[1]Изобретение относится к санитарной микробиологии и может быть использовано для обнаружения и количественного учета бактерий рода Pseudomonas при исследовании воды и объектов окружающей среды в лабораториях гигиенического и эпидемиологического профиля.
[2]Псевдомонады широко распространены в природе, являются активными протеолитами, обеспечивают процессы разложения органических веществ, гниения.
[3]По данным ВОЗ, P. aeruginosa может вызывать ряд заболеваний, особенно у людей при снижении иммунного статуса организма. Инфицирование происходит при контакте чувствительных и поврежденных участков кожных покровов, слизистых, дыхательных путей с контаминированной водой. Попадая в организм человека, P. aeruginosa может вызывать различные заболевания: менингит, уроинфекции, прогрессирующую легочную инфекцию, а также заболевания кожных покровов, глаз, слизистых. [Иванова Л.В., Артемова Т.З., Гипп Е.К., Загайнова А.В., Максимкина Т.Н., Красняк А.В., Корнейчук С.С. Обоснование значимости показателя Pseudomonas aeruginosa при оценке качества питьевой воды. Гигиена и санитария, 2013:(4):29-32].
[4]Степень обсемененности P. aeruginosa характеризует санитарное состояние и уровень эпидемической опасности объекта: воды источников водоснабжения, питьевой воды централизованного водоснабжения, рекреационных вод прибрежных пляжей, акваторий, плавательных бассейнов, сточных жидкостей при оценке качества биологической очистки и обеззараживания.
[5]В соответствии с Методическими указаниями [Методические рекомендации обнаружение и идентификация Pseudomonas aeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных жидкостях)] обнаружение P. aeruginosa в объектах окружающей среды сигнализирует одновременно о санитарном (как индикатор биологического загрязнения) и эпидемическом (как патоген) неблагополучии.
[6]Представленные данные об опасности возникновений заболеваний при контакте с водой, контаминированной P. aeruginosa подтверждают актуальность проблемы, поэтому необходимо своевременное обнаружение патогена.
[7]В отечественной практике существуют подходы к определению P. aeruginosa в воде. Методика в соответствии с МР № 96/225-1997 предусматривает использование прямого посева пробы на среду Эндо или Блеск. Действующие в настоящее время ГОСТ Р 70152-2022, ГОСТ 34786-2021, МУ 2.1.4.1184-03, МУК 4.2.2959-11, МУК 4.2.3963-23 и методические рекомендации «Обнаружение и идентификация Pseudomonas aeruginosa в объектах окружающей среды (пищевых продуктах, воде, сточных жидкостях)» регламентируют накопление микроба в среде Бонде, а обнаружение и идентификацию - с использованием питательной среды Блеск благодаря уникальному металлическому блеску колоний P.aeruginosa, обнаруживаемому, как правило, только у этого микроба.
[8]При предположении массивного обсеменения объекта P. aeruginosa (сточные жидкости, белковые пищевые продукты после просроченного срока годности и органолептически недоброкачественные) исследование может быть начато непосредственно со второго этапа, т.е. с посева исследуемого объекта на среду Блеск как при качественном, так и при количественном исследовании. При последнем материал распределяется шпателем по поверхности среды Блеск.
[9]В настоящее время отечественными производителями не выпускаются среды Бонде и Блеск, поэтому существует необходимость разработки и внедрения в производство сухой питательной среды для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa (среды Блеск). В соответствии с действующими нормативными документами, рекомендован состав среды Блеск лабораторного приготовления, для этого в 100 мл 2% - ного расплавленного стерильного мясопептонного агара (МПА) добавляют: 10 мл снятого (обезжиренного) молока, 8,0 мл 10% водного раствора трифенилтетразолия хлорида (ТТХ) и 0,3 г L-аргинина.
[10]Недостатком среды Блеск лабораторного приготовления являются:
[11]- не стандартизованный состав среды Блеск не обеспечивает исключительную видоспецифичность в отношении P. aeruginosa и дифференцирующие свойства среды;
[12]- низкая чувствительность, не позволяющая определять наличие P. aeruginosa в незначительных концентрациях (около 10 КОЕ/мл);
[13]- возможен рост ТТХ-резистентных штаммов клебсиелл, серраций, энтеробактерий, которые могут развиваться на среде Блеск в виде темно-красных разного размера, лишенных блеска, или выпуклых блестящих ярко-красных колоний, что приводит к дополнительным исследованиям по идетификации.
