[1]Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 из штамма «SAT-2/North Africa/2012» культуральной инактивированной эмульсионной.
[2]Ящур - сверхзаразное заболевание парнокопытных животных, включая крупный рогатый скот, овец, коз, свиней, всех диких жвачных [1].
[3]Выделяют семь следующих серотипов вируса ящура: O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и Азия-1, при этом представители серотипа SAT-2 является актуальными в настоящее время и очень распространенными, особенно в странах Африки, что определяет своевременность изготовления вакцин для защиты от ящура данного серотипа.
[4]Вирус существует не только в виде семи серотипов, но и многочисленных генотипов. В полевых условиях возбудитель ящура продолжает эволюционировать, приводя к появлению новых штаммов, которые вызывают периодические всплески числа случаев и увеличивают риск распространения в новые районы [2].
[5]С точки зрения, молекулярно-биологического анализа различия между генотипами определяют при анализе нуклеотидной последовательности высоковариабельного гена 1D, который кодирует аминокислотную последовательность поверхностного белка VP1 [3].
[6]Учитывая, что возбудитель ящура является РНК-содержащим вирусом, для него характерно образование большого количества мутаций во время репликации вирусного генома (преимущество в 5'-участке) и явление рекомбинации (преимущественно в 3'-участке). Именно по этой причине в пределах серотипов выделяют более 60 генетических линий и сублиний [2]. Восстановление после переболевания животным каким-либо одним серотипом не обеспечивает иммунную защиту против другого серотипа и даже некоторых других генетических линий [3].
[7]Вакцинация используется в качестве основного инструмента контроля ящура в эндемичных районах, анализ каждого регионального пула и генотипов вируса в нем может подобрать наиболее специфичные вакцинные препараты, соответствующих топотипам, присутствующим в этом пуле, вместо того, чтобы продолжать полагаться на более широко доступные в настоящее время генетические вакцины.
[8]По данным WRLFMD в серотип SAT-2 вируса ящура входят 14 охарактеризованных топотипов, которые обозначают римскими цифрами: I-XIV. Подразделения на генетические линии не отмечается, за исключением генотипа VII, в котором выделяют такие значимые и сильно различимые генетические линии, как Ghb-12 и Lib-12 [3, 4, 5].
[9]Высокое генетическое и антигенное разнообразие вируса ящура серотипа SAT-2 приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа SAT-2 и, в частности, генотипа SAT-2/VII/Ghb-12, представители которого распространяются на территории Африканского континента и Ближнего Востока. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 [6, 7].
[10]С целью недопущения возникновения ящура в хозяйствах Российской Федерации применяется комплекс мероприятий по борьбе и профилактике ящура, который направлен на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую вакцинацию животных в буферной зоне, проведение мониторинга иммунного статуса крупного, мелкого рогатого скота и свиней.
[11]Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса, гомологичного полевым изолятам, что подтверждено исследованиями многих ученых [8, 9, 10, 11].
[12]Данная инфекция продолжает оставаться экономически значимой проблемой. Цельновирионные вакцины на сегодняшний день в отношении ящура по-прежнему признаются самыми эффективными, в том числе, по сравнению с генно-модифицированными, что крайне важно для борьбы с самым контагиозным заболеванием в мире [8, 9, 12, 13].
[13]Для проведения эффективной кампании по вакцинации нужно наличие эффективной и безопасной вакцины, содержащей в качестве иммуногенной составляющей антиген вируса, соответствующий эпизоотическому распространяющемуся изоляту определенного генотипа. Создание подобных вакцин по-прежнему является крайне актуальной задачей. Достижение данной цели позволит эффективно применять вакцину в неблагополучных регионах и угрожаемой зоне для формирования иммунитета против конкретного генотипа вируса ящура с целью обеспечения ветеринарного благополучия [14, 15, 16].
[14]На протяжении многих лет периодически фиксировали вспышки ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 в странах Африки, а именно в Республике Руанда в 2004 г., в Судане в 2007 г., в Республике Чад 2006 г., в Уганде в 2020 г. В настоящее время проводятся исследования, по результатам которых выявляют распространение вируса ящура данного генотипа на территорию стран Ближнего Востока. Наличие тесных торговых отношений Российской Федерации с этими государствами является угрожающим фактором в отношении распространения возбудителя ящура на территории нашей страны и требует исследования штаммов данного генотипа для создания средств диагностики и специфической профилактики ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12.
[15]Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа SАT-2, которые применяются или использовались ранее в мире для производства средств специфической профилактики ящура:
[16]- штамм «SAT-2/ZIM/14/2002» (генотип SAT-2/I),
[17]- штамм «SAT-2/ZIM/5/81» (генотип SAT-2/II),
[18]- штамм «SAT-2/BOT/P3/98» (генотип SAT-2/III),
[19]- штамм «SAT-2/ETH/1/90» (генотип SAT-2/IV),
[20]- штамм «SAT-2/GHA/2/90» (генотип SAT-2/V),
[21]- штамм «SAT-2/GAM/8/79» (генотип SAT-2/VI),
[22]- штамм «SAT-2/SAU/6/2000» (генотип SAT-2/VII) (прототип),
[23]- штамм «SAT-2/RWO/1/00» (генотип SAT-2/VIII),
[24]- штамм «SAT-2/KEN/2/84» (генотип SAT-2/IX),
[25]- штамм «SAT-2/UGA/19/98» (генотип SAT-2/X),
[26]- штамм «SAT-2/ANG/4/74» (генотип SAT-2/XI),
[27]- штамм «SAT-2/UGA/51/75» (генотип SAT-2/XII),
[28]- штамм «SAT-2/ETH/2/2007» (генотип SAT-2/XIII),
[29]- штамм «SAT-2/ETH/2/91» (генотип SAT-2/XIV).
[30]Изолят вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории Египта в 2012 г. и поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для проведения научных исследований в 2023 г.
[31]При проведении научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» был охарактеризован и получил название - штамм «SAT-2/North Africa/2012».
[32]По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит к генотипу SAT-2/VII/Ghb-12 вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, в том числе, от штамма «SAT-2/SAU/6/2000» (прототип) (Фиг. 1).
