[1]Изобретение относится к биомедицине, может применяться при тестировании физиотерапевтических вмешательств, проведении доклинических испытаний сокращая при этом использование животных. Изобретение может быть использовано в фундаментальных биологических и биомедицинских исследованиях, в том числе: при создании полупроницаемых мембран, содержащих в своем составе живые клетки и используемых для изучения проницаемости для различных растворенных веществ через полупроницаемые биологические мембраны, а также для изучения жизнеспособности клеток, включаемых в состав таких эквивалентов.
[2]Мембрана круглого окна (далее МКО) служит барьером между полостью среднего уха и улиткой и играет важную роль в механике среднего уха и улитки в нормальных и больных ушах (Paparella, 1983; Nordang, 2001). Мембрана круглого окна считается основным путем проникновения потенциально ототоксичных веществ из полости среднего уха во внутреннее ухо.
[3]У человека и большинства животных МКО состоит из трех слоев: наружного эпителия, обращенного к среднему уху, слоя соединительной ткани и внутреннего эпителия, примыкающего к внутреннему уху. Слой соединительной ткани содержит коллагеновые волокна, другие эластические волокна и фибробласты, все это обеспечивает основную структурную поддержку мембраны. Средняя толщина МКО человека составляет примерно 70-100 мкм (Goycoolea and Lundman, 1997).
[4]Известны способы создания модели МКО человека изолированные участки улитки уха с круглым окном некоторых модельных животных: МКО монгольской песчанки (Lundman LA, 1987); морской свинки (Gan RZ, 2013); шиншиллы (Keskin Yilmaz N.,2021); овцы (Han S., 2021). Способы заключаются в том, что у лабораторных животных, после их умертвления хирургическими методами изымают участки улитки уха вместе с МКО, которую впоследствии используют в качестве модели человеческой мембраны и проверяют на них способы доставки лекарственных средств через мембрану. Недостатком всех этих перечисленных способов является то, что в качестве модели берут убитую ткань животных и такая модель не будет соответствовать критерию жизнеспособности входящих в ее состав клеток. Так же, к недостаткам следует отнести тот факт, что ни одна из МКО животных не соответствует по своему строению МКО человека: они отличаются по толщине и плотности коллагеновой мембраны, например, МКО грызунов, таких как крыса, шиншилла, морская свинка, намного тоньше, чем у человека, средняя их толщина составляет 11,5 мкм.
[5]Известно устройство для проверки проницаемости разделительной мембраны круглого окна (CN 201373874 Y, S.J. Liu Ya, 2009), которое представляет собой устройство, состоящее из двух камер (подающей и принимающей) изготовленных из стекломатериалов и полистирола, между которыми специальным образом зажимается фрагмент биологической ткани, изъятой хирургическим путем у животных или у человека, и призванное собирать для анализа в принимающей камере прошедшие через ткань из подающей камеры растворы различных веществ. Недостатками устройства являются отсутствие возможности использовать его в испытаниях электрофизических установок, разрабатываемых для лечения заболеваний среднего уха, отсутствие в его конструкции биологической мембраны с заданными свойствами и с живыми клетками в своем составе, которую можно охарактеризовать после проведения эксперимента и выявлять в ее составе процент живых клеток.
[6]Задачей настоящего изобретения было создать эквивалент мембраны круглого окна, морфологически близкий к оригиналу мембраны круглого окна человека.
[7]Технический результат - создан живой эквивалент мембраны круглого окна (варианты), который соответствует человеческой мембране круглого окна по толщине клеточного слоя, структуре и проницаемости.
[8]Технический результат достигается тем, что в качестве матрицы-основы была использована коллагеновая мембрана с повышенными прочностными характеристиками коллагенового биоматериала. Для ее изготовления используют высокие концентрации коллагена, получая в результате стабильные и прочные коллагеновые мембраны. В основе подхода лежит запатентованная масштабируемая технология получения стерильного концентрированного раствора биосовместимого коллагена (коллаген Viscoll®). Данная мембрана не цитотоксична, что позволяет выращивать на ней живые клетки. Использованная в описываемом способе мембрана имеет толщину 100±20 мкм, что соответствует толщине нативной МКО человека. Это позволяет создавать модели, близкие по своим физическим и биологическим свойствам к нативным МКО человека.