[14]Технической задачей является создание отечественной питательной среды для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa, модифицированной (Среда Блеск).
[15]Техническим результатом является получение модифицированной Среды Блеск, обладающей высокой чувствительностью и специфичностью не только в отношении P. aeruginosa образующих пигменты феназинового ряда, но и беспигментных штаммов, а также значительной селективностью.
[16]Технический результат достигается тем, что предложена двухкомпонентная питательная среда, состоящая из сухой основы: панкреатический гидролизат казеина с Твином, пептон ферментативный, натрий хлористый, L-аргинин, агар микробиологический и водного раствора ТТХ и снятого молока.
[17]Питательная среда для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa, модифицированная (Среда Блеск), содержащая белковую основу, натрий хлористый, L-аргинин, причем в качестве белковой основы она содержит сухой панкреатический гидролизат казеина высушенный с Твином (ПГК-ТВ мод) и пептон ферментативный, а так же агар микробиологический при следующем соотношении сухих компонентов. г/л:
[18]| Панкреатический гидролизат казеина с твином модифицированный сухой (ПГК -ТВ мод) | 8,1-12,1 |
| Пептон ферментативный | 8,0-12,0 |
| Натрий хлористый | 3,0-5,0 |
| L-аргинин | 1,0-2,0 |
| Агар бактериологический | 8,0-12,0 |
| 10% водный раствор ТТХ | 80,0 мл |
| Снятое молоко | 100,0 мл |
[19]Способ получения двухкомпонентной питательной среды для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa, модифицированной (Среда Блеск) предусматривает смешивание сухих компонентов, г/л:
[20]| Панкреатический гидролизат казеина с твином модифицированный сухой (ПГК -ТВ мод) | 8,1-12,1 |
| Пептон ферментативный | 8,0-12,0 |
| Натрий хлористый | 3,0-5,0 |
| L-аргинин | 1,0-2,0 |
| Агар бактериологический | 8,0-12,0 |
[21]Затем для приготовления готовой к применению питательной среды Блеск, навеску сухих компонентов растворяют в 1,0 л дистиллированной воды, стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин, затем в охлажденную до (40-50)°С добавляют жидкие компоненты: 100 мл/л стерильного снятого молока; 80 мл/л 10% водного раствора трифенилтетразолия хлорида (ТТХ самостерилизуется после хранения при комнатной температуре в течение 2-3 дней).
[22]Панкреатический гидролизат казеина с твином модифицированный (ПГК -ТВ мод) и пептон ферментативный являются источниками азотистого питания, а также витаминов, минеральных солей и аминокислот, необходимых для роста микроорганизмов. ТТХ обеспечивает элективность среды. P. aeruginosa восстанавливает ТТХ до трифенилформазана вследствие чего колонии псевдомонад окрашиваются в темно-красный цвет. Твин - компонент обогащения питательной среды, поддерживающий жизнеспособность микроорганизмов. Твин, как детергент, способствует нейтрализации дезинфектантов в питательной среде. Наличие твина и аргинина способствует высокой интенсивности образования золотистого блеска колоний псевдомонад. Натрий хлористый поддерживает осмотический баланс.
[23]Отличием предлагаемой среды от прототипа лабораторного приготовления является: использование в качестве сухой белковой основы пептона ферментативного и панкреатического гидролизата казеина, высушенного с Твином, модифицированного (ПГК -ТВмод), который получают путем внесения в осветленный изоэлектрических зонах жидкий панкреатический гидролизат казеина расчетное количество Твина (на каждые 10 г сухого ПГК - 0,1 мл) и высушивания гидролизата на сушильной установке в виброкипящем слое А1-ФМУ, однако возможно использование любой сушильной установки, обычно используемой на практике, поэтому сушильную установку А1-ФМУ не следует использовать как основание для ограничения объема исспрашиваемых прав по настоящей заявке.
