[1]Группа изобретений относится к области биотехнологии, иммунологии и вирусологии, а именно к однодоменному антителу ламы Н5, и к однодоменному антителу ламы Н5, слитому с Fc-фрагментом IgG1 человека (H5-Fc), специфически связывающие RBD-домен S-белка вируса SARS-CoV-2, нейтрализующие вирус SARS-CoV-2, к фрагментам ДНК, кодирующим указанные антитела.
[2]В декабре 2019 года в г. Ухань (Китай) наблюдался резкий рост пациентов с пневмонией неизвестного происхождения с тяжелым протеканием заболевания. Вскоре был установлен возбудитель - РНК вирус, относящийся к роду Бетакоронавирусов, а заболевание, вызываемое им, было названо COVID-19. Оказалось, что новый коронавирус, названный SARS-CoV-2, является родственным двум другим вирусам, SARS-CoV и MERS-CoV, вызвавших вспышки пневмонии в 2003 году в Азии и 2012 году на Ближнем Востоке, соответственно (Tomlinson В., Cockram С.Lancet. 2003;361(9368):1486-7. doi: 10.1016/S0140-6736(03) 13218-7; Geng Н., Tan W. Sci China Life Sci. 2013;56(8):683-7. doi: 10.1007/s 11427-013-4519-8). SARS-CoV распространился no 20 странам, всего было 8098 случаев, умерло 774 человека, таким образом летальность составила 9,6%. В 2004 году вспышка SARS-CoV закончилась, новых случаев больше зарегистрировано не было. MERS-CoV распространился по 23 странам, зафиксировано 2506 случаев, 912 смертей, с уровнем летальности в 36%. Все три вируса, SARS-CoV, MERS-CoV и SARS-CoV-2, передаются воздушно-капельным путем и имеют зоонозное происхождение, однако только последний смог распространиться по всему миру и вызвать пандемию, которая была объявлена Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) 11 марта 2020 года. На 11 октября 2022 года, по данным ВОЗ, всего в мире зафиксировано 618 521 620 случаев заражения SARS-CoV-2, из них погибло 6 534 725 человек, тем самым уровень летальности составил 1,06%. В Российской Федерации, по данным ВОЗ, зафиксировано 21 218 993 случаев заражения, из них 388 295 смертей, летальность составила 1,83% (https://covidl9.who.int/table). Таким образом, хотя смертность от SARS-CoV-2 в 10-30 раз ниже, чем от SARS-CoV и MERS-CoV, ввиду его широкого распространения, принявшего характер пандемии, общее число смертей от SARS-CoV-2 в тысячи раз выше, что не может не вызывать глубокую озабоченность.
[3]Как известно, на сегодняшний момент, вирус SARS-CoV-2 передается воздушно-капельным, воздушно-пылевым и контактным путями, может вызывать как легкую форму ОРВИ, так и тяжелую пневмонию, приводящую к острой дыхательной недостаточности, а также серьезное поражение других органов и тканей, в том числе и нервной.
[4]Молекулярный механизм заражения SARS-CoV-2 заключается главным образом в распознавании тримером шиповидного Spike (S) белка на поверхности вириона рецептора АСЕ2 на поверхности клетки человека. Распознавание АСЕ2 происходит особым доменом на поверхности S-белка, а именно рецептор-связывающим доменом (RBD). При контакте S-белка и АСЕ2-рецептора запускается каскад изменений, приводящих, в конечном счете, к слиянию мембран вириона и клетки и к проникновению в нее генетического материала вируса (Bian J., Li Z. Acta Pharm Sin B. 2021;11(1):1-12. doi: 10.1016/j.apsb.2020.10.006; Chambers J. P., Yu J., Valdes J. J. et al. J Pathog. 2020;2020:9238696. doi: 10.1155/2020/9238696).
