Способ получения готовой лекарственной формы пробиотического средства на основе штаммов Bifidobacterium longum subsp. longum и Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения готовой лекарственной формы пробиотического средства на основе штаммов бактерий Bifidobacterium longum subsp. longum VKM B-3717D и Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei VKM B-3711D, включающий культивирование в течение 48 ч бактерий при 37°С в анаэробных условиях в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси 80%N₂, 10% СО₂, 10%Н₂; затем в анаэробных условиях готовят защитную среду, состоящую из 1 части стокового раствора, приготовленного в анаэробных условиях из расчета 0,05 мг лакто-N-биозы (C₁₄H₂₅NO₁₁) или N-ацетилглюкозамина на 100 мл в обезжиренном молоке, и 1 части стерильного обезжиренного молока или сахарозно-желатиновой среды; разливают в емкости - пенициллиновые флаконы или ампулы; в каждую емкость стерильным одноразовым тампоном-зондом из вискозы снимают с каждой чашки Петри с поверхности агара видимый рост бактерий, емкости помещают в асептические герметичные контейнеры, затем замораживают и лиофильно высушивают в заданном режиме. После высушивания содержимое каждой емкости гомогенизируют, добавляют 30 мг хитозана, 50 мг сахарозы и 70 мг лактозы на 1 терапевтическую дозу препарата, включающую от 7×10⁷ до 8×10⁷ КОЕ каждого используемого бактериального штамма, заменяют ватные пробки на резиновые; затем флаконы закупоривают металлической крышкой; если готовая лекарственная форма пробиотического средства сушилась в ампулах, то ампулы запаивают, или расфасовывают в кишечнорастворимые капсулы из расчета 1 терапевтическая доза на 1 капсулу №3. Изобретение обеспечивает стабильность титра бактериальных штаммов в составе лекарственного средства не менее трехлетнего периода хранения в лиофилизированной форме. 4 табл., 4 пр.

Способ получения готовой лекарственной формы пробиотического средства на основе штаммов бактерий Bifidobacterium longum subsp. longum VKM B-3717D и Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei VKM B-3711D, депонированных во Всероссийской коллекции микроорганизмов, заключается в том, что указанные бактерии культивируют при температуре 37°С в течение 48 ч в анаэробных условиях в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси 80%N₂, 10% СО₂, 10%Н₂, причем Bifidobacterium longum subsp. longum VKM B-3717D выращивают на плотном агаре для бифидобактерий в количестве 2 чашек Петри, a Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei VKM B-3711D культивируют на плотной среде MRS в количестве 2 чашек Петри, затем в анаэробных условиях готовят готовую защитную среду, состоящую из соотношения 1 части стокового раствора, приготовленного предварительно в анаэробных условиях из расчета 0,05 мг лакто-N-биозы (C₁₄H₂₅NO₁₁) или N-ацетилглюкозамина на 100 мл в обезжиренном молоке и 1 части стерильного обезжиренного молока или сахарозно-желатиновой среды, затем подготовленную защитную среду разливают в емкости пенициллиновые флаконы или ампулы, при этом в каждую емкость стерильным одноразовым тампоном-зондом из вискозы снимают с каждой чашки Петри с поверхности агара видимый рост бактерий, затем тампон-зонд помещают в емкость со защитной средой, интенсивно суспендируют и вынимают, отжав о внутреннюю стенку пробирки, затем емкости закрывают стерильной негигроскопической ватной пробкой, удаляют лишние волокна ваты, или верхнюю часть пробок обжигают, или обрезают ножницами, затем помещают емкости в асептические герметичные контейнеры, и далее помещают в низкотемпературный морозильник на минус 70°С на 16 ч, затем вынимают и помещают в предварительно охлажденную до минус 50 градусов Цельсия лиофильную сушку, затем сразу в течение 60 мин проводят вакуумирование камеры лиофильной сушки до 20000 Па (0,02 бар) с последующим нагревом полок лиофильной сушки до минус 15 градусов Цельсия со скоростью 30 градусов в час и продолжают нагрев полок до плюс 30 градусов Цельсия со скоростью 3 градусов в час, по достижению температуры лиофильную сушку оставляют до полного высушивания содержимого емкостей в течении 48 ч, после высушивания емкости достают из лиофильной сушки и в ламинарном боксе гомогенизируют содержимое каждой емкости, добавляют навески 30 мг хитозана, 50 мг сахарозы и 70 мг лактозы на 1 терапевтическую дозу препарата, которая включает от 7×10⁷ до 8×10⁷ КОЕ каждого используемого бактериального штамма, заменяют ватные пробки на резиновые, затем флаконы закупоривают металлической крышкой, а если готовая лекарственная форма пробиотического средства сушилась в ампулах, то ампулы запаивают, или полученную готовую лекарственную форму пробиотического средства на основе штаммов бактерий Bifidobacterium longum subsp. longum VKM B-3717D и Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei VKM B-3711D расфасовывают в кишечнорастворимые капсулы из расчета 1 терапевтическая доза на 1 капсулу №3.

