистидина может быть защищена бензильным или третильным остатком. Превращение какой-либо защищенной аминогруппы или иминогруппы в свободную группу и превращение функционально измененной карбоксильной группы в свободную карбоксильную группу в процессе работы может быть осуществлено известными методами обработки при помощи гидролизующих веществ или восстановителей.
[8]Тетраикосапептид можно получить из декапептида формулы L - серил - L - тирозил - L -серил - L - метионил - L - глутамил - (или L - глутаминил) - L -гистидил - L - фенил-аланил - L - аргинил - L - триптофил-глицин, в котором α-аминогруппа серила, а возможно и γ-карбоксильная группа глутамила защищены. Этот декапептид вводят в реакцию с тетрадекапептидом формулы L - лизил - L -пролил - L - валил-глицил - L - лизил - L - лизил - L - лизил - L - лизил - L - пролил - L - валил - L лизил - L - валил - L - тирозил - L -пролин, в котором аминогруппы в боковых цепях лизиновых остатков защищены. После конденсации обоих пептидов отщепляют защитные группы от полученного тетраикосапептида. Для этой конденсации наиболее подходящий карбодиимидный способ или метод активированных эфиров, в первую очередь с n-нитрофениловым эфиром. При этом не обязательно выделять n-нитрофениловый эфир декапептида. Можно на ступени конденсации получить этот эфир из декапептида со свободной карбоксильной группой, n-нитрофенола и дициклогексилкарбодиимида. Декапептид, таким образом, представляет собой пептид со свободной карбоксильной группой или с n-нитрофенилэфирной группой с защищенной α-аминогруппой. В качестве защитных групп для α-аминогруппы серина и для аминогрупп в боковых цепях лизиновых остатков рекомендуется преимущественно трет-бутилоксикарбонильная группа; для γ-карбоксильной группы глутаминовой кислоты и концевой карбоксильной группы пролина - трет-бутиловый эфир. Все эти защитные группы можно одновременно отщепить методом кислотного гидролиза, например, трифторунсусной кислотой.
[9]Вместо трет-бутилового эфира пролина можно в указанном процессе использовать пролинамид. В этом случае образуется тетраикосапептидамид. Если вместо трет-бутилового эфира пролина использовать другой низший алкиловый или бензиловый эфир, можно получить соответствующий тетраикосапептид в виде низшего алкилового или бензилового эфира. Метиловый эфир может быть превращен известным способом в гидразид (действием гидразидгидрата).
[10]Тетраикосапептидгидразид можно получить, например, конденсацией указанного декапептида (в котором α-аминогруппа серина защищена трет-бутилоксикарбонильной группой, и, возможно, γ-карбоксильная группа глутаминовой кислоты защищена трет-бутиловым остатком), с n-фенилазобензиловым эфиром указанного тетрадекапептида, в котором аминогруппы боковых цепей лизиновых остатков защищены фталильными остатками. После конденсации аминозащитные группы и группу трет-бутилового эфира отщепляют кислотой, например трифторуксусной, и переводят n-фенилазобензиловый эфир тетраикосапептида в его гидразид действием гидразинмоноацетата.
[11]Тетраикосапептид можно также получать из тетрапептида L-серил-L-тирозил-L-серил-L-метионина, в котором α-аминогруппа защищена (например, трет-бутилоксикарбонильной группой), и эйкосапептида L-глутамил (или глутаминил) L - гистидил - L - фенилаланил - L - аргинил - L - триптофил-глицил - L - лизил - L - пролил - L - валил-глицил - L - лизил - L - лизил - L - лизил - L - лизил - L - пролил - L - валил - L - лизил - L - валил - L - тирозил - L - пролина, в котором аминогруппы боковых цепей лизиновых остатков защищены, например, трет-бутилоксикарбонильной группой, и возможно защищена этерификацией, например, трет-бутиловым эфиром, γ-карбоксильная группа глутаминовой кислоты. Конденсация тетрапептида и эйкосапептида лучше всего проводить по азидному методу.
[12]Предлагаемые пептиды могут найти применение в качестве фармацевтических препаратов, в которых они находятся в смеси с основой из фармацевтического, органического или неорганического носителя, что делает возможным использование этой смеси в качестве перорального или парентерального средства.