[33]По причине значительного увеличения торгово-экономических взаимоотношений между Россией и странами Африки, в которых стабильно регистрируют вспышки ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12, возникает опасность новых случаев возникновения ящура в Российской Федерации и особое значение приобретает проблема возможной экстренной профилактики данного заболевания для формирования иммунитета у восприимчивых животных. Таким образом, возникла необходимость разработать вакцину против ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 из штамма «SAT-2/North Africa/2012» культуральную инактивированную эмульсионную для обеспечения биологической безопасности и ветеринарного благополучия территории Российской Федерации, сопредельных государств и стран, эндемичных по ящуру, которые будут использовать данный препарат для профилактики заболевания.
[34]Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина против ящура серотипа SAT-2 инактивированная эмульсионная (штамм «SAT-2/SAU/6/2000») [17], содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного возбудителю ящура штамма «SAT-2/SAU/6/2000», полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG («Seppic», Р. Франция): концентрация антигена (инактивированные 146S компоненты вируса ящура) не менее 3,0 мкг/см3, содержание масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG - 50% по массе, добавка в виде поддерживающей среды - до 1,0 см3 (прототип).
[35]В качестве чувствительной биологической системы для репродукции вируса ящура используют перевиваемую клеточную линию почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17, в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла DMEM без внесения сыворотки, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,45-7,65.
[36]Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). При изготовлении эмульсионной вакцины в качестве адъюванта служит масляный адъювант Montanide ISA-206 VG («Seppic», Республика Франция). Очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей осуществляют с применением полигексаметиленгуанидин гидрохлорида (ПГМГ).
[37]Существенный недостаток вакцины-прототипа состоит в его низкой иммуногенной активности относительно появившихся штаммов/изолятов вируса ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12.
[38]Для решения указанной проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка вакцины против ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 из штамма «SAT-2/North Africa/2012» культуральной инактивированной эмульсионной. Данная вакцина предполагает высокое содержание 146S иммуногенного компонента в дозе препарата.
[39]Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала противоящурных инактивированных культуральных эмульсионных вакцин для защиты животных против изолятов и штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 и, в частности, генотипа SAT-2/VII/Ghb-12.
[40]Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 из штамма «SAT-2/North Africa/2012» культуральной инактивированной эмульсионной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.
[41]Разработанная вакцина в 1,0 см3 препарата содержит следующие основные компоненты: 1) активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-2/North Africa/2012» (генотип SAT-2/VII/Ghb-12) вируса ящура, репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 6,0 мкг; 2) масляный адъювант DMIXVAC 78 V («Дмитриевский химический завод», РФ), обеспечивающий усиление иммунного ответа у животных с содержанием 70% по массе, 3) поддерживающая среда - до 1,0 см3.
[42]Штамм вируса ящура «SAT-2 / North Africa / 2012» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №499 - деп / 23-49 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».
[43]Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным монослойным клеткам линии свиной почки (СП) и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/SUSP/ARRIAH), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).
[44]Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы предпочтительно используют перевиваемую суспензионную культуру клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, а в качестве поддерживающей среды применяют среду Хэнкса без внесения сыворотки, но с добавлением гидролизата белков крови в количестве 5,0% от общего объема при рН среды 7,40-7,72. Инактивацию вируса проводят с использованием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с концентрацией 0,035% от объема вируссодержащей суспензии. Инактивированный вирус очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,030% от общего объема.
[45]Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2/North Africa/2012» (генотип SAT-2/VII/Ghb-12) вируса ящура представляет собой суспензию, содержащую инактивированный 146S иммуногенный компонент вируса ящура. Концентрацию компонента в продукте оценивают с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [18, 19, 20].
[46]Для создания вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1,0 см3 не менее 6,0 мкг инактивированного 146S компонента вируса ящура. Заявленную концентрацию иммуногенного компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена с помощью установки тангенциальной фильтрации Centramate 500S Pall.
[47]Вакцину против ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 из штамма «SAT-2/North Africa/2012» культуральную инактивированную эмульсионную получают путем смешивания очищенного антигена и масляного адъюванта DMIXVAC 78 V в соотношении 30% на 70% по массе, соответственно. Полученная вакцина представляет собой стабильную эмульсию обратного типа белого или бледно-розового цвета, содержащую инактивированный 146S компонент вируса ящура, который обеспечивает формирование специфического иммунитета.
[48]Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:
[49]1. Вакцина против ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 из штамма «SAT-2/North Africa/2012» культуральная инактивированная эмульсионная.
[50]2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 вируса ящура в эффективном количестве.
[52]Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антиген штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 вируса ящура в эффективном количестве.
[53]Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
[54]1. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.
[55]2. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в количестве не менее 6,0 мкг в 1,0 см3 готового вакцинного препарата.
[56]3. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант DMIXVAC 78 V.
[57]4. Вакцина содержит масляный адъювант DMIXVAC 78 V в количестве 70% (по массе) в 1,0 см3 готового препарата.
[58]5. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 вируса ящура, полученного предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, масляный адъювант DMIXVAC 78 V, добавка в готовом препарате в виде поддерживающей среды в следующих количествах:
[59]Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа
SAT-2/VII/Ghb-12 вируса ящура | | не менее 6,0 мкг/см3 |
| Масляный адъювант DMIXVAC 78 V | | 70% (по массе) |
| Поддерживающая среда | | до 1,0 см3 |
[60]Предлагаемая вакцина против ящура из штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 культуральная инактивированная эмульсионная обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против изолятов вируса ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12.
[61]Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противоящурной эмульсионной вакцины в качестве активного вещества введен антиген штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 вируса ящура, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против изолятов вируса ящура представленного генотипа, которые в последние годы вызывают вспышки в мире.
[62]Сущность изобретения отражена на графическом изображении:
[63]Фиг. 1 - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящурас эпизоотическими штаммами серологического типа SAT-2. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VР1.
[64]Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:
[65]SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена белка VР1 штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12;
[66]SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот 1D-гена белка VР1 штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12.
