СО
til ел
9)
сл Изобретение относится к биотехнологии
и может быть использовано при получении глюкозы из целлюлозы, такзке для получения целлюлозы, исЪользуемой
в качестве сорбента или носителя для иммобилизации разных веществ.
Известен способ гидролиза целлюлозы смешиванием ее с одной из концентрированных кислот, например соляиой
, серной или фтористоводородной вьц ерживаиием смеси в определенных условиях с последующей нейтрализацие
кислоты и очисткой образовавшейся глюкозы от солей 3. Основным недостатком этого способа
, препятствующим использованию его в промышленности, является загрязнение продуктов гидролиза целлюлозы
солями, для очистки крторых необхоДИМЫ специальные очистные соорз ения Наиболее близким к предлагаемому
по технической сущности и достигаемому результату является способ декристаллизации целлюлозы. По этому
способу целлюлозу размалывают до частиц размером 1 мм и менее, размол смешивают с 80-85%-ным раствором
фосфорной кислоты в соотношении 1 вес,ч. целлюлозы на 3-10 об.ч. фосфорной кислоты, в которой содержится
псзерхностно-активное вещество в количестве от 0,01 до 0,5 ч. на 100 ч. кислоты, после реакции к
смеси добавляют тетрагидрофуран, см шанный с водой в соотношении 30-100
на 1 ч. воды, в количестве 10-50 ч. растворителя на 1 ч, кислоты, осадо
углевода отделяют, а раствор, содер жащий смесь фосфорной кислоты, тетр
гидрофурана и воды, подвергают рект фикации для повторного использования 23.
Недостатками известного способа являются необходимость работы с бол
шим объемом органического растворителя и создания технологии регенера ции реактивов во взрыяобезопасном
исполнении, потери органического растворителя, достигающие 5-15 объе мов на 1 вес. ч. целлюлозы, а также
необходимость использования фторугл родного поверхностно-активного вещества для снижения расхода кислоты
за счет смачивания, что загрязняет продукт токсичными фтористыми соеди
нениями, и необходимость размола це люлозного сырья. Целью изобретения является упрощение процесса гидролиза целлюлозы. Поставленная цель достигается
тем, что согласно способу гидролиза целлюлозы, включающему кислотную обработку целлюлозы, вьщерживание
смеси и отделение нерастворившейся целлюлозы с последующим ферментативным
гидролизом, обработку целлюлозы проводят смесью концентрированных
фосфорной и серной кислот при их соотношении (3,5-50):1, смесь вьщерживают
1,5-4,5 ч при 30-50С и дополнительно обрабатывают водой при 2-lO°C.
Способ осуществляют следующим образом . 1 вес.ч. (в граммах) целлюлозы
смешивают с 5-9 объемами, преимущественно 5 (в миллилитрах), смеси концентрированной
фосфорной кислоты (ГОСТ 6552-80/7168-80, массовая доля кислоты не менее 85%) и концентрированно
серной кислоты (ГОСТ 420Д-77, массовая доля кИслоты лежит в пределах
93,6-95,6%), взятой в соотношении (3,5-50):1, преимущественно (10-50):. Перемешивание проводят
при 30-50°С в течение 1,5-4,5 ч. Доба:вка серной кислоты к фосфорной вызьшает
умеренную и контролируемую деполимеризацию целлюлозы и образование в качестве промежуточного продукта
водонерастворимого углевода, который после обработки водой на холоду становится сильно набухаемым и
хорошо фильтруемым. Благодаря добавлению серной кислоты к фосфорной повьштается
смачиваемость целлюлозы кислотой, благодаря чему достаточно брать кислоты не более 10 объемов
на 1 вес.ч. целлюлозы. После перемешивания к реакционной смбси добавляют
холодную воду, предпочтительно со льдом (температура 2-10°С), тщательно
размешивают, фильтруют, для промывки повторно добавляют воду с последующим
фильтрованием. Полученный нерастворимый продукт после промежуточной
стадии высушивания или без нее подвергают ферментативному гидролизу.