Изобретение относится к биотехнологии и медицинской микробиологии, в частности к способам производства пробиотических средств, которые могут быть использованы для терапии и профилактики патологических состояний, возникающих на фоне нарушения регуляции взаимодействий оси «кишечник-мозг». Штаммы Bifidobacterium longum subsp. longum 202_21 и Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei 29n_21 депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационными номерами VKM B-3717D и VKM B-3711D соответственно.

Уровень техники

За рубежом широко используют препараты-пробиотики на основе штаммов лактобакто и бифидобактерий: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus fermentum и Lactobacillus lactis в разных комбинациях (Патент США №6827953; патент Великобритании №883424; патент Великобритании №930107; патент США №5866385). Однако пробиотические и пребиотические препараты зарубежных разработчиков ориентированы на создание лечебно-профилактических препаратов и БАДов в сухой форме (таблетки, капсулы) имеющие существенные недостатки: малые сроки хранения указанных препаратов, неудовлетворительные органолептические свойства.

Известен патент №2346036, описывающий пробиотик на основе штамма Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116 для предупреждения или лечения нервно-мышечных нарушений кишечника, обусловленных инфекциями кишечника патогенами, для предупреждения или лечения кишечных осложнений после инфекции кишечника патогенами. Пробиотик включает мертвые бактерии, ферментационный субстрат и/или полученный из Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116 материал. Это обеспечивает достижение благотворных эффектов за счет способности действовать непосредственно на сократительную способность мышц.

Известен патент №2376366, описывающий консорциум штаммов лактобактерий и способ получения на его основе биологически активной добавки или закваски для производства кисломолочных продуктов. Консорциум штаммов лактобактерий содержит Lactobacillus acidophilus ВКПМ В 5863, Lactobacillus acidophilus ВКПМ В 4108, Lactobacillus plantarum В 3962, Lactobacillus plantarum ВКПМ В 5002, Lactobacillus casei ВКПМ В 5724 и Lactobacillus casei ВКПМ В 3960 в соотношении 1:1:1:1:4:4. Способ включает подготовку молочной питательной среды, ее стерилизацию и охлаждение до температуры заквашивания и внесение в молочную питательную среду посевной дозы вышеобозначенного консорциума штаммов лактобактерий в количестве не более 5,0 мас. %, сквашивание продукта в течение времени, достаточного для формирования сгустка, и охлаждение готового продукта при температуре не выше +6°С. В качестве молочной питательной среды используют следующие компоненты, мас. %: глюкоза 1,5-2,5, натрий лимоннокислый 0,15-0,25, обезжиренное молоко, нормализованное по сухому остатку СОМО 13,5-15% - остальное, что обеспечивает повышение сроков хранения и начального титра консорциума лактобактерий в приготавливаемых препаратах, а также более высокий начальный титр готового продукта.

Технический результат заявляемого способа позволяет сохранить начальную концентрацию титра каждого штамма в составе получаемого лекарственного средства с минимальными потерями при лиофилизации, а именно не менее 7×10⁷ - 7×10⁷ КОЕ в 1 терапевтической дозе лекарственного средства, а также в полной мере сохранить биологические свойства штаммов микроорганизмов в процессе получения готовой лекарственной формы, стабильность титра бактериальных штаммов не менее трех-летнего периода хранения в лиофилизированной форме при температуре (4-8)°С.