[67]Штамм «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.
[68]Морфологические признаки
[69]Штамм «SAT-2 / North Africa / 2012» вируса ящура имеет следующую таксономию: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus, серотип SAT-2, генотип SAT-2/VII/Ghb-12. Штамм возбудителя обладает следующими морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 23 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP4, VP2, VP3, VP1.
[71]По антигенным свойствам штамм «SAT-2 / North Africa / 2012» вируса ящура относится к серотипу SAT-2. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе и реакции микронейтрализации (РМН).
[72]Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP1 штамма «SAT-2 / North Africa / 2012» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «SAT-2 / North Africa / 2012» вируса ящурапринадлежит к генотипу SAT-2/VII/Ghb-12 (Фиг. 1).
[73]Антигенное родство (r1) штамма «SAT-2 / North Africa / 2012» вируса ящура изучено в реакции микронейтрализации вируса, в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура: штамм «SAT-2/ZIM/14/2002», штамм «SAT-2/ZIM/5/81», штамм «SAT-2/BOT/P3/98», штамм «SAT-2/ETH/1/90», штамм «SAT-2/GHA/2/90», штамм «SAT-2/GAM/8/79», штамм «SAT-2/SAU/6/2000», штамм «SAT-2/RWO/1/00», штамм «SAT-2/KEN/2/84», штамм «SAT-2/UGA/19/98», штамм «SAT-2/ANG/4/74», штамм «SAT-2/UGA/51/75», штамм «SAT-2/ETH/2/2007», штамм «SAT-2/ETH/2/91».
[74]Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, против 102 ТЦД50гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r1 определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [8, 9].
[75]Значение r1 в РМН интерпретировали следующим образом:
[76]при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;
[77]при < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.
[78]Максимальное родство отмечается при значении r1 в РМН, стремящимся к 1,0.
[79]Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-2 / North Africa / 2012» составили r1от 0,01 до 0,26, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-2.
[80]Гено- и хемотаксономическая характеристики
[81]Штамм «SAT-2 / North Africa / 2012» вируса ящура является РНК(+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 8,08×106Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,85×106Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.
[82]Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса, в том числе такой важный фермент как РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.
[84]Масса вириона составляет 8,40×10-18 г. Плавучая плотность 1,44 г/см3.
[85]Устойчивость к внешним факторам
[86]Штамм «SAT-2 / North Africa / 2012» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при pH 7,45-7,70. Сдвиги pH в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,4°С).
[87]Дополнительные признаки и свойства
[88]Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.
[89]Патогенность - инактивированный вирус не патогенен для парнокопытных животных.
[90]Вирулентность - инактивированный вирус не вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.
[91]Стабильность - неинактивированный вирус сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.
[92]Биотехнологические характеристики
[93]Штамм «SAT-2 / North Africa / 2012» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).
[94]При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «SAT-2 / North Africa / 2012» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.
[95]Для снижения эпизоотической опасности возникновения ящура, вызванного генотипом SAT-2/VII/Ghb-12, и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки новой безопасной и эффективной вакцины.
[96]Получена безопасная и эффективная вакцина против ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12из штамма «SAT-2/North Africa/2012» культуральная инактивированная эмульсионная.
[97]Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
[98]Пример 1. Генетическая характеристика штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура по данным ПЦР и нуклеотидного секвенирования.
[99]Проводили анализ первичной структуры гена 1D (белок VP1) штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера и определения положения данного штамма на филогенетическом древе вируса ящура серотипа SAT-2. Метод основан на определении первичной структуры гена 1D (белок VP1) испытуемого изолята/штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими изолятами/штаммами (16 представителей) вируса ящура серотипа SAT-2.
[100]Было необходимо провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 1D, кодирующего белок VP1 вируса ящура вакцинного штамма «SAT-2/North Africa/2012» с другими изолятами и штаммами. Последовательность нуклеотидов гена белка VР1 штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12вируса ящура представлена SEQ ID NO:1. Последовательность аминокислот 1D-гена, кодирующего белок VР1 штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12вируса ящура отражена на SEQ ID NO:2.
[101]Осуществлен филогенетический анализ для штамма «SAT-2/North Africa/2012». Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA 6 и алгоритма Neighbor-Joining [21]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (увеличили со стандартных 100 до 1000 повторов для высокой степени достоверности), показан рядом с ветвями [22, 23]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [24] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 11 нуклеотидных последовательностей, в том числе последовательность 1D-гена штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 645 позиций. Эволюционный анализ проводился в MEGA 6 [25].
[102]В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP1) штамма «SAT-2/North Africa/2012» и других изолятов/штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (фиг. 1). Таким образом, исследуемый штамм «SAT-2/North Africa/2012» относится к генотипу SAT-2/VII/Ghb-12, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.
[103]Пример 2. Адаптация штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 к перевиваемой монослойной культуре клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30.
[104]Для заражения перевиваемой монослойной культуры клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30 использовали 33%-ную афтозную суспензию вируса ящура, полученную из афт свиньи (2 пассаж). Посевная концентрация клеток составляла 0,20-0,25 млн кл./см3, доза заражения вирусом - 0,001 ТЦД50/кл. По результатам исследования репродукция вируса ящура штамма «SAT-2/North Africa/2012» проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 22-24 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 6,00±0,10 до 7,50±0,10 lg ТЦД50/см3.
[105]Максимальное значение титра инфекционной активности вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (7,50±0,10 lg ТЦД50/см3). Концентрация 146S частиц с 1 по 6 пассажи изменялась с 0,33±0,02 до 0,92±0,02 мкг/см3. При этом наибольшее количество 146S компонента отмечали на этапе 6 пассажа (0,92±0,02 мкг/см3). Степень достоверности (R2) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 99,16 до 100,00%. Таким образом, на протяжении 6-ти последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура к перевиваемой монослойной клеточной линии ПСГК-30.
[106]Пример 3. Изучение условий монослойного культивирования вируса ящура штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 в промышленных масштабах.