Возможность применения предлагаемого способа основана на том, что,
как обнаружилось в ходе исследований действия кислот на целлюлозу, при
определенных условиях на промежуточной стадии кислотной обработки получается
продукт, способный давать зернистую, легко фильтруемзпо массу. 3 состоящую из частично деподимеризованной целлюлозы. Эта масса состоит
из набухшего в воде полисахарида, в котором отношение воды к углеводу близко к величине 10:1, в котором
растворенные в воде вещества (кислота ) быстро смешиваются с добавлен ной водой. Этот набухший материал;.
образуется уже при добавлении 1 объ ма воды (со льдом) к 1 объему реакционной смеси и путем фильтрования
можно отделять кислоту, концентраци которой достигает 30%. Образование такой частично деполимеризованной
целлюлозы возможно только в присутствии добавок другой кислоты, например серной. Благодаря
этой добавке смешивание целлюлозы с кислотой улучшается, после выдерживания первоначально твердой смеси
при ЗО-ЗО С она разжижается, что об легчает ее перемешивание и создает
более полный контакт кислоты с целл лозой. Без добавки серной кислоты целлюлоза постепенно набухает в
10 объемах концентрированной фосфор ной кислоты, при этом образуется
резиноподобная масса, которая практически не смешивается с водой и, следовательно, отделение углевода
от кислоты становится невозможным. Отделить углевод от кислоты из ее смеси с концентрированной фосфорной
кислотой добавлением воды можно толь ко в тех случаях, когда смесь этой
кислоты с целлюлозой готовят при избытке кислоты, в 4-10 раз превьш1ающем используемые в данном способе.
Частично деполимеризованная целлюлоза , полученная предлагаемым способом , не подвергается обратному
процессу рекристаллизации, так как она становится легко гидролизуемой
под действием ферментов. Даже после вьюушивания, когда ее набухаемость в воде снижается, она сохраняет
способность гидролизоваться фермента ми. Пример 1 (контрольньй)|. 10 г
хлопкового линта смешивают со 100 мл концентрированной фосфорной кислоты
(отношение целлюлозы к кислоте 1:10) через 3 ч смесь превращается в упругую
резиноподобную массу, которая после смешивания с 1 л воды сохраняет форму плотных, трудно растираемых
комков резиноподобной массы.Материал не пригоден для дальнейшей обработки. 654 П р и м е р 2 (котрольный). 5 г хлопкового линта смешивают с 35 мл
концентрированной фосфорной кислоты и 15 мл 70%-ной серной кислоты (отношение целлюлозы к смеси кислот
1:10), оставляют на 4 ч 20 мин. После этого добавляют 20 мл холодной воды и перемешивают. До конца все
размешать нельзя, осадок имеет форму нефильтруемых хлопьев. После нескольких
промывок водой с декантированием остаток кислоты нейтрализуют аммиаком. Из-за медленной диффузии
кислоты из частиц осадка полной ее нейтрализации добиться не удалось.
Материал не пригоден для дальнейшей обработки. Пример 3. 50 г хлопкового
линта смешивают при 30С с 250 мл концентрированной фосфорной кислоты и 10 мл концентрированной серной
кислоты (соотношение целлюлозы и кислоты 1:5), перемешивают 1 ч при 40С
и 2 ч при 50°С. Добавляют 50 г льда и 250 мл воды (), фильтруют, обрабатывают
повторно водой и фильтруют, промывку повторяют еще 3 раза. Остаток (вес геля 430 г) обрабатывают
при и рН 5,0 50 г целловириди- . на ГЗх (соотношение субстрата и фермента
около 1:1). Через сутки вся масса становится жидкой, но трудно отделяемой от нерастворившейся части
. Измерение восстанавливающих сахаров после трех суток инкубирования
в супернатанте показало концентрацию Сахаров 7,5% (в глюкозных эквивалентах ), степень конверсии 70%.
