[1]Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в центрах контроля качества лекарственных средств и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного определения суммы флавоноидов в листьях цефалярии гигантской.
[2]Цефалярия гигантская [Cephalaria gigantea (Ledeb.) Bobrov] - вид рода Cephalaria (L.) Schrad., представляющий собой крупный многолетник до двух метров в высоту. Встречается в Южной Европе, Западной и Центральной Азии, а также в Северной и Южной Африке [1, 2].
[3]Действующая система контроля качества требует постоянного усовершенствования подходов к стандартизации биологически активных соединений (БАС) с использованием современных методов анализа и актуальных данных об их свойствах, позволяющих дифференцированно определять конкретные группы биологически активных соединений. С этой целью необходимо разрабатывать новые, а также усовершенствовать уже имеющиеся методы количественного определения БАС, как фармакопейным, так и в малоизученном перспективном сырье, к которому относятся листья цефалярии гигантской [3].
[4]Изучение химического состава малоизученных перспективных растительных объектов является важным направлением в современной фармации. Растение содержит БАС – тритерпеноиды, фенолкарбоновые кислоты и их производные, а также флавоноиды. Известно применение цефалярии гигантской в народной медицине, в качестве жаропонижающего, отхаркивающего, вяжущего и гемостатического средства [4, 5].
[5]Анализ патентной и научной литературы показал: прототип способа определения действующих веществ в листьях Цефалярии гигантской [Cephalaria gigantea (Ledeb.) Bobrov] отсутствует. Об этом, в частности, свидетельствует отсутствие раздела определения действующих веществ в нормативно-технической документации.
[6]Из RU2554780 C1 известен способ количественного определения суммы флавоноидов методом дифференциальной спектрофотометрии, в пересчете на цинарозид в Желчегонном сборе №3. Данная методика включает такие стадии как экстракцию сырья 70% этиловым спиртом, реакцию комплексообразования с хлоридом алюминия, измерение оптической плотности электронного спектра испытуемого раствора при аналитической длине волны 400 нм и расчет содержания суммы флавоноидов на основе значений оптической плотности комплекса государственного стандартного образца цинарозида с алюминием хлоридом.
[7]Данный метод взят нами в качестве наиболее близкого аналога (прототипа). Использование этого способа для определения суммы флавоноидов в листьях Цефалярии гигантской не представляется возможным из-за отличия: в химическом составе растений; в консистенции и структуре растительного материала; в спектральных характеристиках; в последовательности выполнения аналитических операций.
[8]Таким образом, целью изобретения является разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в листьях Цефалярии гигантской.
[9]Техническим результатом является создание способа количественного определения суммы флавоноидов в листьях Цефалярии гигантской в пересчете на цинарозид.
[10]Технический результат достигается тем, что экстракцию сырья осуществляют однократно, в качестве экстрагента используют этиловый спирт в концентрации 70% в соотношении 1 г сырья к 50 мл спирта, количественное определение суммы флавоноидов в листьях Цефалярии гигантской проводят методом дифференциальной спектрофотометрии при длине волны 406 нм в пересчете на цинарозид; содержание суммы флавоноидов X, выраженное в процентах, в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
[11]
,
[13]D – оптическая плотность испытуемого раствора;
[14]Do – оптическая плотность раствора стандартного образца (СО) цинарозида;
[16]mо – масса СО цинарозида, г;
[17]W – потеря в массе при высушивании, %.
[18]В случае отсутствия СО цинарозида целесообразно использовать рассчитанное значение удельного показателя поглощения при 406 нм – 323. В этом случае содержание суммы флавоноидов X, выраженное в процентах, в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле:
[19]
,
[21]D – оптическая плотность испытуемого раствора;
[23]323– удельный показатель поглощения (E
) СО цинарозида при 406 нм;
[24]W – потеря в массе при высушивании, %.
[25]Все результаты были статистически обработаны. Ошибка единичного количественного определения составила ±0,42%.
[26]Способ реализуется следующим образом.
[27]Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарированных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 90 мин. Затем ее охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса). Испытуемый раствор готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор А). Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре при длине волны 406 нм через 40 мин после приготовления. В качестве раствора сравнения раствор, используют раствор, полученный следующим образом: 1 мл извлечения (1:50) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора спиртом этиловым 96% до метки.
[28]Приготовление раствора стандартного образца цинарозида.
[29]Около 0,02 г (точная навеска) цинарозида помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А цинарозида). 1 мл раствора А цинарозида помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор Б цинарозида). Раствор сравнения готовят следующим образом: 1 мл раствора А цинарозида помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (раствор сравнения Б цинарозида). Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:
[30],
[31]где D – оптическая плотность испытуемого раствора; Do – оптическая плотность раствора СО цинарозида; m – масса сырья, г; mо – масса СО цинарозида, г; W – потеря в массе при высушивании, %.
[32]В случае отсутствия СО цинарозида целесообразно использовать рассчитанное значение удельного показателя поглощения при 406 нм – 323.
[33],
[34]где D – оптическая плотность испытуемого раствора; m – масса сырья, г; 323– удельный показатель поглощения (E) СО цинарозида при 406 нм; W – потеря в массе при высушивании, %.