[9]Технический результат достигается тем, что для воссоздания живого эпителиального барьера МКО использовали культивирование на поверхности мембраны эпителиальных клеток человека линии НаСаТ иммортализованные кератиноциты человека. Эпителиальные клетки имеют плотные контакты, как с базальной мембраной, так и между собой. Использование указанной линии эпителиальных клеток в качестве компонента эквивалента МКО позволяет не только получить структуру морфологически близкую к оригиналу, но еще обладает такими преимуществами, как легкодоступность, относительная дешевизна и простота в выращивании. Эта линия, несмотря на ее «бессмертность», сохранила все основные признаки нормального эпидермиса, способно образовывать эпителиальные пласты из клеток, соединенных плотными контактами, полную способность к дифференцировке и отсутствие канцерогенности.
[10]Также технический результат достигается тем, что были использованы стромальные клетки - фибробласты человека. Данные клетки играют поддерживающую роль в формировании эпителиальными клетками плотного эпителиального слоя на поверхности мембраны с плотными межклеточными контактами, препятствующими свободной диффузии через МКО растворенных лекарственный и токсических веществ. Кроме того, данные клетки активно секретируют элементы внеклеточного матрикса, обеспечивая гистотипический рост эпителия в составе разрабатываемой модели.
[11]Изобретение поясняется иллюстрациями.
[12]Фигура 1. Фибробласты человека после 3 суток культивирования на поверхности коллагеновой мембраны. Окраска - витальным флуоресцентным красителем кальцеином (CalceinAM, зеленое окрашивание).
[13]Фигура 2. Клетки человека (кератиноциты линии НаСаТ) после 3 суток культивирования на поверхности коллагеновой мембраны. Окраска - витальным флуоресцентным красителем кальцеином (CalceinAM, зеленое окрашивание).
[14]Фигура 3. Гистологический препарат, поперечный срез эквивалента МКО. Окраска гематоксилин-эозином. 1 - слой клеток, 2 - коллагеновая мембрана, 3 - 100 мкм.
[15]Фигура 4. Схема экспериментов по выявлению функциональной активности эквивалента МКО.
[16]А - вариант 1:4- уровень среды, 5 - вставка системы Transwell с мембраной, 6 - коллагеновая мембрана, 7 - клетки HaCat.
[17]Б - вариант 2: 4 - уровень среды, 5 - вставка системы Transwell с мембраной, 6 - коллагеновая мембрана, 7 - клетки HaCat, 8 - клетки фибробластов человека.
[18]Фигура 5. Схема эксперимента с пассивной диффузией дексаметазона через эквивалент МКО. 9 - лунка 96-луночного планшета.
[19]Фигура 6. Гистограмма, демонстрирующая остаточную концентрацию дексаметазона после прохождения через эквивалент МКО путем пассивной диффузии (мембрана - контроль без клеточного материала).
[20]Осуществление изобретения.
[21]Искусственный эквивалент мембраны круглого окна, который по толщине клеточного слоя, структуре и проницаемости соответствует мембране круглого окна человека, представляющий собой коллагеновую мембрану в виде диска диаметром 1,6±0,1 см и толщиной 100±20 мкм с живым эпителиальным слоем на ее поверхности, который образован или клетками - кератиноцитами человека линии НаСаТ (вариант 1), или клетками - кератиноцитами человека линии НаСаТ и стромальным компонентом - дермальными фибробластами человека (вариант 2).
[22]Эквивалент мембраны круглого окна получают следующим образом.
[23]Этап 1. Коллагеновую мембрану в форме диска диаметром 1,6±0,1 см и толщиной 100±20 мкм (Viscoll ИМТЕК, Россия или аналогичные по свойствам и составу) в условиях стерильного бокса помещают в лунки 6-ти луночного планшета (пр-во Costar или аналогичный). Мембраны заливают 2 мл питательной среды DMEM/F12 (пр-во ПанЭко или аналогичной) и оставляют на 20 минут для набухания, после чего среду удаляют пипеткой.
[24]Этап 2. Дермальные фибробласты человека, культивируемые стандартным способом, снимают с поверхности культуральных флаконов растворами Версена и трипсина (ПанЭко или аналогичными), тщательно ресуспендируют для получения однородной одноклеточной суспензии, после чего клетки высевают в количестве 30000-50000 клеток на поверхность мембраны, подготовленной на этапе 1, в 100 мкл питательной среды следующего состава: среда DMEM/F12 - 89%, эмбриональная бычья сыворотка (Hyclon, США или аналогичная) 10%, Glutamax (Gibco, США или аналогичный) - 1%.
[25]Этап 3. Клетки линии НаСаТ, культивируемые стандартным способом, снимают с поверхности культуральных флаконов растворами Версена и трипсина (ПанЭко или аналогичными), тщательно ресуспендируют для получения однородной одноклеточной суспензии, после чего клетки высевают в количестве 100000 клеток на подготовленную мембрану на этапе 1 (вариант 1) или на подготовленную мембрану с фибробластами на этапе 2 (вариант 2).