[107]В процессе промышленного культивирования штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12вируса ящура в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 осуществляли подбор оптимальных условий культивирования вируса по поддерживающей среде, температурному фактору и дозе заражения исследуемым вирусом клеток.
[108]На первом этапе исследования оценивали влияние состава поддерживающей среды на репродукцию штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 в масштабах производства (на этапе с 5-го на 6-ой пассажи). Для сравнения применяли три среды с добавлением 2,0% фетальной сыворотки крови телят: 1) среда Игла DМЕМ; 2) среда RPMI-1640; 3) раствор Хэнкса. Посевная концентрация клеток составляла 0,20 млн кл./см3, доза заражения вирусом - 0,1000-0,0001 ТЦД50/кл. Культивирование вируса осуществляли при температурах 35±0,2 - 38±0,2°С до разрушения клеточного монослоя не менее 85%. Результаты репродукции штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура с поддерживающими средами разного состава отражены в таблице 2.
[109]Из данных таблицы видно, что при репродукции штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда Хэнкса, позволяющая за 22-24 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100% с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 0,92±0,02 мкг/см3и титром инфекционной активности 7,50±0,10 lg ТЦД50/см3. При использовании среды RPMI-1640 и Игла DMEM показатели репродукции вируса были ниже.
[110]На следующем этапе изучения условий монослойного культивирования штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в условиях производства оценивали влияние на процесс репродукции вируса температурного фактора. Для этого культивирование вируса проводили в среде Игла DМЕМ с 2% сыворотки КРС при следующих температурах: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом ящура составляла 0,010-0,001 ТЦД50/кл. Культивирование вируса осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 85-100% в течение 22-30 ч (табл.1). По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой за 22-24 ч развитие ЦПД достигало 95-100% с накоплением 146S частиц, равным 0,92±0,02 мкг/см3и титром инфекционной активности вируса 7,50±0,10 lg ТЦД50/см3.
[111]Оценивали влияние дозы заражения монослоя клеток линии ПСГК-30 штаммом «SAT-2/North Africa/2012» при культивировании в масштабах производства. Для этого использовали разные дозы вируса: 0,10-0,01; 0,010-0,001; 0,0010-0,0001 ТЦД50/кл. В качестве поддерживающей среды применяли среду Игла МЕМ с 2% сыворотки крови КРС. Репродукцию вируса проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 22-30 ч до специфического разрушения клеток на 85-100%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 1, наибольшее накопление 146S компонента вируса достигалось при дозе заражения 0,01-0,001 ТЦД50/кл. и составило 0,92±0,02 мкг/см3с титром инфекционной активности вируса 7,50±0,10 lg ТЦД50/см3.
[112]Таким образом, проведено изучение условий монослойного культивирования штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в промышленных масштабах. В результате исследования определены следующие оптимальные параметры репродукции штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура в монослойной клеточной линии ПСГК-30:
[113]1) поддерживающая среда - среда Хэнкса; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом - 0,01-0,001 ТЦД50/кл.
[114]Пример 4. Изучение условий суспензионного культивирования штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 вируса ящура в промышленных масштабах.
[115]При промышленном культивирования штамма «SAT-2/North Africa/2012»генотипа SAT-2/VII/Ghb-12вируса ящура в перевиваемой суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проводили поиск оптимальных параметров для успешной репродукции возбудителя ящура, используя разные концентрации клеток, температурные условия и дозу заражения вирусом.
[116]На первом этапе работы определяли влияние посевной концентрации клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии на репродукцию штамма «SAT-2/North Africa/2012»вируса ящура в промышленных масштабах. Для анализа подготовили суспензии со следующими концентрации клеток: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 млн кл./см3. Водородный показатель рН поддерживали в диапазоне 7,45-7,70. Температура культивирования вируса составляла 37,0±0,02°С, доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД50/кл. Репродукцию вируса проводили до специфической гибели клеток на 95-100%, которая осуществлялась в течение 14-16 ч. Результаты суспензионного культивирования штамма «SAT-2/North Africa/2012»вируса ящура в суспензии с разными концентрациями клеток представлены в таблице 2.
[117]Как следует из таблицы 2, при культивировании вируса ящура штамма «SAT-2/North Africa/2012»в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 2,5 млн кл./см3составило 0,90±0,02 мкг/см3, с концентрацией 3,0 млн кл./см3- 1,52±0,02 мкг/см3, с концентрацией 3,5 млн кл./см3 - 2,01±0,02 мкг/см3, и с концентрацией 4,0 млн кл./см3- 2,12±0,02 мкг/см3. Как следует из полученных данных для репродукции штамма «SAT-2/North Africa/2012»вируса ящура достаточной является концентрация клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии, равная 3,5 млн кл./см3 (при концентрации 4,0 млн кл./см3концентрация незначительно выше, но затраты на производство по количеству клеток выше, исходя из этого, экономически целесообразно использовать концентрацию клеток, равную 3,5 млн кл./см3). Значение титра инфекционной активности вируса при этом составило 9,15±0,10 lg ТЦД50/см3.
[118]На следующем этапе работы исследовали влияние температурного фактора на репродукцию штамма «SAT-2/North Africa/2012»вируса ящура в суспензионной культуре клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Для этого репродукцию вируса проводили при следующих температурных условиях: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,010-0,001 ТЦД50/кл. Водородный показатель рН вирусной суспензии поддерживали в том же диапазоне. Культивирование вируса проводили до ЦПД, равного не менее 85% (приоритет отдавали полной специфической деструкции клеток), в течение 14-25 ч. По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма «SAT-2/North Africa/2012»вируса ящура в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой в течение 14-15 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100% с высоким накоплением 146S компонента (2,01±0,02 мкг/см3) и титром инфекционной активности вируса 9,15±0,10 lg ТЦД50/см3.