[35]При изучении спектральных характеристик было выявлено, что именно цинарозид (Фигура 1) определяет характер кривой поглощения водно-спиртового извлечения из листьев цефалярии гигантской. Определено, что в УФ-спектре водно-спиртового извлечения цефалярии гигантской наблюдается батохромный сдвиг длинноволновой полосы флавоноидов (Фигура 2), как и в случае цинарозида (Фигура 3).
[36]Изучение УФ-спектров показало, что раствор СО цинарозида в присутствии алюминия хлорида имеет максимум поглощения при длине волны 406 нм. В УФ-спектре водно-спиртового извлечения из листьев цефалярии гигантской в дифференциальном варианте обнаруживается при длине волны 406 нм максимум поглощения, который соответствует максимуму поглощения спиртового раствора цинарозида.
[37]Данный факт позволяет проводить спектрофотометрическое определение суммы флавоноидов в листьях цефалярии гигантской при аналитической длине волны 406 нм.
[38]Также нами было изучено влияние экстрагента на процесс экстракции. В таблице (Фигура 4) представлена зависимость выхода флавоноидов из листьев цефалярии гигантской от концентрации экстрагента. В результате эксперимента в качестве оптимального экстрагента нами был выбран 70% этиловый спирт, так как выход действующих веществ из сырья при его использовании максимален.
[39]Предлагаемый способ поясняется следующими примерами.
[41]Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарированных весах с точностью до ±0,01. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 90 мин. Затем ее охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (красная полоса). Испытуемый раствор готовят следующим образом: 1 мл полученного извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор А). Измеряют оптическую плотность испытуемого раствора на спектрофотометре при длине волны 406 нм через 40 мин после приготовления. В качестве раствора сравнения раствор, используют раствор, полученный следующим образом: 1 мл извлечения (1:50) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора спиртом этиловым 96% до метки.
[42]Приготовление раствора стандартного образца цинарозида.
[43]Около 0,02 г (точная навеска) цинарозида помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15 мл 70% этилового спирта при нагревании на водяной бане. После охлаждения содержимого колбы до комнатной температуры доводят объем раствора 70% этиловым спиртом до метки (раствор А цинарозида). 5 мл раствора А цинарозида помещают в мерную колбу на 25 мл, прибавляют 2 мл 3% спиртового раствора алюминия хлорида и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (испытуемый раствор Б цинарозида). Раствор сравнения готовят следующим образом: 5 мл раствора А цинарозида помещают в мерную колбу на 25 мл и доводят объем раствора до метки спиртом этиловым 96 % (раствор сравнения Б цинарозида). Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид и абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле:
[44]
,
[46]0,3801 – оптическая плотность испытуемого раствора;
[47]0,6623 – оптическая плотность раствора СО цинарозида;
[48]1,0032 – масса сырья, г;
[49]0,0025 – масса СО цинарозида, г;
[50]1,7 – потеря в массе при высушивании, %.
[51]Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид –2,9%.
[53]В случае отсутствия СО цинарозида целесообразно использовать рассчитанное значение удельного показателя поглощения при 406 нм – 323.
[54]
,
[56]0,3825 – оптическая плотность испытуемого раствора;
[57]1,0028 – масса сырья, г;
[58]323– удельный показатель поглощения (E) СО цинарозида при 406 нм;
[59]1,7 – потеря в массе при высушивании, %.
[60]Содержание суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид x=3,0%, что сравнимо со значением, полученном в примере 1.
[61]Таким образом, предлагаемый способ количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на цинарозид в листьях цефалярии гигантской с использованием дифференциальной спектрофотометрии разработан впервые для данного вида сырья и обладает следующими преимуществами:
[62]1. Разработанный метод является специфичным и селективным, а также позволяет проводить экстракцию сырья однократно, поскольку в качестве экстрагента используется 70% этиловый спирт, позволяющий исчерпывающе извлекать целевые вещества (флавоноиды).
[63]2. Пересчет суммы флавоноидов идет на специфическое для листьев цефалярии гигантской вещество - цинарозид.
[64]3. Ошибка единичного определения предлагаемого способа составляет ±0,42%, что свидетельствует об объективности разработанного способа и более высокой точности.
[65]Этот способ можно применять в центрах контроля качества лекарственных средств, на фармацевтических предприятиях и контрольно-аналитических лабораториях при проведении количественного анализа листьев цефалярии гигантской (Cephalaria gigantea (LEDEB.) Bobrov).
[66]ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ:
[67]1. Е. Г. Бобров, И. Т. Васильченко, С. Г. Горшкова, Ан. А. Федоров, Флора СССР. Том XXIV. – Издательство академии наук СССР. – Москва, Ленинград, 1957. – с. 29-30.
[68]2. И. А. Губанов, К. В. Киселёва, В. С. Новиков, В. Н. Тихомиров. Иллюстрированный определитель растений Средней России. Том 2: Покрытосеменные (двудольные: раздельнолепестные). – Москва: Товарищество научных изданий КМК, Институт технологических исследований, 2003.
[69]3. Т. Л. Киселева, Ю. А. Смирнова, Лекарственные растения в мировой медицинской практике: государственное регулирование номенклатуры и качества. – М., 2009.
[70]4. И. С. Мовсумов, Э. А. Гараев, Химия растительного сырья, №3, с. 5-10 (2010).
[71]5. А. В. Куркина, Флавоноиды фармакопейных растений: монография. – Самара: СамГМУ Росздрава: ООО «Офорт», 2012. – 290 с.
,
стандартного образца цинарозида при 406 нм, равное 323:
,
