[2]Настоящее изобретение относится к области фармацевтики, биологически активных веществ и составам, содержащим пробиотики. Предложен состав, содержащий лактобактерии, в жидкой форме, обладающий пролонгированным сроком хранения. Также предложен способ получения такого состава и его применение в качестве биологически активной добавки.
[3]Предшествующий уровень техники
[4]В настоящее время достаточно распространены препараты или биологически активные добавки, содержащие лактобактерии. Как правило, данные препараты используются для нормализации микрофлоры кишечника, например, во время или после приема антибиотиков, снижения проявлений аллергии в виде дерматитов или акне. В состав таких препаратов могут входить бактерии видов Lactobacillus, например, Lactobacteruim acidophilus, fermentum, casei, или Bifidobacterium bifidum, longum, breve и др.
[5]Наиболее распространены в виде препаратов с пробитическим действием составы, содержащие различные виды Lactobacillus. Они применяются как биологически активная добавка (БАД) с пищевыми свойствами. Известен препарат «Лактобактерин», содержащий биомассу живых бактерий антагонистически активного штамма лактобактерий (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fermentum), лиофилизированную в среде культивирования с добавлением защитной среды высушивания (сахарозо-желатино- молочной). «Лактобактерин» принимает вовнутрь и местно, показания включают множество заболеваний или состояний, включая заболевания ЖКТ, женских половых органов, применение при комплексной терапии заболеваний инфекционной и неинфекционной этиологии, в т.ч. у детей. Следует отдельно отметить, что данный препарат выпускается в виде лиофилизата, и его хранить в разведенном не допускается. Лиофилизат разводят водой in situ, непосредственно перед применением.
[6]К препаратам аналогичного действия можно отнести ряд препаратов: Лактонорм, Нормофлорин-Л, Лактожиналь, Ацилакт Форте, Экофемин, Ацилакт Дуо, Ацилакт и другие. Данные препараты содержат, как правило, один из видов лактобактерий и выпускаются в виде лиофилизата, капсул, или концентрата.
[7]К недостаткам данных препаратов можно отнести: ограниченный срок годности в жидкой форме, необходимость приготовления перед применением или короткий срок хранения препарата.
[8]Настоящее изобретение заключается в создании состава, содержащего лактобактерии, в жидкой форме, без необходимости разведения, а также с длительным сроком хранения, в том числе после вскрытия флакона или после разморозки. Жидкий состав согласно изобретению также можно использовать как для расширения арсенала средств, в случае, например, если средства в другом виде плохо переносятся пациентом или не являются удобными ему.
[9]Все это повышает комплаентность, т.е. приверженность пациенту к лечению и способствует более быстрому выздоровлению и нормализации функции кишечника.
[10]Краткое описание изобретения
[11]Предложен состав в жидкой форме, обладающий пробиотическими свойствами, включающий
[12]- комплекс лактобактерий видов Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6, вырабатываемый путем культивирования в питательной среде, включающей гидролизат коллагена пищевой - 0,010-0,015%
[14]При этом, состав содержит комплекс лактобактерий видов Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6 и получен путем смешивания штаммов лактобактерий в равных пропорциях. В другом варианте реализации, комплекс лактобактерий включает штаммы в следующих соотношениях:
[15]Lactobacillus plantarum 8P-A3 - 3,4* 108 КОЕ в 1 см3, Lactobacillus fermentum 90Tс4 (pLFAp5) - 4 - 4,5* 108 КОЕ в 1 см3, Lactobacillus casei - 3,4* 108 КОЕ в 1 см3.
[16]Кроме того, в указанном составе в качестве лактобактерий могут быть использованы штаммы: Lactobacillus plantarum 8P-A3 - штамм из коллекции ВКПМ В -11007, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5 -штамм из коллекции ВКПМ В - 7582, Lactobacillus casei С6 -штамм из коллекции ВКПМ В- 5724. Для получения состава используется гидролизат коллагена пищевой, например, гидролизат коллагена пищевой «КоллАмин - 80».
[17]Состав согласно изобретению является готовой к употреблению в пищу формой, при этом концентрация лактобактерий может составлять до 109 живых клеток в 1 см3.