[5]На первых этапах пандемии для ее сдерживания, ввиду отсутствия иных средств, применялись только ограничительные методы, включающие самоизоляцию, ношение масок и перчаток в общественных местах, запрет на проведение публичных мероприятий и т.п.Далее, в кратчайшие сроки, были разработаны вакцины против коронавируса, причем одной из первых была разработана вакцина Sputnik V в НИИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи (Logunov D. Y., Dolzhikova I. V., Shcheblyakov D. V. Lancet. 2021;397(10275):671-681. doi: 10.1016/S0140-6736(21)00234-8). На сегодняшний момент в мире насчитывается более 15 одобренных вакцин против SARS-CoV-2 и более 63% людей на Земле прошли полную вакцинацию по данным ВОЗ (https://covidl 9.who.int/table).
[6]Несмотря на высокий процент вакцинированных, до сих пор остается необходимость в дополнительных средствах профилактики и терапии COVID-19. Это обусловлено, во-первых, появлением новых штаммов SARS-CoV-2, против которых вакцины на основе Уханьского штамма Wu-1 имеют значительно меньшую эффективность. Во-вторых, существуют группы людей, для которых вакцинация противопоказана по состоянию здоровья. В-третьих, существуют группы риска, которые ввиду наличия хронических заболеваний или скомпрометированного иммунитета, даже не смотря на вакцинацию, подвержены тяжелому течению заболевания и высокой смертности от него. Для снижения смертности среди упомянутых категорий людей, а также для терапии заболевания при его тяжелом протекании могут быть использованы моноклональные антитела, нейтрализующие SARS-CoV-2.
[7]Моноклональные терапевтические антитела хорошо зарекомендовали себя в мировой практике для лечения онкологических, аутоиммунных и инфекционных заболеваний у человека. В настоящее время одобрено или находятся на одобрении в США и Европе 173 моноклональных антитела (www.antibodysociety.org/antibody-therapeutics-product-data).
[8]За неполные три года пандемии учеными со всего мира были получены сотни распознающих SARS-CoV-2 моноклональных антител человека, многие из них являются вирус-нейтрализующими (согласно базе данных CoV-AbDab (http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/covabdab/) и были запущены в доклинические и клинические испытания. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (US FDA) одобрило для экстренного использования моноклональное антитело человека Бебтеловимаб и коктейль (Тиксагевимаб+Цилгавимаб). В то же время, в связи с появлением новых штаммов SARS-CoV-2, было приостановлено применение ранее одобренных Сотровимаба, а также коктейлей (Касиривимаб+Имдевимаб) и (Бамланивимаб+Этесивимаб) (https://www.fda.gov/dmgs/emergency-preparedness-dmgs/coronavirus-covid-19-drugs).
[9]Введение Бебтеловимаба или Сотровимаба в моно-формате, как было показано в результате проведения клинических испытаний, резко снижает риск тяжелого протекания болезни у пациентов из группы риска (Razonable R.R., Tulledge-Scheitel S.M., Hanson S.N. Open Forum Infect Dis. 2022;9(10):ofac411. doi: 10.1093/ofid/ofac411). При профилактическом введении коктейля (Тиксагевимаб+Цилгавимаб) иммунноскомпрометированным пациентам наблюдался низкий уровень заражения и тяжелых последствий от COVID-19 (Nguyen Y., Flahault A., Chavarot N. et al. Clin Microbiol Infect. 2022;S1198-743X(22)00383-4. doi: 10.1016/j.cmi.2022.07.015). Также было показано, что введение коктейля (Касиривимаб+Имдевимаб) снижает вирусную нагрузку, а также значительно снижает частоту обращения к врачу, особенно у серанегативных пациентов (Weinreich D.M., Sivapalasingam S., Norton Т., et al. N Engl J Med. 2021;384(3):238-251. doi: 10.1056/NEJMoa2035002). Наконец, введение коктейля (Бамланивимаб+Этесивимаб) приводило к значительному снижению вирусной нагрузки у пациентов с легким и среднетяжелым протеканием болезни (Gottlieb R.L., Nirula А., Chen P. et al. JAMA. 2021;325(7):632-644. doi: 10.100l/jama.2021.0202). Таким образом, эффективность действия моноклональных антител, нейтрализующих SARS-CoV-2, была показана во многих экспериментах и клинических исследованиях.