[119]В ходе работы по изучению условий суспензионного культивирования штамма «SAT-2/North Africa/2012»вируса ящура в промышленных масштабах с применением культуры клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оценивали влияние дозы заражения клеток. Для этого клеточные суспензии заражали вирусом в разных дозах: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД50/кл. Репродукцию вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С в течение 14-24 ч до цитопатического действия, равного не менее 90%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S частиц и титр инфекционной активности вируса ящура. Как видно из данных таблицы 2, наибольшее накопление 146S компонента отмечали при дозе заражения 0,010-0,001 ТЦД50/кл. (2,01±0,02 мкг/см3) с титром инфекционной активности вируса, равным 9,15±0,10 lg ТЦД50/см3.
[120]Таким образом, проведено изучение трех параметров суспензионного культивирования штамма «SAT-2/North Africa/2012»генотипа SAT-2/VII/Ghb-12вируса ящура в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Выявлены оптимальные условия репродукции штамма «SAT-2/North Africa/2012» в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH: 1) концентрация клеток перед заражением - 3,5 млн кл./см3; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД50/кл.
[121]Пример 5. Инактивация суспензии вируса ящура штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12.
[122]По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования (37,0±0,2°С), в вируссодержащую суспензию добавляли подкисленный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с рН, равным 8,2-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,028%. Инактивацию инфекционной активности вируса ящура штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12проводили в течение 12 часов при температуре 37,0±0,1°С и рН 7,45-7,70 с периодическим перемешиванием.
[123]Для определения времени полной инактивации после добавления 1,2-АЭЭИ каждый час производили отбор проб. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса ящура в первичной культуре клеток почки свиньи СП. Результаты представлены в таблице 3, из данных которой видно, что полная инактивация вируса ящура штамма
«SAT-2/North Africa/2012», репродуцированного в культиваторах, произошла через 6 часов после внесения 1,2-АЭЭИ.
[124]Готовые вирусные инактивированные суспензии исследовали в РСК для оценки содержания в них компонентов вируса. Концентрация 146S компонента составила 1,98±0,02 мкг/см3.
[125]Пример 6. Подбор условий очистки суспензии вируса ящура штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12.
[126]Суспензию вируса ящура штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12, полученную при репродукции в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали инактивации и очистке. Для получения очищенного антигена вируса ящура использовали полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) с концентрациями 0,020, 0,035 и 0,050%. До и после процесса очистки антигена вируса ящура штамма «SAT-2/North Africa/2012»в количественном варианте РСК определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов. Результаты анализа отражены в таблице 4, из которой следует, что в результате очистки антигена вируса ящура штамма «SAT-2/North Africa/2012»с помощью ПГМГ в концентрации 0,020% отмечали снижение концентрации балластного белка на 14%, иммуногенных компонентов - на 2%. При использовании ПГМГ в концентрации 0,035% наблюдали снижение количества балластного белка на 39%, 146S компонента - на 2,6%. Применяя ПГМГ в концентрации 0,050% содержание балластного белка уменьшалось на 44%, а иммуногенных компонентов - на 18%.
[127]Таким образом, исследуя условия очистки антигена штамма «SAT-2/North Africa/2012», пришли к выводу о том, что для получения очищенного продукта оптимально использовать ПГМГ с концентрацией 0,035%.
[128]Пример 7. Подбор условий концентрирования суспензии антигена штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12.
[129]Культуральную инактивированною суспензию штамма «SAT-2/North Africa/2012», полученную с применением суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали концентрированию в 8 раз по объему. Для увеличения концентрации иммуногенных компонентов антигена вируса ящура использовали следующие приемы: 1) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 4 ч; 2) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч; 3) концентрирование с помощью установки тангенциальной фильтрации Centramate 500S Pall в течение 3 ч при рабочем давлении на фильтр 1,8-2,0 атм.
[130]До и после процесса концентрирования суспензии антигена вируса ящура штамма «SAT-2/North Africa/2012»определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов в количественном варианте РСК. Результаты исследований представлены в таблице 5, из которой видно, что при концентрировании антигена штамма «SAT-2/North Africa/2012»вируса ящура с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 6,2 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 6,8 раз. Применяя метод концентрирования с помощью тангенциальной фильтрации, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена штамма «SAT-2/North Africa/2012»вируса ящура в суспензии в 7,9 раз (концентрация 146S компонента составила 15,25±0,02 мкг/см3). Таким образом, технология тангенциальной фильтрации позволила получить антиген штамма «SAT-2/North Africa/2012» с высокой концентрацией структурных вирусных белков.
[131]Пример 8. Подбор адъюванта и соотношения антиген-адъювант.
[132]При изготовлении данного вакцинного препарата использовали масляный адъювант DMIXVAC 78 V в количестве 70% по массе.
[133]Пример 9. Компоновка вакцины против ящура из штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 культуральной инактивированной эмульсионной.
[134]Из полученного концентрата антигена вируса ящура штамма «SAT-2/North Africa/2012» изготовили вакцину против ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 культуральную инактивированную эмульсионную с применением в качестве адъюванта DMIXVAC 78 V. Количество 146S иммуногенного компонента в 1,0 см3антигенасоставило 15,25±0,02 мкг/см3 (табл. 5).
[135]Пример 10. Иммунизация животных вакциной против ящура из штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 культуральной инактивированной эмульсионной.
[136]Из полученной вакцины против ящура из штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) был приготовлен ряд разведений для свиней с 5-ти кратным шагом. 15 голов свиней разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см3. Первую группу животных (№№ 1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую группу свиней (№№ 6-10) привили вакциной, разведенной 1/5, третья группа животных (№№ 11-15) - вакциной, разведенной 1/25. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи. В качестве контроля вируса оставили 2 головы без вакцинации.
[137]Пример 11. Исследование сывороток крови вакцинированных животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура.
[138]Сыворотки крови от свиней, полученные до иммунизации и через 14 суток после иммунизации, исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ) [3]. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «Prio CHECK® FMDV NSP ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Полученные результаты исследований отражены в таблице 6, из которой видно, что сыворотки крови животных не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения PI для сывороток крови свиней < 50%).
[139]Пример 12. Оценка авирулентности и безвредности вакцины против ящура из штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение).
[140]Для определения авирулентности вакцины для свиней отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно по 0,1 см3. В исследовании использовали свиней массой 30-40 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.
