Способ определения сульфатированных гликозаминогликанов в биологических жидкостях

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ГЛИКОЗАМИНОГЛИКАНОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ путем ферментативного протеолиза протеогликанов, депрстеинизации биологической жидкости, обработки этанолом и осадителем, о тличающийся тем, что, с целью его ускорения, в качестве осадителя добавляют резохин конечной концентрацией 0,81-0,85% и определяют сульфатированные гликозаминогликаны в осадке. i (/) с

Nd 4

00 11 Изобретение относится к иедиции э к клинической биохимии, и может быть нспользовано для определения степени активности и стадии патологического процесса при системных поражениях соединительной ткани, в частности при ревматоидном артрите Известен способ определь.ния гликозаминогликанов (ГАГ) в Оиологических жидкостях путем фгрментати.т:5;ого протеолиэа протеогликанов, депротеи нияации, обработки этанолом и осадитeJIe i П , Хотя разделение на фракции очищенных осадков ГАГ, полученных согла но этому способу, путем их электрофореза на бумаге, ацетате цеп:;;олозь и т.д. позволяет получить отдельные фракции ГАГ, в том числе и сульфатированные , но процесс длителен,, сопрово:«;дается появлением недостатков, присущих всем способам электрофоретического разделения ГАГ. Цель изобретения ускорение способа . Поставленная цель достигается тем что согласно способу определения сульфатированньЕч ГАГ в биологи шския жидкостях путем ферментативного протеолиза протеоглкканов, депротеинизап и биологической жидкости, обработки зтaнoлo з и осадителем в качестве осадителя добавляют резохин конечной концентрацней 0.81-0,85% и опреде ляют сульфатированные ГАГ в осадке. П р и м е р. Берут 0,25 мп. синовиальной жт-щкости5 дредварителько освобох.цекной от клеточных элементов Синовиальную жидкость разводят физкологяческим раствором Б отношении 1:4, доводя объем пробы до 1 мл. Разведение сииовиальиой жидкости подобра но таким образом, чтобы все 1 :о: ичест во содержащихся в ней ГАГ могло быть полностью определимо в ходе 1юследуго щих реакций. К пробе прибавляют 0,2 мл раствора прпназы, содержащего 15 NUT проназь Е в 1 мл 0,05 М трисацетатного буфера рН 8,0, инкубируют смесь 4 ч при 45 С. Депротеинизацию полученного гидро проводят путем кипячения пробы на водяной бане в течение 5 мик, предузарительно прибавив 2,4 мл 17%-ного хлористого натрия и 0,06 мл 3 Н уксусной кислоты. Охлаждают на -ИьдУ; фильтруют через мелкопористый ( ) . 48 Для выделения этанолового осадка ГАГ к одному объему прозрачного фильтрата добавляют три объема 96%-ного этанола, содержащего уксуснокислый натрий из расчета 0,8 г на 1 л. Пробу хорошо смешивают и оставляют при А С на один час 5 затем этаноловый осадок ГАГ отделяют центрифугированием . Для оса ;дения сульфатированных ГАГ к этаколовому осадку прибавляют мл 5%-ного раствора резохина и доводят объем пробы до 3 литров с помощью бидистиллята (конечная концентра1щя резохина в пробе составляет Оз83%), Пробу выдерживают при 20 С в течение одного часа. Для получения очищенньпс ГАГ пробы центрифугируют при 3000 об./гл{и- в течение 30 мин, Надосадочную жидкость осторожно удаляют, а в осадке опреде-гтяют уроновы ,е кислоты карбазоЛовьпч методом, для чего к осадку прибавляют 0,1 мл 0,5 М борной кислоты; 0,2 мл 1 М сульфоминовой кислоты и 2,5 мл концентрированной серной кислоты. Пробу таг5.т .;льнэ смешивакуг. нагревают на кипящей водяной баке 6,5 мян, охлаждают на льду и добавляют Oj1 мл 0;,2%-ного раствора карбазола в 96%-ном этанолеJ вновь энергично смешивают гфобу и нагревают 10 кии на кипящей водяной бане Полученную ок ppsCKy измеряют на спектрофотометре при длине волны 525 нм против контроля на реактивы. В качестве стандарта используют) --глюкуроновую кислоту. Параллельное испол1:,зование предлагаемого способа и известного способа количественного оп-ределекия ГАГ поззоляет получить сведения о суммарном содержании ГАГ в пробе, содержании сульфатированных. ГАГ, количество несульфатированных ГАГ легко рассчитывается по разности этих величин. Для получения сопоставимых результатов содержания суммарного количества ГАГ и количества сульфатированных ГАГ в исследуемом образце в опыт необходимо брать удвоенное количество биологичес/сой жидкости; После депротеинизации надосадочную жидкость, содержащую ГЛГ, делят на две равные пробь.; в одной из которых проводят определение сульватированных ГАГ, а в другой - определе}гие суммарно1о содержания ГАГ, используя в качестве 3 осадителя цетилпиридиний хлорид, как при известном способе. Таким образом, в отличие от известных способов, предлагаемый способ , позволяя провести выделение и химическую очистку сульфатированных ГАГ, не требует для своего осуществления специальной аппаратуры, доро1255484 гостоящих импортных реактивов, исч зает необходимость в проведении электрофореза для выделения сульфатированных ГАГ, что упрощает и уско5 ряет способ. Одновременное определение суммарного содержания ГАГ в пробе позволяет вьщелить и фракции ГАГ: сульфатированные и несульфатированные .