[13]Системы тонкослойной хроматографии в примере обозначены следующим образом:
[14]Система 43А: трет-амиловый спирт - изопропиловый спирт - вода (100:40:10).
[15]Система 45: вторичный бутиловый спирт- 3%-ный водный аммиак (100:44).
[16]Система 100: этилацетат - пиридин - ледяная уксусная кислота - вода (62:21:6:11).
[17]Система 101: н-бутиловый спирт-пиридин - ледяная уксусная кислота - вода (30:20:6:24).
[18]В примере использованы следующие сокращения: БОК - трет-бутилоксикарбонил-, ТБО - трет-бутиловый эфир, кбз - карбобензокси.
[19]Пример. а) Получение кбз-лиз(БОК)-лиз(БОК)-гидразида.
[20]10 г кбз-лиз (БОК)-лиз (БОК) ОСН3, синтезированного из кбз-лиз(БОК)-ОН + Н-лиз (БОК)ОСН3, с применением дициклогексил-карбодиимида, растворяют в 160 мл метанола и добавляют 7,8 мл гидразингидрата. Прозрачный раствор оставляют на 24 час при 25°С и затем упаривают до трети исходного объема. Далее добавляют 200 мл воды, в результате чего выпадает маслянистый осадок, который при охлаждении и растирании упрочняется и может быть измельчен. Осадок отделяют на нутч-фильтре, промывают водой и сушат. Продукт очищают однократной перекристаллизацией из смеси метанол - ледяная уксусная кислота - петролейный эфир, т. пл. 118-119,5°С. При тонкослойном хроматографировании на силикагеле получают следующие значения Rf: для системы 43А 0,40, для системы хлороформ - метанол (9:1) 0,75.
[21]б) Получение кбз-лиз (БОК) -лиз (БОК) -пролина.
[22]1,87 г кбз-лиз (БОК)-лиз (БОК)-гидразида растворяют в 15 мл свежеперегнанного диметилформамида и охлаждают до 25°С, после чего медленно по каплям приливают 2,07 мл 4,35 н. соляной кислоты и затем 0,66 мл 5 н. раствора азотистокислого натрия. Смесь перемешивают 10 мин при -10°С и затем добавляют к ней раствор 692 мг пролина в 4,2 мл водного диметилформамида (1:2). Под конец реакции приливают по каплям при -10°С 1,82 мл триэтиламина, после чего реакционный раствор оставляют на ночь при температуре 0°С, а затем еще на 2 час при комнатной температуре. Упариванием в высоком вакууме объем раствора снижают примерно до 4 мл и к клейкому остатку приливают 25 мл воды, охлаждают до 0°С и растирают. Продукт промывают на нутч-фильтре небольшим количеством воды и сушат в высоком вакууме при 40°С.
[23]Для очистки некристаллизующегося сырого продукта его подвергают дифференциальному растворению по Крегу в системе растворителей метанол - буфер - хлороформ - четыреххлористый углерод в соотношении 35:13:15:15 (буфер состоит из 28,5 мл ледяной уксусной кислоты и 19,25 г уксуснокислого аммония и 960 мл воды) на 220 ступенях. Разделение по Крегу производят при объеме фаз по 10 мл. Продукт выделяют на ступенях 49-73 (µмакс 61; K 0,39) выпариванием раствора досуха и отделением уксуснокислого аммония возгонкой. Получают хроматографически чистый, трипептид, но аморфный (т. пл. ~70-80°С). При тонкослойной хроматографии на силикагеле получают следующие значения Rf: для системы хлороформ - метанол (9:1) 0,19, для системы 43А 0,29, для системы 45-0,52.
[24]в) Получение кбз-лиз (БОК) -лиз (БОК) -провал-лиз (БОК) -вал-тир-про-ТБО.
[25]2,4 г кбз-лиз (БОК)-лиз (БОК)-пролина и 3,12 г Н-вал-лиз (БОК)-вал-тир-про-ТБО растворяют в 30 мл абсолютного хлороформа. При 0°С добавляют 0,845 г дициклогексилкарбодиимида, перемешивают 1 час при этой температуре и оставляют на 30 час при 25°С. Выделяющуюся кристаллическую дициклогексилмочевину отфильтровывают, промывают этилацетатом, приливают к фильтрату еще 150 мл этилацетата и органическую фазу экстрагируют при 0°С трижды (по 30 мл) 3%-ным раствором винной кислоты для отделения избыточного пентапептида, после чего промывают несколько раз водой до нейтральной реакции и выпаривают досуха.