[141]Контроль безвредности вакцинного продукта на животных проводили путём внутримышечного введения вакцины в дозе 6,0 см3 (тройная доза по 2,0 см3). Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после иммунизации температура тела животного может повышаться до 40,5°С и удерживаться на этом уровне в течение 1-2 суток, что не выходит за рамки нормы после введения вакцинного препарата.
[142]По результатам исследований вакцина против ящура из штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12культуральная инактивированная эмульсионная (предлагаемое изобретение) была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.
[143]Пример 13. Изучение иммуногенных свойств вакцины против ящура из штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) по способности индуцирования вируснейтрализующих антител у естественно восприимчивых животных.
[144]На 21 сутки после введения вакцины против ящура из штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) у свиней отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции микронейтрализации [3]. Выявлено, что у свиней, иммунизированных вакциной в цельной дозе (5 голов), средние значения титра антител составили 7,75±0,18 log2SN50, с разведением 1/5 (5 голов) - 4,25±0,18 log2SN50, с разведением 1/25 (5 голов) - 3,25±0,21 log2SN50 (табл. 7). Полученные данные реакции микронейтрализации свидетельствуют о том, что после введения вакцины в цельном виде обеспечивается формирование гуморального иммунитета с защитными титрами штаммоспецифических антител (5,5 и более log2SN50), что соответствует требованиям международных стандартов [3].
[145]Пример 14. Изучение защитной способности вакцины против ящура из штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) на естественно восприимчивых видах животных путем контрольного заражения.
[146]Свиньи, иммунизированные в количестве 15 голов, вакциной в цельном виде и в разведениях, заражали контрольным штаммом «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12вируса ящура, адаптированного к этим животным в дозе 104,0 ИД50/0,20 см3 (в две точки по 0,10±0,05 см3). Спустя 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и провели патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения. Первичные афты не учитывали.
[147]Результаты контрольного заражения представлены в таблице 7, из которой следует, что вакцина против ящура из штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12культуральная инактивированная эмульсионная (предлагаемое изобретение) в цельном виде, а также в разведениях 1/5 и 1/25, введенная в однократной дозе (2,0 см3) защищает свиней от заражения гомологичным штаммом всех животных (5 из 5 голов).
[148]По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 40,52 ПД50 и 0,05 ИмД50 для свиней.
[149]Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина против ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 из штамма «SAT-2/North Africa/2012» культуральная инактивированная эмульсионная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена как резервная для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма «SAT-2/North Africa/2012»генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12. Кроме того, вакцина против ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 из штамма «SAT-2/North Africa/2012» культуральная инактивированная эмульсионная изготовлена с применением масляного адъюванта DMIXVAC 78 V отечественного производства («Дмитриевский химический завод», РФ, г. Кинешма).
[150]Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина против ящура генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 из штамма «SAT-2/North Africa/2012» культуральная инактивированная эмульсионная»:
[151]1. Ящур. Меры профилактики. URL: http://89.rospotrebnadzor.ru/directions/epid_nadzor/146902 (Дата обращения: 13.11.2023).
[152]2. Опасность болезни ящура. URL: https://vet.astrobl.ru/press-release/opasnost-bolezni-yashchura (Дата обращения: 21.10.2023).
[153]3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. - Paris, 2022 - Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.
[154]4. Бурдов А. Н., Дудников А. И., Малярец П. В. и др. Ящур. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.
[155]5. Пономарев А. П., Узюмов В. Л., Груздев К. Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.
[156]6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.
[157]7. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp. 2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - p. 13-21.
[158]8. Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response / T.G. William, J. M. Pachecoa, Т. Doel [et.al.] // Vaccine. - December 2005. - V. 23. - P. 5775-5782.
[159]9. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.
[160]10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.
[161]11. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL: http://www.wrlfmd.org/ref_labs/fmd_ref_lab_reports.htm (Дата обращения 22.11.2023).
[162]12. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16. - Р. 746-754.
[163]13. Рахманов А.М. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля //Ветеринарная медицина мiжвiд. тем. наук. Харкiв, 2013. - С. 37-38.
[164]14. Longjam N., Tayo T. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. - 2011. - Vol. 4(10). - P. 475-479.
[165]15. Мельник Р.Н., Хаустова Н.В., Мельник Н.В., Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Святенко М.С., Литенкова И.Ю. Антигенная вариабельность вируса ящура серотипа А и обоснование необходимости получения новых актуальных производственных штаммов/ Ветеринария и кормление. - 2019. - №3. - С.29-31.
[166]16. Paton D.J., Sumption K.J., Charleston B. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy/ Phil. Trans. R. Soc. B (2009) 364. - P. 2657-2667.
[167]17. Jo HE, You SH, Choi JH, Ko MK, Shin SH, Song J, Jo H, Lee MJ, Kim SM, Kim B, Park JH. Evaluation of novel inactivated vaccines for the SAT 1, SAT 2 and SAT 3 serotypes of foot-and-mouth disease in pigs. Virol J. 2019 Dec 16;16(1):156. doi: 10.1186/s12985-019-1262-1. PMID: 31842907; PMCID: PMC6916012.
[168]18. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.
[169]19. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Утв. 21.09.17.
[170]20. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.
[171]21. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-42.
[172]22. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791.
[173]23. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.
[174]24. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., and Tamura K. (2018). MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.
[175]25. Barnett P. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - 2002. - V. 25. - P. 345-364.