[10]Тем не менее, у классических моноклональных антител имеется ряд следующих недостатков:
[11]1) трудность и дороговизна их получения, так как из-за наличия у таких антител пары цепей (тяжелой и легкой), необходимо клонировать их из единичной В-клетки (низкопроизводительный метод) или использовать высокопроизводительные, но дорогостоящие методы микрофлюидики или анализа транскриптомов единичных клеток (Ehlers А.М,. den Hartog Jager С.F., Kardol-Hoefnagel Т. et al. Front Immunol. 2021;12:660037. doi: 10.3389/fimmu.2021.660037; Busse С.E., Czogiel I., Braun P. Eur J Immunol. 2014; 44(2):597-603. doi: 10.1002/eji.201343917);
[12]2) сложности в обнаружении некоторых труднодоступных или скрытых эпитопов;
[13]3) дороговизна лечения из-за необходимости введения нескольких граммов таких антител внутривенно, а также из-за сложностей в их биотехнологическом производстве (большой размер белка, его сложная четвертичная структура).
[14]Для преодоления перечисленных недостатков наиболее перспективным является применение однодоменных антител верблюдовых. Однодоменные антитела получают из особых антител, состоящих из тяжелых цепей (hcAb), которые в природе встречаются у представителей семейства верблюдовых (например, двугорбый верблюд, лама, альпака). hcAb состоят всего из двух одинаковых цепей, каждая из которых состоит из двух константных (СН) и одного вариабельного домена (VHH). VHH является независимой антиген-распознающей единицей, формирующей функциональный паратоп, и этот домен можно использовать в качестве самостоятельной молекулы, распознающей антиген. Такие молекулы и называют однодоменными антителами, наноантителами или нанотелами.
[15]Однодоменные антитела обладают рядом преимуществ, по сравнению с классическими антителами: 1) низкая или отсутствующая иммуногенность, ввиду небольшого размера однодоменных антител (15 кДа); 2) высокая термостабильность; 3) особая структура паратопа VHH, позволяющая ему распозновать эпитопы, недоступные для классических антител, например вогнутые эпитопы, или эпитопы, доступ к которым стерически ограничен; 4) дешевизна в наработке, в том числе возможность использовать прокариотические экспрессирующие системы; 5) малый размер антител, что позволяет доставлять однодоменные антитела напрямую в дыхательные пути в виде аэрозоля; 6) возможность использования в виде гомо- или гетеродимеров и тримеров, то есть молекул, обладающих или повышенной авидностью, или мультипаратопностью, устойчивых к мутационному ускользанию вируса (Walter J. D., Scherer M., Hutter С.A. J. et al. EMBO Rep.2022;23(4):e54199. doi: 10.15252/embr.202154199).
[16]У однодоменных антител имеются также и недостатки: короткое время выведения из организма из-за сверхмалого размера и отсутствие у молекулы эффекторной части, запускающей иммунный ответ в организме. Эти проблемы легко решаются путем создания молекул, по структуре напоминающих hcAb, в которых Fc-фрагмент верблюдовых заменен на Fc-фрагмент IgG1 человека (Esmagambetov I. В., Shcheblyakov D. V., Egorova D. A. Et al. Acta Naturae. 2021;13(4):53-63. doi: 10.32607/actanaturae. 11487). Такие химерные антитела действуют аналогично классическим антителам человека, но являются более стабильными и дешевыми в производстве в эукариотической системе, так как имеют меньший размер и более простую структуру. Также Fc-химерные антитела можно производить и в прокариотической системе, что может еще в большей степени удешевить их производство (Ye G., Gallant J., Zheng J. et al. Elife. 2021;10:e64815. doi: 10.7554/eLife.64815).