[18]Дополнительно, изобретение предлагает способ получения жидкого состава, содержащего лактобактерии, включающий стадии:
[19]- приготовление питательной среды для накопления биомассы лактобактерий, при этом питательная среда включает гидролизат коллагена пищевой;
[20]- внесение в питательную среду пробиотические культуры лактобактерий в среде углекислого газа;
[21]- внесение биомассы лактобактерий 2-ой генерации в питательную среду;
[22]- ферментация питательной среды с 3-ей генерацией штаммов лактобактерий;
[23]- получение состава в жидкой форме;
[24]- охлаждение состава до температуры +20°С;
[26]- доохлаждение до температуры (6±2)°С.
[27]При этом, согласно способу, в некоторых вариантах стадию внесения в питательную среду пробиотической культуры лактобактерий и стадию внесения биомассы лактобактерий 2-ой генерации проводят на каждом штамме отдельно. Также согласно способу, стадию ферментации питательной среды с 3-ей генерацией штаммов можно проводить на смеси штаммов лактобактерий, содержащей Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6 в равных пропорциях. В другом варианте реализации согласно способу получают жидкий состав, содержащий комплекс лактобактерий при следующих соотношениях:
[28]Lactobacillus plantarum 8P-A3 - 3,4* 108 КОЕ в 1 см3, Lactobacillus fermentum 90Tс4 (pLFAp5) - 4 - 4,5* 108 КОЕ в 1 см3, Lactobacillus casei - 3,4* 108 КОЕ в 1 см3.
[29]Кроме того, заявлено применение описанного состава, содержащего лактобактерии, по изобретению, для поддержании нормальной микрофлоры кишечника и в качестве биологически активной добавки.
[31]На Фиг. 1 представлена технологическая схема получения лиофилизата.
[32]Подробное описание изобретения
[33]Согласно изобретению, предложен состав в жидкой форме, обладающий пробиотическими свойствами, включающий комплекс лактобактерий видов
[34]Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6, вырабатываемый путем культивирования в питательной среде, включающей гидролизат коллагена пищевой -0,010-0,015 %
[36]Данный состав включает указанные 3 вида лактобактерий. Из предшествующего уровня техники известно, что лактобактерии видов Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6 являются пробиотическими, т.е. способствуют нормализации функции кишечника и поддержанию его нормальной микрофлоры. Как правило, в препаратах -пробиотиках используется один вид бактерий, т.к. смешивание видов может вызывать гибель одного и доминирование другого вида в смеси. Кроме того, технологически достаточно сложно и трудоемко культивировать несколько видов одновременно на одной питательной среде, а смешение в конечном продукте также может приводить к гибели одного из видов. Таким образом, смешивание пробиотических культур друг с другом может быть нецелесообразным.
[37]В составе согласно изобретению используется 3 вида лактобактерий: комплекс лактобактерий видов Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6, при этом комплекс получен путем смешивания штаммов лактобактерий в равных пропорциях. Также возможно получение состава со следующим содержанием шатммов лактобактерий:
[38]Lactobacillus plantarum 8P-A3 - 3,4* 108 КОЕ в 1 см3, Lactobacillus fermentum 90Tс4 (pLFAp5) - 4 - 4,5* 108 КОЕ в 1 см3, Lactobacillus casei - 3,4* 108 КОЕ в 1 см3. Согласно же способу получения состава по изобретению, данный комплекс получают путем одновременного культивирования, в едином пространстве на одной среде. Также, помимо использования самих видов лактобактерий могут быть использованы их отдельные штаммы, обладающие оптимальными свойствами. Так, в указанном составе в качестве лактобактерий могут быть использованы штаммы: Lactobacillus plantarum 8P-A3 - штамм из коллекции ВКПМ В -11007, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5 -штамм из коллекции ВКПМ В - 7582, Lactobacillus casei С6 -штамм из коллекции ВКПМ В- 5724.
[39]Для повышения выхода и качества состава используется гидролизат коллагена пищевой, например, гидролизат коллагена пищевой «КоллАмин - 80». Данный гидролизат может иметь состав: гидрализат коллагена (глицин, аланин, пролин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, аргинин, лейцин, серин, валин, треонин, изолейцин, оксипролин, лизин, фенилаланин, тирозин, таурин, цистеин, гистидин, метионин, орнитин, оксилизин, триптофан), цифрол-5 (супероксиддисмутаза, гесперидин, аскорбиновая кислота, экстракт гибискуса сухой, витамин Е, дигидрокверцетин, бета-каротин, коэнзим Q10), фруктоза кристаллическая, диоксид кремния (согласно № RU.77.99.11.003.Е.045816.09.11).
[40]Получаемый состав согласно изобретению является готовой к употреблению в пищу формой, например, принимаемой перед едой. Концентрация лактобактерий может составлять до 108-109 живых клеток в 1 см3, т.е. минимальное содержание живых клеток лактобактерий составляет 108 в 1 см3.