[26]Этап 4. Полученную на этапе 2 (вариант 1) или на этапе 3 (вариант 2) мембрану культивируют на среде DMEM/F12 (ПанЭко или аналогичной) - 89%, эмбриональная бычья сыворотка (Hyclon, США или аналогичная) 10% Glutamax (Gibco, США или аналогичный) - 1%, в условиях СО2-инкубатора. Замену питательной среды осуществляют каждые 2-3 суток. Через 5-7 суток культивирования на поверхности мембран клетки формируют плотный эпителиальный слой. После его формирования эквивалент МКО (вариант 1 или вариант 2) считают готовым к проведению тестирований.
[27]Полученные эквиваленты МКО (вариант 1 и 2) необходимо использовать в течение двух недель, пока клетки в их составе остаются живыми. В течение указанного срока эквиваленты МКО находятся в условиях CO2-инкубатора при 37°С в культуральной среде.
[28]Примеры осуществления способа.
[29]Пример 1. Проверка на цитотоксичность и адгезивность коллагеновой мембраны по отношению к культуре клеток человека и жизнеспособность клеточного материала.
[30]Для оценки токсичности и адгезивности коллагеновой мембраны в культуральные лунки диаметром 3 см, содержащие: среда DMEM/F12 -89%, эмбриональная бычья сыворотка (Hyclon, США) 1%, Glutamax (Gibco, США) и образец мембраны - Viscoll (ИМТЕК, Россия) - диск диаметром 1,6±0,1 см и толшиной 100±20 мкм размещенный на дне лунок, были посеяны фибробласты кожи человека (Fb d75) в количестве 100 тыс.клеток на лунку. Клетки в присутствии мембраны культивировали в условиях СО2-инкубатора в течение 3 суток.
[31]При визуальном осмотре было выявлено, что клетки в присутствии мембраны нормально прикреплялись к дну культуральной лунки в течение 4 часов после посева и проявляли нормальный физиологический фенотип - веретенообразную форму. К поверхности мембраны клетки активно прикреплялись.
[32]Через 3 суток культивирования клетки фибробласты образовали конфлуентный слой (фиг. 1). Окраска - витальным флуоресцентным красителем кальцеином (CalceinAM, зеленое окрашивание).
[33]Исходя из полученных результатов, мы оценили цитотоксичность мембраны Viscoll как низкую - фибробласты выживают и активно пролифирируют в непосредственном контакте с мембраной. Адгезивные свойства высокие.
[34]Так же мы протестировали мембрану в культурах иммортализованных клеток человека линии HaCat. Было выявлено, что данная клеточная линия хорошо адгезирует к мембране и образует на ней конфлуентный слой. (фиг. 2). Окраска - витальным флуоресцентным красителем кальцеином (CalceinAM, зеленое окрашивание).
[35]Пример 2. Оценка гистологической структуры эквивалента МКО.
[36]Мембрану с выращенными на ее поверхности эпителиальными слоями из клеток НаСаТ зафиксировали параформальдегидом, залили парафином и подготовили гистологические срезы. Результат представлен на фиг.3. Было выявлено, толщина мембраны на срезе не превышает 200 микрон и сопоставима с толщиной МКО человека, структура на срезе выглядит однородно.
[37]Пример 3. Проверка проницаемости эквивалентов МКО при пассивной диффузии раствора дексаметазона.
[38]В целях проверки проницаемости изготовленных эквивалентов МКО при пассивной диффузии дексаметазона была проведена серия экспериментов. Было подготовлено 2 варианта эквивалентов МКО. Модели готовили на специальных вставках в системе типа Transwell, представляющих собой стерильные пластиковые полые цилиндры с одной стороны закрытые мембраной с порами 0.4 мкм. Цилиндры находились в лунках 24-х луночного планшета (SPL, Китай). На вставки были помещены эквиваленты МКО: в первом варианте модель представляла собой коллагеновую мембрану Viscoll на поверхности которой были посеяны эпителиальные клетки линии НаСаТ, во втором варианте на коллагеновую мембрану сначала сажали фибробласты, а затем эпителиальные клетки линии НаСаТ (фиг. 4А, 4Б).