[177]Результаты адаптации штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура при культивировании в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 в разных условиях
[179]| Параметр | Условия культивиро-
вания | Время репродукции, ч | ЦПД, % | Концентрация 146S частиц по данным
ОТ-ПЦР-РВ, мкг/см3 | Титр инфекционной активности,
lg ТЦД50/см3 |
| Состав поддерживающей среды | Среда Игла DМЕМ+ 2% SКРС | 25-26 | 95-100 | 0,71±0,02 | 7,02±0,10 |
| Среда RPMI-1640 + 2% SКРС | 24-25 | 95-100 | 0,75±0,02 | 7,10±0,10 |
Раствор Хэнкса с 5 % ГБК +
2% SКРС | 22-24 | 95-100 | 0,92±0,02 | 7,50±0,10 |
| Температура, °С | 35,0±0,2 | 29-30 | 85-90 | 0,39±0,02 | 5,95±0,10 |
| 36,0±0,2 | 24-25 | 85-90 | 0,75±0,03 | 7,10±0,10 |
| 37,0±0,2 | 22-24 | 95-100 | 0,92±0,02 | 7,50±0,10 |
| 38,0±0,2 | 24-25 | 90-95 | 0,75±0,02 | 7,10±0,10 |
| Доза заражения | 0,1-0,01 | 23-25 | 90-95 | 0,80±0,03 | 7,20±0,10 |
| 0,01-0,001 | 22-24 | 95-100 | 0,92±0,02 | 7,50±0,10 |
| 0,001-0,0001 | 28-30 | 85-90 | 0,42±0,02 | 6,05 ±0,10 |
[180]Примечание: SКРС- сыворотка крови крупного рогатого скота,
[181]ГБК - гидролизат белков крови,
[182]DМЕМ - название среды Игла,
[183]RPMI-1640 - название культуральной среды,
[184]ЦПД - цитопатическое действие.
[186]Результаты репродукции штамма «SAT-2/North Africa/2012» вируса ящура в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разной концентрацией клеток
[188]| Параметр | Условия культивиро-
вания | Время репродукции, ч | ЦПД, % | Концентрация 146S частиц по данным
ОТ-ПЦР-РВ, мкг/см3 | Титр инфекционной активности,
lg ТЦД50/см3 |
Концентрация клеток перед заражением,
млн кл./см3 | 2,5 | 15-16 | 95-100 | 0,90±0,02 | 7,48±0,10 |
| 3,0 | 14-15 | 95-100 | 1,52±0,02 | 8,09±0,10 |
| 3,5 | 14-15 | 95-100 | 2,01±0,02 | 9,15±0,10 |
| 4,0 | 15 | 95-100 | 2,12±0,02 | 9,23±0,10 |
| Температура, °С | 35,0±0,2 | 23-25 | 85-90 | 0,75±0,02 | 7,10±0,10 |
| 36,0±0,2 | 19-20 | 85-90 | 1,50±0,02 | 8,06±0,10 |
| 37,0±0,2 | 14-15 | 95-100 | 2,01±0,02 | 9,15±0,10 |
| 38,0±0,2 | 17-18 | 95-100 | 1,86±0,02 | 8,25±0,10 |
| Доза заражения | 0,1-0,01 | 15-16 | 95-100 | 1,65±0,02 | 8,32±0,10 |
| 0,01-0,001 | 14-15 | 95-100 | 2,01±0,02 | 9,15±0,10 |
| 0,001-0,0001 | 23-24 | 90-95 | 1,45±0,02 | 7,95±0,10 |
[189]Примечание: ОТ-ПЦР-РВ - обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция,
[190]ТЦД - тканевая цитопатическая доза,
[191]ЦПД - цитопатическое действие.
[193]Исследование кинетики инактивации суспензии вируса ящура штамма
«SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12
[195]| Время отбора проб с момента инактивации, ч | Титр инфекционной активности вируса ящура, lg ТЦД50/см3 |
| 0 | 9,15±0,10 |
| 1 | 7,85±0,10 |
| 2 | 5,95±0,10 |
| 4 | 3,95±0,10 |
| 5 | 1,65±0,10 |
| 6 | 0 |
| 12 | 0 |
[197]Содержание компонентов штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 вируса ящура в суспензиях до и после очистки
[199]| До очистки | Условия очистки | После очистки |
| концентрация балластного белка, мг/см3 | концентрация иммуногенных компонентов, мкг/см3 | концентрация балластного белка, мг/см3 | концентрация иммуногенных компонентов, мкг/см3 |
| 146S компонент | 146S+75S компоненты | 146S компонент | 146S+75S компоненты |
| 9,16±0,10 | 1,98±0,02 | 2,95±0,02 | ПГМГ,
0,020% | 7,88±0,10 | 1,94±0,02 | 2,89±0,02 |
| ПГМГ, 0,035% | 5,59±0,10 | 1,93±0,02 | 2,87±0,02 |
ПГМГ,
0,050% | 5,13±0,10 | 1,62±0,02 | 2,42±0,02 |
[200]Примечание: концентрацию балластного белка определяли по формуле Калькара:
[201]С=1,45 × А280-0,74 × А260,
[202]где А280 - значение оптической плотности при длине волны 280 нм,
[203]А260 - значение оптической плотности при длине волны 260 нм,
[204]ПГМГ - полигексаметиленгуанидин (флокулянт).
[206]Содержание компонентов антигена штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12 вируса ящура в суспензиях до и после концентрирования
[208]| Концентрация компонентов до концентрирования, мкг/см3 | Методы концентрирования
(в 5 раз) | Концентрация компонентов после концентрирования, мкг/см3 |
| ОВБ | 146S компонент | 146S+75S компонент | ОВБ | 146S компонент | 146S+75S компонент |
| 2,97±0,02 | 1,93±0,02 | 2,88±0,02 | ПЭГ-6000,
4 ч | 18,41±0,02 | 11,97±0,02 | 17,86±0,02 |
ПЭГ-6000,
12 ч | 20,20±0,02 | 13,12±0,02 | 19,58±0,02 |
Тангенциальная фильтрация,
3 ч | 23,46±0,02 | 15,25±0,02 | 22,75±0,02 |
[209]Примечание: ПЭГ - полиэтиленгликоль,
[210]ОВБ - общий вирусный белок.