[26]Для отделения липофильных загрязнений остаток растворяют в 10 мл метанола и 20 мл этилацетата и октапептид высаживают 120 мл петролейного эфира в виде мажущейся массы, которую сушат в вакууме при 40°С. Полученный сырой продукт (3,1 г) для окончательной очистки подвергают распределению по Крегу в системе метанол - буфер - хлороформ -четыреххлористый углерод в соотношении 30:10:3:30 (состав буфера такой же, как в п. б) на 225 ступенях при объеме фаз по 10 мл. Хроматографически однородный октапептид получают выпариванием досуха содержимого ступеней №65-96 (µмакс 78, К 0,53) и отделением при помощи возгонки уксуснокислого аммония в высоком вакууме. Продукт представляет собой белый аморфный порошок с т. пл. 130-140°С. Значения Rf, полученные при тонкослойной хроматографии на силикагеле, следующие: для системы 43А 0,74, для системы хлороформ - метанол (9:1) 0,54, для системы бензол - ацетон (1:1) 0,33.
[27]г) Получение Н-лиз (БОК) -лиз (БОК) -провал-лиз (БОК) -вал-тир-про-ТБО.
[28]1,46 г кбз-лиз (БОК) -про-вал-лиз- (БОК) -вал-тир-про-ТБО гидрируют в 40 мл метанола после добавки 300 мг 10%-ного палладированного угля при перемешивании с поглощением H2. Присоединение водорода заканчивается за 20 мин. По истечении 1 час катализатор отфильтровывают, промывают метанолом и фильтрат выпаривают досуха. Получают с количественным выходом хроматографически однородный декарбобензоксилированный октапептид в виде белого аморфного порошка с т. пл. 110-120°С. При тонкослойной хроматограмме на силикагеле получают следующие значения Rf: для системы 43А 0,53, для системы хлороформ - метанол (9:1) 0,34.
[29]д) Получение кбз-лиз (БОК) -про-вал-гли-лиз (БОК)-лиз (БОК)-лиз (БОК)-лиз (БОК)-про-вал-лиз (БОК)-вал-тир-про-ТБО.
[30]1,98 г кбз-лиз (БОК)-про-вал-гли-лиз (БОК)-лиз(БОК)-гидразида растворяют в 22 мл абсолютного диметилформамида и после охлаждения до 25°С приливают по каплям при перемешивании сначала 3,4 мл 2,115 н. соляной кислоты, а затем 0,378 мл 5 н. раствора азотистокислого натрия. Прозрачный раствор перемешивают еще 15 мин при -10°С, после чего добавляют охлажденный до -5°С раствор 1,313 г производного октапептида в 4 мл диметилформамида, полученного на стадии г, промывают 1 мл диметилформамида, затем медленно приливают при -5°С 1,05 мл триэтиламина. Реакционную смесь перемешивают еще 30 мин и оставляют на 15 час при 0°С.
[31]Далее раствор концентрируют до образования вязкого масла и, приливая, 20 мл воды выделяют мажущуюся массу, которую растворяют при нагревании в 20 мл метанола и вновь высаживают пептид 30 мл воды, затем охлаждают до 0°С и растиранием получают порошкообразную суспензию, которую фильтруют, промывают водой и сушат. Сырой продукт очищают путем распределения по Крегу в системе метанол - буфер - хлороформ - четыреххлористый углерод в соотношении 60:20:3:60 при объеме фаз по 20 мл на 218 ступенях. Продукт выделяют на ступенях 105-134 (µмакс 121, К 1,25) выпариванием раствора досуха и отделением уксуснокислого аммония в высоком вакууме возгонкой. Хроматографически получают однородный продукт - защищенный тетрадекапептид в виде белого аморфного порошка, который плавится примерно при температуре 180-190°С. Получают следующие значения Rf: для системы 43А 0,80, для системы хлороформ - метанол (9:1) 0,49.
[32]е) Получение Н-лиз (БОК)-про-вал-гли-лиз(БОК)-лиз (БОК)-лиз (БОК)-лиз (БОК) -про-вал-лиз (БОК) -вал-тир-про-ТБО.