Пример 4. 5 г хлопкового линта смешивают при с 35 мл концентрированной фосфорной кислоты и 10 мл
концентрированной серной кислоты (соотношение целлюлозы и кислоты
1:10), перемешивают, вьщерживают 2 ч 40 минут при 50°С, обрабатывают 50 мл
холодной воды (10°С), фильтруют, промывку водой повторяют еще 3 раза
получают 50 г набухшей в воде, целлюлозы в виде рассьтчатой темно-серой
массы. К ней добавляют раствор 1 г целловиридина ГЗх (соотношение фермента
и субстрата около 1:5) в 4,5 мл воды и инкубируют при рН 4,5 в течение двух при 40°С. Получают
сироп с концентрацией 4,1%, степень конверсии 46%. Дополнительное вьщерживание
осадка при 40°С в течение 6 дней дало сироп с концентрацией восстанавливающих Сахаров 8,2%.
Пример 5. Юг линта смешивают с 50 мл концентрированной фосфорной
кислоты и 5 мл концентрированной серной кислоты (соотношение целлюлозы и кислоты около 1:5) ппи
15-17С. Перемешивают 1,5чпри40°С, добавляют 50 г льда и столько же воды (), тщательно перемешивают,
фильтруют на воронке Бюхнера с бумаж ным фильтром, промывку водой повторяют , после нейтрализации набухшую
целлюлозу высушивают на воздухе, по лучают 9,3 г препарата. 2 г этого препарата и 1 г целловиридина ГЗх
(соотношение фермента и субстрата 1:2) смешивают с 5 мл 0,1 М ацетатного буфера рН 5,Оуинкубируют при
ЗОС в течение 2 сут, в супернатанте .получают концентрацию восстанавливаю щих Сахаров 8%.
В примерах 3-5 полностью исключены предварительное размельчение целлюлозы
, добавки поверхностно-активных веществ, а также использование органического растворителя.
Примерб. 50г линта смешивают при 25-30с с 250 мл концентрированной фосфорной кислоты и 5 мл
концентрированной серной кислоты (со отношение целлюлозы и кислоты около
1:5), перемешивают 1,5 ч при 30°С и еще 3 ч при , после чего смешивают с 10 л воды, супернатант (око
ло 9 л) декантируют, а остаток фильт руют, нейтрализуют, до рН 5-6, высушивают
на воздухе при 60-80°С, получают 46 г темного порошка. Пример ы 6а, 6б, 6в. 2 г пр
парата, полученного в примере 6, и целловиридин ГЗх (см.таблицу) смеши
вают с 8 мл О,1 М ацетатного буфера рН 5,0, инкубируют при 50°С в течение
2 сут., измеряют концентрацию восстанавливающих Сахаров в суперна танте. Пример 6г. 2г препарата, . полученного в примере 6, смешивают с 8 мл раствора 0,1 г целловиридина
ГЗх (активность 77 ед/г по бумаге) И 0,01 г пектофоетидина П10х (активHoCTb
ПГА/В 28 ед/г, целлобиазная 143 ме/г), в О,1 М ацетатном буфере рН 5,0. Набухший объем превьш1ает
6 мл. Смесь инкубируют без перемешивания 1,2 и 5 сут при 50°С. Получают
сиропы с концентрацией 2,2; 3 и 5,3%. В последнем случае измеряют
также концентрацию гёксоз антроновым методом в супернатанте, она равна
5,3%. Следовательно, все гексозы в последнем случае являются глюкозой.
Таким образом, предлагаемый способ получения продуктов гидролиза
целлюлозы позволяет упростить технологию процесса, получать глюкозные
сиропы и целлюлозу в виде хорошо фильтруемого и набухаемого материала
, пригодного для использования в качестве сорбентов и носителей иммобилизованных веществ, а также
исключить стадию размола целлюлозы, применение поверхностно-активных
веществ и полностью исключить стадии обработки органическим растворителем и регенерации растворителя.