[24]Расчетное количество Твина вычисляют по следующим формулам:
[25]1. Определение общего содержания сухих веществ (
) в заданном объеме жидкого панкреатического гидролизата казеина:
[26]
;
[27] - общее содержание сухих веществ, г;
[28]V - объем жидкого гидролизата рыбной муки, л;
[29]СО - содержание сухих веществ в ПГК в %, определенное рефрактометрическим методом. (Рефрактометрический метод основан на измерении показателя преломления анализируемого раствора при температуре (20±0,5)°С на рефрактометре. Массовую долю растворимых сухих веществ определяют прямым считыванием по шкале рефрактометра).
[30]2. Определение объема Твина необходимого для внесения в заданный объем (V л) жидкого панкреатического гидролизата казеина:
[31]
; где
[32]
для внесения в заданный объем гидролизата;
[33]
- общее содержание сухих веществ в заданном объеме гидролизата;
[34]
- количество Твина для расчета на каждые 10 г сухого панкреатического гидролизата казеина;
[35]
- количество сухого панкреатического гидролизата казеина для расчета общего расхода Твина.
[36]Пример 1. Для приготовления питательной среды для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa, модифицированной (Среда Блеск) берут навески сухих компонентов в г/л:
[37]| Панкреатический гидролизат казеина с твином, модифицированный (ПГК-ТВмод) | 8,1 |
| Пептон ферментативный | 8,0 |
| Натрий хлористый | 3,0 |
| L-аргинин | 1,0 |
| Агар бактериологический | 8,0 |
[38]Навески размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят в течение 2 мин, стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин. После охлаждения до температуры 40-45°C в асептических условиях вносят жидкие компоненты: стерильное снятое молоко и 10% - ный раствор ТТХ.
[39]Используемые для контроля питательной среды для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa, модифицированной (Среда Блеск) тест-штаммы микроорганизмов получали из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ.
[40]Контроль качества проводили с использованием 6 целевых тест-штаммов: P. aeruginosa АТСС 10145, P. aeruginosa АТСС 27853, P. aeruginosa 14010, P.aeruginosa 453, P. aeruginosa АТСС 27/99, P. aeruginosa 9027. В качестве микробов-ассоциантов для определения ингибирующих свойств среды использовали Staphylococcus aureus FDA 209-P ATCC 6538-P, Proteus mirabilis 3177, Bacillus cereus ATCC 10702, Escherichia coli ATTC 25922, Klebsiella pneumoniae 418, Serratia marcescens АТСС 13880.
[41]Готовили стандартную взвесь культуры каждого тест-штамма, соответствующую 10 единицам по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85 П, с использованием стерильного 0,9 % раствора натрия хлористого. Полученные взвеси культур псевдомонад десятикратными разведениями (4,5 мл 0,9 % раствора натрия хлорида с 0,5 мл микробной взвеси) доводили до разведения 10-7, для ассоциантов до - 10-4.
[42]Для определения ростовых свойств засев производили по 0,1 мл микробной взвеси каждого тест-штамма псевдомонад из разведений 10-7 (для определения ингибирующих свойств тест-штаммы S. aureus FDA 209-P ATCC 6538-P, P. mirabilis 3177, B. cereus ATCC 10702, E.coli ATTC 25922 из разведений 10-4) соответственно на две чашки Петри с предлагаемой питательной средой Блеск и стерильным шпателем распределяли взвесь по поверхности среды. Через 48 ч инкубации посевов при температуре (37±1)°С визуально учитывали наличие и характер роста тест-штаммов.
[43]В качестве контрольной среды использовали Среду Блеск лабораторного приготовления следующего состава: - мясо-пептонный агар (МПА) 100 мл с добавлением: 8,0 мл 10 %-ного раствора ТТХ, 0,3 г L-аргинина и 10 мл стерильного снятого (обезжиренного) молока в соответствии с прописью, указанной в ГОСТ 34786-2021.
[44]Результаты биологического контроля предлагаемой питательной среды для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa, модифицированной (Среда Блеск) в сравнении со средой Блеск лабораторного приготовления на наборе тест-штаммов представлены в таблице 1.
[45]Пример 2. Среду готовят в соответствии с примером 1. Берут навески сухой компоненты в следующем количественном соотношении г/л:
[46]| Панкреатический гидролизат казеина с твином, модифицированный (ПГК-ТВмод) | 10,1 |
| Пептон ферментативный | 10,0 |
| Натрий хлористый | 4,0 |
| L-аргинин | 1,5 |
| Агар бактериологический | 10,0 |
[47]Результаты биологического контроля, представленные в таблице 1, аналогичны результатам проверки по примеру 1.