[41]Согласно изобретению, способ получения жидкого состава, содержащего лактобактерии, включает стадии:
[42]- приготовление питательной среды для накопления биомассы лактобактерий, при этом питательная среда включает гидролизат коллагена пищевой;
[43]- внесение в питательную среду пробиотические культуры лактобактерий в среде углекислого газа;
[44]- внесение биомассы лактобактерий 2-ой генерации в питательную среду;
[45]- ферментация питательной среды с 3-ей генерацией штаммов лактобактерий;
[46]- получение состава в жидкой форме;
[47]- охлаждение состава до температуры +20°С;
[49]- доохлаждение до температуры (6±2)°С.
[50]Стадию по получению питательной среды, в частности, с использованием гидролизата коллагена пищевого, проводят в отдельных ампулах или флаконах, и далее, в них вносят культуры лактобактерий и культивируют отдельно друг от друга. Внесение во флакон со средой проводят в среде углекислого газа, в асептических условиях, что также позволяет добиться существенного увеличения сроков хранения (годности) пробиотиков.
[51]Способ производства пробиотических продуктов в асептических условиях имеет значительные по сравнению с другими преимущества, так как позволяет получать стойкие при хранении продукты, в которых сохраняются живые клетки культур достаточно длительное время. Применение комбинации соответствующих условий позволяет избежать эффекта медленного сквашивания, а в некоторых случаях в полном прекращении сквашивания. Этот эффект возникает в питательных средах, содержащих ионы кальция и коллаген. При этом, как правило, причина данного явления заключается в контаминации культуры фагом, который вызывает лизис только определенных видов бактерий, но диапазон его действия широк - он может поражать большое количество штаммов. Одноштаммовая закваска (культура) легче поражается фагом и теряет свою активность. Это послужило основанием для замены одноштаммовой культуры лактобактерий многоштаммовой или смешанной. Процесс лизиса бактериофагом чувствительных штаммов в смешанной культуре (закваске) представляет собой сложный биологический процесс. Как было установлено, культивирование и перенос культуры на питательную среду в среде углекислого газа в асептических условиях позволяет снизить контаминацию бактериофагом и повысить срок хранения жидкого препарата.
[52]Применение углекислого газа в сочетании с асептическими условиями на стадиях внесения в питательную среду пробиотических культур лактобактерий, внесения биомассы лактобактерий 2-ой генерации в питательную среду, а также ферментации питательной среды с 3-ей генерацией штаммов лактобактерий позволяет добиться длительного срока хранения жидкого состава как в закрытом виде, так и после вскрытия флакона, после разморозки в случае замораживания.
[53]При этом, согласно способу, в некоторых вариантах стадию внесения в питательную среду пробиотической культуры лактобактерий и стадию внесения биомассы лактобактерий 2-ой генерации проводят на каждом штамме отдельно. Также согласно способу, стадию ферментации питательной среды с 3-ей генерацией штаммов можно проводить на смеси штаммов лактобактерий, содержащей Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6 в равных пропорциях или при соотношениях Lactobacillus plantarum 8P-A3 - 3,4* 108 КОЕ в 1 см3, Lactobacillus fermentum 90Tс4 (pLFAp5) - 4 - 4,5* 108 КОЕ в 1 см3, Lactobacillus casei - 3,4* 108 КОЕ в 1 см3. Использование углекислого газа при внесении позволяет культивировать несколько штаммов одновременно.
[54]Также, согласно изобретению, можно применять данный состав для восстановления и поддержания микрофлоры кишечника и желудочно-кишечного тракта в целом, и в качестве вспомогательного средства для предотвращения дисбактериоза, в том числе во время и после принятия антибиотиков, и устранения тяжести, вздутия в животе (метеоризма), расстройства стула (диареи), тошноты, рвоты, отрыжки. В связи с тем, что было показано, что именно лактобактерии кишечной микрофлоры влияют на иммунитет, то в случае поддержания нормальной микрофлоры кишечника можно использовать состав, содержащий лактобактерии, согласно изобретению, в случае, если пациенту необходима выработка собственного интерферона и укрепление иммунитета, например, во время сезонных обострений простудных заболеваний. Также лактобактерии применяют для улучшения перистальтики пищевода, желудка, кишечника, снятия кишечных спазмов и непроходимости, в качестве профилактики «диареи путешественника», а также в качестве средства для снижения симптомов диареи неинфекционной природы.