[212]Результаты исследования сывороток крови свиней на антитела к неструктурным белкам вируса ящура до и после вакцинации препаратом (предлагаемое изобретение), изготовленным с применением антигена вируса ящура штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12
[213]| № жив-о п/п | Значение оптической плотности пробы | Процент ингибиции (PI), % |
| тип образца | референс-значения | до вакцинации | на 14 сутки после вакцинации | тип образца | референс-значения | до вакцинации | на 14 сутки после вакцинации |
| СПК | 0,410 | -//- | СПК | 59,08 | -//- |
| ПК | 0,059 | ПК | 94,11 |
| ОК | 1,002 | ОК | 0,00 |
| 1 | -//- | 0,902 | 0,888 | -//- | 9,98 | 11,38 |
| 2 | 0,915 | 0,879 | 8,68 | 12,28 |
[214]Примечание: СПК - слабоположительный контроль,
[215]ПК - положительный контроль,
[216]ОК - отрицательный контроль, сыворотка отрицательная при PI, меньшим 50%.
[218]Исследование гуморального иммунитета и иммуногенной активности вакцины против ящура из штамма «SAT-2/North Africa/2012» генотипа SAT-2/VII/Ghb-12культуральной инактивированной эмульсионной на свиньях
[220]| Наименование штамма для контрольного заражения | Разведение вводимой вакцины | № животных п/п | Титр антител в РМН, log2 SN50 | Результаты контрольного заражения | ИмД50/ПД50 |
| SAT-2/North Africa/2012 | без разведения | 1 | 7,50 | - | 0,05/
40,52 |
| 2 | 8,00 | - |
| 3 | 7,75 | - |
| 4 | 7,75 | - |
| 5 | 7,75 | - |
| M±m | 7,75±0,18 | 0/5 |
| 1/5 | 6 | 4,25 | - |
| 7 | 4,25 | - |
| 8 | 4,50 | - |
| 9 | 4,25 | - |
| 10 | 4,00 | - |
| M±m | 4,25±0,18 | 0/5 |
| 1/25 | 11 | 3,50 | - |
| 12 | 3,25 | - |
| 13 | 3,50 | - |
| 14 | 2,75 | + |
| 15 | 3,25 | - |
| M±m | 3,25±0,21 | 1/5 |
| контроль 1 | - | + |
| контроль 2 | - | + |
[221]Примечание: «-» отсутствие генерализации процесса ящура,
[222]РМН - реакция микронейтрализации,
[223]ИмД50 - иммуногенная доза,
[224]ПД50 - протективная доза.
[226]<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
[227]<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
[228]1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
[229]<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Vaccine FMD SAT-2
[230]Ghb-12.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"
[231]productionDate="2023-11-27">
[232] <ApplicationIdentification>
[233] <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
[234] <ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>
[235] <FilingDate>2023-11-27</FilingDate>
[236] </ApplicationIdentification>
[237] <ApplicantFileReference>558</ApplicantFileReference>
[238] <EarliestPriorityApplicationIdentification>
[239] <IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
[240] <ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>
[241] <FilingDate>2023-11-27</FilingDate>
[242] </EarliestPriorityApplicationIdentification>
[243] <ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны
[244]здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>
[245] <ApplicantNameLatin>FGBI "ARRIAH"</ApplicantNameLatin>
[246] <InventorName languageCode="ru">Доронин Максим
[247]Игоревич</InventorName>
[248] <InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>
[249] <InventionTitle languageCode="ru">Вакцина против ящура генотипа
[250]SAT-2/VII/Ghb-12 из штамма «SAT-2/North Africa/2012» культуральная
[251]инактивированная эмульсионная</InventionTitle>
[252] <SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>
[253] <SequenceData sequenceIDNumber="1">
[255] <INSDSeq_length>645</INSDSeq_length>
[256] <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
[257] <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
[258] <INSDSeq_feature-table>
[260] <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
[261] <INSDFeature_location>1..645</INSDFeature_location>
[262] <INSDFeature_quals>
[264] <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
[265] <INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
[267] <INSDQualifier id="q1">
[268] <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
[269] <INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>
[271] </INSDFeature_quals>
[273] </INSDSeq_feature-table>
[274] <INSDSeq_sequence>actaaatcagcgggagaaggcgcagatgtcgtcaccacggacccatcca
[275]cacacggtgggaacgttcaagagggccggcgcaaacacaccgaagttgcgttccttcttgaccgcagtac
[276]acatgtccacacaggaaaaacatcttttgtcgtggacctcatgaacacaaagaagaaggcgctcgtgggc
[277]gcaatcctgcgggcttccacctactacttttgtgaccttgagattgcgtgtgtgggcgatcacacaaggg
[278]tcttttggcaacccaacggggcaccgcgaaccacccagcccggcgataaccccatggtttttgctaaggg
[279]cggcgtgacccgctttgccatcccgttcacagccccgcaccggctgctgtccaccgtctacaacggcgag
[280]tgcgactacaacaagactgttactgccatccgtggggaccgggcagcactcgcggcaaagtatgctgaca
[281]acacgcacaccctgccgtcaaccttcaacttcgggttcgtgaccgtcgacaaaccagtcgacgtttacta
[282]ccgaatgaagagggctgagctgtactgcccacgcccgctgttgccaacctacgaccacgcaggcagagac
[283]agattcgacgcgcccatcggcgtcgagagaaaaccc</INSDSeq_sequence>
[286] <SequenceData sequenceIDNumber="2">
[288] <INSDSeq_length>215</INSDSeq_length>
[289] <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
[290] <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
[291] <INSDSeq_feature-table>
[293] <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
[294] <INSDFeature_location>1..215</INSDFeature_location>
[295] <INSDFeature_quals>
[297] <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
[298] <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
[300] <INSDQualifier id="q2">
[301] <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
[302] <INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>
[304] </INSDFeature_quals>
[306] </INSDSeq_feature-table>
[307] <INSDSeq_sequence>TKSAGEGADVVTTDPSTHGGNVQEGRRKHTEVAFLLDRSTHVHTGKTSF
[308]VVDLMNTKKKALVGAILRASTYYFCDLEIACVGDHTRVFWQPNGAPRTTQPGDNPMVFAKGGVTRFAIPF
[309]TAPHRLLSTVYNGECDYNKTVTAIRGDRAALAAKYADNTHTLPSTFNFGFVTVDKPVDVYYRMKRAELYC
[310]PRPLLPTYDHAGRDRFDAPIGVERKP</INSDSeq_sequence>
[313]</ST26SequenceListing>