[39]После того, как на мембранах сформировывался клеточный слой, эквиваленты МКО считали готовыми и приступали к эксперименту по диффузии раствора дексаметазона в концентрации 2 мг/мл, по следующему методу:
[40]мембраны, не отделяя от дна вставки Transwell, изымали из системы культивирования в 24-х планшетах и перемещали на 96-ти луночный планшет для исследования проницаемости мембран. Для этого нижние лунки 96-ти луночного планшета заполняли PBS (ПанЭко) - по 300 мкл на лунку, так, чтобы жидкость касалась мембраны, размещенной на поверхности лунок. Сверху каждой такой лунки помещали вставку с эквивалентом МКО таким образом, чтобы образец соприкасался с жидкостью в лунке 96-ти луночного планшета (фиг. 5). После разведения раствора для инъекций дексаметазона (ООО Эллара, Россия) с концентрацией 4 мг/мл в PBS (ПанЭко) 1:1, полученный раствор заливали во вставки, по 300 мкл на вставку с эквивалентом МКО, обеспечивая таким образом пассивную диффузию через эквивалент МКО (фиг. 5), прижимали вставки к плато крышкой от плато и оставляли на час в инкубаторе. Через час из нижних лунок раствор отбирали и определяли относительную концентрацию дексаметазона. Для определения количества дексаметазона, прошедшего через экспериментальные образцы мембран, использовали высокоточный метод ВЭЖХ (использовали жидкостной хроматограф Agilent 1100, используя аналитическую колонку Thermo GOLD С18 (150×4.6 мм, 5 мкм), элюент состава 35/65 ацетонитрил/вода (HPLC grade), с расходом 1 мл/мин, температура термостата была установлена 25°С, длина волны УФ-детектора установлена на 240 нм). После получения числовых значений с 3 повторов эксперимента высчитывали среднее арифметическое и стандартное отклонение среднего. Оценка значимости при сравнении выборок из значений остаточной относительной концентрации дексаметазона в экспериментальных группах и в 2-х контролях (пустая мембрана без клеток и исходный раствор дексаметазона) (фиг. 6).
[41]После сбора и анализа проб было выявлено, что все варианты эквивалентов МКО являются полупроницаемыми для раствора дексметазона, но при этом выполняют барьерную функцию и пропускают лишь часть вещества: дексаметазон был обнаружен во всех пробах, при этом его концентрация значительно снижалась. Результирующая концентрация дексаметазона составила 13,5% у модели с одной коллагеновой мембраной без клеточного материала (контроль), 5% в эквиваленте МКО с использованием только эпителиальных клеток (вариант 1), 4,5% в эквиваленте МКО с использованием фибробластов и эпителиальных клеток (вариант 2) (фиг. 6). Таким образом, концентрация дексаметазона при прохождении его через полученные эквиваленты МКО вариант 1 и вариант 2 упала в 10-20 раз относительно контроля. Полученные данные соответствуют проницаемости МКО человека (Philip А, 2011), то есть созданный эквивалент МКО (варианты) соответствует принципам биологического подобия с МКО человека.
[42]Таким образом создан искусственный эквивалент мембраны круглого окна человека: живые эквиваленты МКО соответствуют толщине клеточного слоя, структуре и проницаемости человеческой МКО.
[44]• Nordang L, Anniko М. Hearing loss in relation to round window membrane morphology in experimental chronic otitis media. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 2001; 63(6):333-340.
[45]• Paparella MM, Schachern PA, Choo YB. The round window membrane: otological observations. Ann Otol Rhinol Laryngol. 1983;92(6 Pt l):629-634.
[46]• Goycoolea MV, Lundman L. Round window membrane. Structure function and permeability: A review, Microsc Res Tech. 1997; 36(3):201-211.
[47]• Lundman LA, Holmquist L, Bagger-Sjoback D. Round window membrane permeability. An in vitro model. Acta Otolaryngol. 1987 Nov-Dec; 104(5-6):472-80.
[48]• Gan RZ, Nakmali D, Zhang X. Dynamic properties of round window membrane in guinea pig otitis media model measured with electromagnetic stimulation. Hear Res. 2013 Jul; 301:125-36.
[49]• Keskin Yilmaz N, Albasan H, Borkti MK, Paparella MM, Cureoglu S. Three-Dimensional Analysis of Round Window Membrane in the Chinchilla Model with Acute Otitis Media Induced with Streptococcus Pneumoniae 7F. Turk Arch Otorhinolaryngol. 2021 Mar; 59(1):43-48.
[50]• Philip A. Bird, Daran P. Murray, Mei Zhang, and Evan J. Begglntratympanic Versus Intravenous Delivery of Dexamethasone and Dexamethasone Sodium Phosphate to Cochlear Perilymph. Otol Neurotol. 2011 Aug; 32(6):933-6. doi: 10.1097/MAO.0b013e3182255933