[57]Получение комплекса лактобактерий
[58]Питательной средой для накопления биомассы лактобактерий являлось «Гидролизат коллагена пищевой «КоллАмин» ферментативный сухой, используемый в пищевой промышленности в качестве источника аминокислот при производстве специализированных пищевых продуктов и биологических активных добавок к пище. Данный гидролизат коммерчески доступен под торговым наименованием «КоллАмин 80».
[59]К 20,0±0,5 г питательной среды добавляли 3,5±0,5 г хлористого натрия, 10‚0±0,5 г лактозы, 0,75±0,05 г агар-агара и дистиллированной воды до 1 л. Допускается использование других питательных сред, которые использовали для культивирования лактобактерий.
[60]Приготовленную питательную среду разливали в стерильные флаконы емкостью 80-150 мл и затем стерилизовали в автоклаве при температуре (112±2)°С и избыточном давлении 0,5 кгс/см в течение 30±2 минут. После охлаждения до +37°С -38°С питательную среду использовали для выращивания чистой культуры лактобактерий, рН готовой питательной среды - 7,1±0,2.
[61]Приготовление культуры лактобактерий.
[63]Для приготовления культуры, стерильной пипеткой вносили в асептических условиях в ампулу 1,5-2,0 мл стерильной питательной среды. Содержимое ампулы переносили в две пробирки (или флакона) со стерильной питательной средой, разлитой по 30 мл и хорошо перемешивали. Ампулы выдерживали в термостате, при температуре (37-38)°С, до получения биомассы с содержанием не менее 108 в 1 мл лактобактерий. Использовали лактобактерии типов: Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6, при этом их культивировали отдельно друг от друга.
[65]Выросшую культуру каждого из штаммов 1 генерации объёмом (3,5-5) % вносили в питательную среду и культивировали в термостате при температуре (37-38) °С до получения биомассы с содержанием микробных тел не менее 108 в 1 мл.
[66]1 и 2 генерацию проводили в специальном боксе.
[67]Стадию ферментации и 3 генерации проводили в ферментерах с питательной средой. В стерильные ферментёры объемом 36 л. и более, с углекислым газом подавали стерильную питательную среду, охлажденную до температуры (37-38)°С, с последующим внесением культуры лактобактерий второй генерации каждого штамма по отдельности в ферментеры №1, №2, №3. Объёмная доля внесения культуры лактобактерий по отношению к питательной среде составляла 10%. Культивирование биомассы лактобактерий в ферментерах производили в атмосфере газа СО2. Содержимое ферментеров перемешивали встроенной мешалкой. Выращивание лактобактерий проводили при температуре (37-38)°С в течение 24-48 часов, ферментеры термостатировали подачей в рубашку воды при температуре +37-38°С. Процесс считался завершенным при достижении показателя рН среды 3,9-4,3. Выращивание биомассы проводили до получения содержания лактобактерий в 1 мл не менее 108 - 109 живых клеток.
[68]Далее, по окончании процесса, выращенную биомассу в ферментере №1, №2, №3 смешивали в равных объёмах в общем ферментёре, получая симбиотический комплекс лактобактерий. Также, в одном из вариантов, получали комплекс лактобактерий, содержащий:
[69]Lactobacillus plantarum 8P-A3 - 3,4* 108 КОЕ в 1 см3, Lactobacillus fermentum 90Tс4 (pLFAp5) - 4 - 4,5* 108 КОЕ в 1 см3, Lactobacillus casei - 3,4* 108 КОЕ в 1 см3.
[70] Полученный комплекс перемешивали и охлаждали до температуры +20°С. Охлажденный состав из ферментёра направляли на фасовку.
[71]Приготовление и фасовку жидкого состава по изобретению проводили в помещении 3 класса чистоты, проводили упаковку и маркировку. Упакованную продукцию доохлаждали в холодильной камере до температуры (6±2)°С, после чего считалось, что финишный продукт получен и готов к реализации.
[72]Полученный состав включал Lactobacillus plantarum 8P-A3, Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5), Lactobacillus casei С6, вырабатываемый путем культивирования в питательной среде, включающей гидролизат коллагена пищевой - 0,10-0,015%, - вода - до 100%.
[73]Состав не содержал казеина, лактозу и глюкозу. В некоторых случаях для получения состава использовали следующие штаммы:
[74]Lactobacillus plantarum 8P-A3 (штамм из коллекции ВКПМ В -11007), Lactobacillus fermentum 90Tc4 (pLFAp5) (штамм из коллекции ВКПМ В - 7582), Lactobacillus casei С6 (штамм из коллекции ВКПМ В- 5724).