[48]Пример 3. Среду готовят в соответствии с примером 1. Берут навески сухой компоненты в следующем количественном соотношении г/л:
[49]| Панкреатический гидролизат казеина с твином модифицированный (ПГК-ТВ мод) | 12,1 |
| Пептон ферментативный | 12,0 |
| Натрий хлористый | 5,0 |
| L-аргинин | 2,0 |
| Агар бактериологический | 12,0 |
| Вода дистиллированная | 1,0 л |
[50]Результаты биологического контроля, представленным в таблице 1, аналогичны результатам проверки по примеру 1.
[51]Пример 4. Среду готовят в соответствии с примером 1.
[52]| Панкреатический гидролизат казеина с твином модифицированный (ПГК-ТВ мод) | 6,1 |
| Пептон ферментативный | 6,0 |
| Натрий хлористый | 2,0 |
| L-аргинин | 0,5 |
| Агар бактериологический | 6,0 |
| Вода дистиллированная | 1,0 л |
[53]Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды в примере 4 ведет к ухудшению специфической активности, проявляющейся в отсутствии золотистого блеска, являющегося диагностическим признаком на этой среде.
[54]Результаты биологического контроля представлены в таблице 1.
[55]Пример 5. Среду готовят в соответствии с примером 1.
[56]| Панкреатический гидролизат казеина с твином модифицированный (ПГК-ТВ мод) | 14,1 |
| Пептон ферментативный | 14,0 |
| Натрий хлористый | 6,0 |
| L-аргинин | 2,5 |
| Агар бактериологический | 14,0 |
| Вода дистиллированная | 1,0 л |
[57]Результаты биологического контроля представлены в таблице 1.
[58]Нарушение количественного соотношения ингредиентов среды в большую сторону на примере 5 увеличивает селективность среды, что также негативно сказывается на специфической активности, проявляющейся в формировании колоний неспецифической морфологии (плотные, мелкие с отсутствием золотистого блеска колоний некоторых штаммах).
[59]Из таблицы видно, что предлагаемая питательная среда для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa, модифицированная (Среда Блеск) в соответствии с примерами 1, 2, 3 обладает хорошими ростовыми свойствами, эффективна для выявления псевдомонад и подавляет рост ряда грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов.
[60]Учет результатов по окончании срока инкубации посевов и их идентификации по способности образовывать на среде Блеск колонии темно-красного цвета с золотистым блеском показал высокую чувствительность и дифференциацию пигментообразующих и не образующих пигмента микроорганизмов P. aeruginosa.
[61]Изменение количественного соотношения компонентов среды ведет к нарушению биологических показателей качества предложенной среды.
[62]Так, в случае приготовления среды в соответствии с примерами 4, 5 наблюдается снижение специфической активности и изменение ингибирующей способности среды:
[63]- при концентрации компонентов ниже минимальных пределов наблюдалось отсутствие золотистого блеска;
[64]- при концентрации компонентов выше максимальных пределов значительно повышаются ингибирующие свойства среды, вследствие чего ухудшается морфология псевдомонад.
[65]Таким образом, разработана отечественная питательная среда для селективного выделения Pseudomonas aeruginosa, модифицированная (Среда Блеск)
[66]Преимуществом предлагаемой среды, является:
[67]- Оптимизированный состав среды Блеск благодаря разработанному ПГК с Твином с заданными параметрами;
[68]- Высокая чувствительность: (обеспечивает рост псевдомонад из разведения 10-7)
[69]- Дифференцирующие свойства среды (феназин-отрицательные клоны P. aeruginosa образуют на среде колонии без золотистого блеска);
[70]- Высокие ингибирующие свойства разработанной среды подтверждаются отсутствием роста клебсиелл, серраций, энтеробактерий и других ТТХ-резистентных штаммов.
[71]- Нет необходимости ex tempore вносить L-аргинин
[72]- Уменьшенное количество вносимого L-аргинина позволяет снизить стоимость предлагаемой питательной среды.