Указанный технический результат достигается тем, что новые штаммы бактерий Bifidobacterium longum subsp. longum VKM B-3717D и Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei VKM B-3711D, депонированных во Всероссийской коллекции микроорганизмов, заключается в том, что указанные бактерии культивируют при температуре 37°С в течение 48 часов в анаэробных условиях в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси 80%N₂, 10% СО₂, 10%Н₂, причем Bifidobacterium longum subsp. longum VKM B-3717D выращивают на плотном агаре для бифидобактерий в количестве 2 чашек Петри, a Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei VKM B-3711D культивируют на плотной среде MRS в количестве 2 чашек Петри, затем в анаэробных условиях готовят готовую защитную среду, состоящую из соотношения 1 части стокового раствора, приготовленного предварительно в анаэробных условиях из расчета 0,05 мг лакто-N-биозы (C₁₄H₂₅NO₁₁) или N-ацетилглюкозамина на 100 мл 20% обезжиренного молока и 1 части 20% стерильного обезжиренного молока, затем подготовленную защитную среду разливают в емкости, например, пенициллиновые флаконы или ампулы, и, в каждую емкость стерильным одноразовым тампоном-зондом из вискозы снимают с каждой чашки Петри с поверхности агара видимый рост бактерий, затем тампон-зонд помещают в емкость со защитной средой, интенсивно суспендируют и вынимают, отжав о внутреннюю стенку пробирки, затем емкости закрывают стерильной негигроскопической ватной пробкой, удаляют лишние волокна ваты, например, верхнюю часть пробок обжигают или обрезают ножницами, затем помещают емкости в асептические герметичные контейнеры, и далее помещают в низкотемпературный морозильник на минус 70°С на 16 часов, затем вынимают и помещают в предварительно охлажденную до минус 50 градусов цельсия лиофильную сушку, затем сразу в течение 60 минут проводят вакуумирование камеры лиофильной сушки до 20000 Па (0,02 бар) с последующим нагревом полок лиофильной сушки до минус 15 градусов цельсия со скоростью 30 градусов в час и продолжают нагрев полок до плюс 30 градусов цельсия со скоростью 3 градусов в час, по достижению температуры лиофильную сушку оставляют до полного высушивания содержимого емкостей в течении 48 часов, после высушивания емкости достают из лиофильной сушки и в ламинарном боксе гомогенизируют содержимое каждой емкости.

Для повышения эффективности и стабильности лекарственного средства в состав готовой лекарственной формы вводят добавки в виде стерильных навесок хитозана, сахарозы и лактозы, а именно 30 мг хитозана, 50 мг сахарозы и 70 мг лактозы на 1 терапевтическую дозу препарата.

Для обеспечения устойчивости готовой лекарственной формы в среде желудка лиофилизаты микроорганизмов или их комплекс с добавками хитозана, сахарозы и лактозы расфасовывают в кишечнорастворимые капсулы таким образом, чтобы 1 терапевтическая доза содержалась в 1 капсуле.

Пробиологические эффекты новых штаммов, используемых для создания готовой лекарственной формы, обеспечивают возможность создать лекарственные средства, оказывающие благоприятное действие не только на состав микробиоты кишечника, но и на эмоциональное состояние человека. Это позволит снизить расходы на терапию антидепрессантами, транквилизаторами, нейролептиками и другими дорогостоящими препаратами, а также позволит избежать развития побочные эффектов, вызываемых препаратами указанных групп.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1.

Проведены исследования по раздельному культивированию штаммов бактерий Bifidobacterium longum subsp. longum VKM B-3717D и Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei VKM B-3711D, затем помещению биомассы каждого из штамма бактерий в 1 мл 20% стерильного обезжиренного молока штаммов бактерий в титре 10⁸ КОЕ/мл каждого. Затем к 1 мл добавляли 1 мл стокового раствора 100-кратного раствора лакто-N-биозы или N-ацетилглюкозамина и лиофилизировали. Результаты содержания КОЕ бактерий после лиофилизации в 1 мл готового жидкого препарата (суспензии лиофилизата в физиологичеком растворе) указаны в таблице 1.

Таким образом экспериментально было доказано, что такая рецептура не подходит для реализации способа получения готовой лекарственной формы пробиотического препарата, так как титр каждого микроорганизма не соответствовал заявленным требованиям.

Пример 2.

Проведены исследования по раздельной лиофилизации микроорганизмов Bifidobacterium longum subsp. longum VKM B-3717D и Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei VKM B-3711D в 1 мл стокового раствора 100-кратного раствора лакто-N-биозы из расчета 0,05 мг на 100 мл для штамма Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei VKM B-3711D и в 1 мл 20% стерильного обезжиренного молока штамма бактерий Bifidobacterium longum subsp. longum VKM B-3717D. Результаты содержания КОЕ бактерий после лиофилизации в 1 мл готовых жидких препаратов (суспензий лиофилизатов в физиологичеком растворе) указаны в таблице 2.