[75]Составы содержали штаммы в равных пропорциях или в указанных ниже соотношениях:
[76]Lactobacillus plantarum 8P-A3 - 3,4* 108 КОЕ,
[77]Lactobacillus fermentum 90Tс4 (pLFAp5) - 4 - 4,5* 108 КОЕ,
[78]Lactobacillus casei - 3,4* 108 КОЕ.
[79]Полученную продукцию контролировали по различным показателям: определение органолептических, физико-химических показателей качества и показателей безопасности.
[81]Исследование свойств состава по изобретению
[82]Полученный состав исследовали по различным показателям, результаты представлены в таблице ниже.
[83]| Таблица 1 |
| Наименование показателя | Характеристика и норма |
| Внешний вид и консистенция | Коллоидный раствор вязкой консистенции |
| Вкус и запах | Кислого вкуса со слабым специфическим запахом |
| Цвет | Золотисто-коричневый |
| Объем одного флакона, мл | 0,5 ± 10 % |
| Кислотность, Т°, не более | 180 |
| Концентрация водородных ионов (рН) | 3,9-4,3 |
| Концентрация живых клеток | не менее 108-109 клеток в 1 см3 |
[84]Все полученные составы соответствовали указанным выше показателям.
[86]Исследование срока годности
[87]Образцы полученной продукции хранили при температуре +2-+8°С в течение контрольного срока в 12 мес. Каждые месяц измеряли рН, кислотность и контролировали внешний вид, запах, цвет. Результаты представлены в таблице ниже, приведены данные за каждые 3 мес.
[88]| Таблица 2 |
| Наименование показателя | Характеристика и норма | 1 мес | 3 мес | 6 мес | 9 мес | 12 мес |
| Внешний вид и консистенция | Коллоидный раствор вязкой консистенции | + | + | + | + | + |
| Вкус и запах | Кислого вкуса со слабым специфическим запахом | + | + | + | + | + |
| Цвет | Золотисто-коричневый | + | + | + | + | + |
| Объем одного флакона, мл | 0,5 ± 10 % | + | + | + | + | + |
| Кислотность, Т°, не более | 180 | 125 | 138 | 155 | 160 | 173 |
| Концентрация водородных ионов (рН) | 3,9-4,3 | 4,2 | 4,2 | 4,0 | 3,9 | 3,9 |
[89]Также контролировали содержание 109 живых клеток в 1 см3 согласно ОФС.1.7.2.0008.15 «Определение концентрации микробных клеток», путем посева на питательную среду. Содержание составляло не менее 108-109 клеток в 1 см3, в том числе в ампулах после хранения в течение 12 мес.
[90]Вскрытые флаконы также проверяли на срок годности при хранении в течение 3 мес., при +2-+8°С. По истечении 3 мес. контролировали органолептические и иные показатели, приведенные в таблице ниже.
[91]| Таблица 3 |
| Наименование показателя | Показатели |
| Внешний вид и консистенция | Коллоидный раствор вязкой консистенции |
| Вкус и запах | Кислого вкуса со слабым специфическим запахом |
| Цвет | Золотисто-коричневый |
| Объем одного флакона, мл | 0,5 ± 10 % |
| Кислотность, Т°, не более 180 | 152 |
| Концентрация водородных ионов (рН) | 4,0 |
| Концентрация живых клеток | не менее 108 клеток в 1 см3 |
[92]Также флаконы проверяли на стойкость к замораживанию и размораживанию. После размораживания проверяли органолептические показатели и концентрацию живых клеток. После цикла замораживания и размораживания она составляла не менее 108 клеток в 1 см3.
[94]Применение состава для поддержания нормальной микрофлоры кишечника
[95]Состав является полностью пищевым и его можно применять детям и взрослым в виде однократного приема в сутки, курсом в течение 14-30 дней, например, в качестве биологически активной добавки.
[96]Состав применяли для нормализации функции кишечника при диарее неинфекционной природы у взрослых. Добровольцы были разделены на группы по 5 человек, при этом одной группе предложили принимать состав согласно изобретению, вторая группа принимала препарат «Лактобактерин». Обе группы принимали по 5 мл в день, за полчаса до еды. После 2 суток приема работа кишечника нормализовалась, симптомы диареи отсутствовали. Разницы по скорости выздоровления и количеству побочных эффектов между группа отмечено не было.