[33]1,76 г кбз-лиз (БОК) -про-вал-гли-лиз (БОК) -лиз (БОК) -лиз (БОК) -лиз (БОК) -про-вал-лиз (БОК) -вал-тир-про-ТБО гидрируют обычным путем в 40 мл метанола с применением 300 мг палладированного угля с 10% палладием. При нагревании досуха из фильтрата гидрированного раствора хроматографически получают 1,49 г однородного продукта в виде аморфного порошка. Т. пл. полученного соединения около 175-190°С. Rf (на силикагеле): для системы 43А 0,41, для системы хлороформ-метанол (9:1) 0,24.
[34]ж) Получение БОК-сер-тир-сер-мет-глу (ТБО) - гис-фен-арг-три - гли - лиз (БОК) - про-вал-гли-лиз (БОК) -лиз (БОК) -лиз (БОК) -лиз (БОК) -про-вал-лиз (БОК) -вал-тир-про-ТБО.
[35]252 мг БОК-сер-тир-сер-мет-глу (ТБО) -гис-фен-арг-три-глу-ОН и 300 мг тетрадекапептид-диэфира, полученного на стадии е, смешивают с 2,7 мл абсолютного пиридина. К смеси приливают 0,1 мл воды и 0,213 мл 1 н. соляной кислоты при перемешивании при 50°С в течение 30 мин. При этом пептид переходит в раствор. В раствор вводят 96 мл дициклогексилкарбодиимида и через 2 час еще такую же порцию. Реакционную массу перемешивают 3 час при 50°С, после чего охлаждают до 0°С, фильтруют выделившуюся кристаллическую дициклогексилмочевину и промывают ее четырьмя порциями 95%-ного пиридина по 0,5 мл. Из фильтрата после добавления 30 мл бензола выделяют сырой продукт в виде хлопьевидного осадка. Осадок отфильтровывают при 0°С, промывают бензолом и петролейным эфиром и высушивают.
[36]Полученный продукт (550 мг) очищают однократным высаживанием из смеси метанол - бензол - петролейный эфир и из смеси метанол - вода. Окончательный продукт очищают перераспределением по Крегу в системе метанол - буфер - хлороформ - четыреххлористый углерод в соотношении 10:3:5:4, причем в качестве буфера используют 28,5 мл ледяной уксусной кислоты и 19,25 г уксуснокислого аммония в 960 мл воды. Общее число ступеней 240, объем фаз по 10 мл. Продукт выделяют на ступенях №61-90 (µмакс 76, K 0,46) выпариванием раствора досуха и отделением уксуснокислого аммония путем возгонки в высоком вакууме. Получают 256 мг чистого тетраикосапептидацетата в виде аморфного порошка, который плавится при 195-205°С с разложением. Очистка на силикагеле методом тонкослойной хроматографии дает продукт с Rf = 0,61 для системы 43А; 0,59 для системы 100 и 0,39 для системы из 75 ч. хлороформа и 25 ч. метанола.
[37]з) Получение Н-сер-тир-сер-мет-глу-гис-фен-арг-три-гли-лиз-про-вал-гли-лиз-лиз-лиз - лиз -про-вал-лиз-вал-тир-про-ОН (лиз17,18-β1-24-кортикотропина).
[38]200 мг производного тетраикосапептида, полученного на стадии ж с защитными группами растворяют в 4 мл 90%-ной трифторуксусной кислоты и оставляют на 1 час при 22°С. Затем упаривают до 1 мл, приливают 10 мл воды, вновь упаривают до 2 мл и лиофилизируют. Лиофилизат, представляющий собой трифторацетат, переводят в ацетат на колонке длиной 18 см и диаметром 7,5 мм со слабоосновным ионообменником, например фирмы «Мерк №11». Элюат упаривают до 2 мл, лиофилизируют и окончательно высушивают в вакууме при 40°С. Получают 173 мг хроматографически и электрофоретически однородного ацетата лиз17,18-β1-24-кортикотропина в виде белого аморфного порошка.
[39]При тонкослойном хроматографировании на окиси алюминия это соединение имеет Rf для системы 101 0,41 (Rf для β1-24-кортикотропина в тех же условиях 0,51). При электрофорезе (16 в/см) при рН 6,1 (в пиридинацетатном буфере) этот кортикотропин перемещается к катоду со скоростью 8,4 см/2 час.