Таким образом экспериментально было доказано, что такая рецептура подходит для реализации способа получения готовой лекарственной формы пробиотического средства на основе штаммов Bifidobacterium longum subsp. longum VKM B-3717D и Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei VKM B-3711D, так как титр микроорганизмов после лиофилизации не снижается.

Пример 3.

Проведены исследования по культивированию в анаэробных условиях в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси 80%N2, 10% CO2, 10%Н2 бактериальных культур Bifidobacterium longum subsp. longum VKM B-3717D на плотном агаре для культивирования бифидобактерий и Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei VKM B-3711D на плотной среде MRS при температуре 37°С в течении 48 часов и в приготовлении в анаэробных условиях готовой защитной среды, состоящей из предварительно приготовленного в анаэробных условиях стокового 100-кратного раствора лакто-N-биозы из расчета 0,05 мг на 100 мл в 20%>обезжиренном молоке, который смешивали в концентрации 1:1 с 20% стерильным обезжиренным молоком.

Готовую защитную среду разливали по 2 мл в пенициллиновые флаконы, затем в каждый флакон снимали тупфером с поверхности агара все выросшие на поверхности плотных питательных сред колонии микроорганизмов обоих штаммов. Затем флаконы закрывали стерильной негигроскопической ватной пробкой на глубину приблизительно 1,3 см ниже края флакона и обрезали ножницами, убирая лишние волокна ваты, и затем флаконы помещали в низкотемпературный морозильник на минус 70°С на 16-18 часов. Через 18 часов флаконы вынимали и быстро помещали в подготовленную охлажденную лиофильную сушку до полного высушивания в течении 48 часов. Затем флаконы доставали из лиофильной сушки проверяли титр каждого лиофилизированного штамма Bifidobacterium longum subsp. longum VKM B-3717D и Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei VKM B-3711D. Результаты содержания КОЕ бактерий после лиофилизации в 1 мл готового жидкого препарата (суспензии лиофилизата в физиологичеком растворе) указаны в таблице 3.

Таким образом экспериментально было доказано, что такая рецептура позволяет реализовать заявленный способ получения готовой лекарственной формы пробиотического препарата для перорального введения на основе штаммов Bifidobacterium longum subsp. longum VKM B-3717D и Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei VKM B-3711D, так как титр штаммов после лиофилизации сохраняется.

Пример 4.

Для подготовки стабилизатора пробиотических культур выполняли следующее. Готовили 20% обезжиренное молоко путем центрифугирования при 3500 об/мин цельного молока в течение 40 минут, затем образовавшийся плотный слой удаляли и автоклавировали обезжиренное молоко при 117°С в течение 15 минут. Готовый стабилизатор распределяли по флаконам объемом 10-20 мл по 2 мл во флакон.

Микроорганизмы готовили к лиофилизации следующим образом. В анаэробных условиях производили высев штаммов микроорганизмов Bifidobacterium longum subsp. longum VKM B-3717D и Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei VKM B-3711D на плотные питательные среды. Чашки с посевами инкубировали в течение 48 часов при температуре 37°С. Далее микроорганизмы вносили во флаконы с подготовленным стабилизатором из расчета 10⁸-10⁹ КОЕ/мл. Флаконы закрывали стерильной негигроскопической ватной пробкой и вортексировали.

Готовые для лиофилизации флаконы с микробными культурами и стабилизатором помещали в морозильные камеры на минус (70±10)°С на 16-20 часов и доставали непосредственно перед процедурой лиофилизации. Флаконы помещали в камеру лиофильной сушки, предварительно охлажденную до минус 50°С. Общая продолжительность цикла лиофилизации составляла около 48 часов. После высушивания флаконы герметизировали в стерильных условиях и помещали в холодильник для хранения при температуре от 4 до 6°С.

Лиофилизированную культуру проверяли на жизнеспособность и чистоту. В анаэробных условиях лиофилизат переводили в суспензию сразу после вскрытия флакона, добавляя к нему 1 мл питательного бульона, и высевали на твердые питательные среды. Чашки с посевами инкубировали при температуре (37±1)°С не менее 48 часов. Результаты представлены в таблице 4.

Таким образом экспериментально было доказано, что предлагаемый стабилизатор подходит для реализации способа получения готовой лекарственной формы пробиотического средства на основе штаммов Bifidobacterium longum subsp. longum VKM B-3717D и Lacticaseibacillus paracasei subsp. paracasei VKM B-3711D, так как титр микроорганизмов после лиофилизации и хранения лиофилизатов микроорганизмов не снижается.