[17]В настоящее время препаратов на основе однодоменных антител и их производных для профилатики и лечения COVID-19 не имеется.
[18]Известно мышиное моноклональное антитело, специфически связывающее RBD фрагмент в составе S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее способностью нейтрализовать живой SARS-CoV-2 in vitro (патент RU 2744274 С1, опубл. 04.03.2021).
[19]Недостатком данного антитела является его высокая иммуногенность по отношению к человеку, что делает критически опасным его внутривенное введение. Кроме того, отсутствуют данные по эффективности этого антитела in vivo на животной модели.
[20]Известно однодоменное антитело (VHH), специфически связывающееся с RBD-доменом S-белка SARS-CoV-2 и нейтрализующее лентивирус, псевдотипированный S-белком SARS-CoV-2 (заявка WO 2022020668A1, опубл. 14.04.2016).
[21]Известно семейство (большая библиотека) однодоменных антител к S-белку SARS-CoV-2, в том числе к его RBD части, в том числе нейтрализующих in vitro живой вирус SARS-CoV-2, а также лентивирус, псевдотипированный S-белком SARS-CoV-2. В этом же решении, наравне с некоторыми однодоменными антителами, были испытаны также и их димеры и тримеры (заявка WO 2022040603A2, опубл. 24.02.2022).
[22]Недостатками упомянутых выше однодоменных антител является их низкий молекулярный вес, что способствует их быстрой элиминации из кровотока и требует их многократного введения. Также отсутствуют данные по эффективности этих антител in vivo на животной модели.
[23]Наиболее близкими к заявляемым однодоменным антителам - прототипом, являются однодоменные антитела, связывающие RBD-домен S-белка SARS-CoV-2, а также их производные в виде простых димеров, а также мономеров и димеров, слитых с Fc-фрагментом IgG1 человека, самодимеризующихся при наработке в эукариотической системе. В данном решении показаны нейтрализующие свойства нескольких однодоменных антител, а также способность одного из этих антител (р2 с5) в виде химерного белка, слитого с Fc-фрагментом IgG1 человека (p2c5-fc), нейтрализовать SARS-CoV-2 in vivo в модели АСЕ2-трансгенных мышей и в модели сирийского хомячка (патент RU 2763001С1, опубл. 24.12.2021).
[24]Недостатками прототипа являются:
[25]1) Низкая вирус-нейтрализующая активность известных однодоменных антител. Лучшее однодоменное антитело р2 с5, выбранное авторами для дальнейшей модификации и использования в in vivo экспериментах, обладает очень низкой вирус-нейтрализующей активностью (664 нг/мл), что препятствует его использованию в профилактике и терапии COVID-19 у человека, так как потребует высоких доз введения препарата, а, следовательно, больших затрат на его производство, а также приведет к высокой нагрузке на организм пациента;
[26]2) Константа диссоциации для взаимодействия р2 с5 с RBD-доменом S-белка SARS-CoV-2 является средней в сравнении с константами для классических антител (Ко=2,8 пМ), но слабой для однодоменных антител, для которых не представляет сложности получить Ко в пикомолярном диапазоне.
[27]3) Отсутствует доказательство связывания химерной p2c5-fc молекулы с RBD доменом S-белка SARS-CoV-2 и существования ее вирус-нейтрализующей активности за счет р2 с5 части, а не fc-фрагмента. Эти факты ставят под сомнение наличие специфической терапевтической и профилактической активности химерной p2c5-fc на моделях in vivo;
[28]4) недостаточные функциональные возможности известных однодоменных антител, поскольку вирус-нейтрализующая активность р2 с5 показана только на примере Уханьского штамма SARS-CoV-2, но не для других его вариантов. Появление новых штаммов SARS-CoV-2 требует тестирования кандидатных терапевтических антител против разных вариантов SARS-CoV-2 для поиска антител с широким спектром действия.
[29]Таким образом, существует необходимость в создании антител, специфически связывающихся с RBD-доменом S-белка SARS-CoV-2, а также нейтрализующих различные варианты SARS-CoV-2, которые могут быть использованы для диагностики, профилактики и терапии заболевания человека, вызываемого вирусом SARS-CoV-2, лишенных перечисленных выше недостатков.
[30]Задачей группы изобретений является создание однодоменного антитела и его производного, которые могут специфически и эффективно связывать RBD-домен S-белка SARS-CoV-2 различных вариантов вируса, а также получение ДНК фрагментов, кодирующих однодоменное антитело и его производное.
[31]Техническим результатом группы изобретений является создание нового однодоменного антитела ламы Н5, а также его производного - химерного антитела Н5-Fc, представляющего однодоменное антитело Н5, слитое с Fc-фрагментом IgG1 человека, способных к связыванию с RBD-доменом S-белка SARS-CoV-2, отличающиеся по аминокислотной последовательности вариабельных VHH доменов от известных RBD-специфических однодоменных антител.
[32]Также техническим результатом является повышение аффинности созданных антител, что позволяет снизить их дозировку при применении, что в значительной степени снижает их стоимость при производстве, а значит - повышает их привлекательность для коммерциализации.
[33]Также техническим результатом является способность созданных антител высокоэффективно нейтрализовать вирус SARS-CoV-2 как в in vitro схемах, так и in vivo в профилактических и терапевтических схемах, что позволяет использовать их для профилактики и терапии заболевания, вызываемого вирусом SARS-CoV-2.
[34]Также техническим результатом является способность созданных антител нейтрализовать вирус SARS-CoV-2 разных вариантов, что позволяет использовать их для профилактики и терапии заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 разных штаммов.
[35]Поставленная задача решается созданием однодоменного антитела ламы Н5, специфически связывающего RBD-домен S-белка SARS-CoV-2, обладающего вируснейтрализующей активностью, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, а также созданием кодирующего его фрагмента ДНК, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3.
[36]Поставленная задача решается также созданием химерного антитела H5-Fc, представляющего собой однодоменное антитело, слитое с Fc-фрагментом IgG1 человека, специфически связывающего RBD-домен S-белка SARS-CoV-2, обладающего вируснейтрализующей активностью, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, а также созданием кодирующего его фрагмента ДНК, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4.
[37]Аминокислотная последовательность однодоменного антитела ламы Н5 (SEQ ID NO: 1), а также нуклеотидная последовательность кодирующего его фрагмента ДНК (SEQ ID NO: 3) и аминокислотная последовательность химерного антитела H5-Fc (SEQ ID NO: 2), а также нуклеотидная последовательность кодирующего его фрагмента ДНК (SEQ ID NO: 4) представлены в перечне последовательностей.
[38]Специалистам в данной области техники известно, что области любого однодоменного антитела могут подразделяться на гипервариабельные районы, которые называются определяющими комплементарность областями (CDR), перемежаемые областями с более высоким уровнем консервативности, называемыми рамочными областями (FR). Каждое однодоменное антитело образовано тремя CDR и четырьмя FR, расположенными от амино-терминального конца к карбокси-терминальному концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Участки CDR и FR антител могут быть определены по номенклатуре Международной информационной системы по иммуногенетике (International Immunogenetics Information System, www.imgt.org). У антител, созданных в рамках заявляемого технического решения, CDR участки являются идентичными, то есть CDR1 участок однодоменного антитела ламы Н5 совпадает с CDR1 участком химерного антитела H5-Fc, то же самое верно и для CDR2, и для CDR3 участков. CDR участки H5/H5-Fc имеют следующие аминокислотные последовательности: CDR1 - SEQ NO: 5, CDR2 - SEQ NO: 6 и CDR3 -SEQ NO: 7. Аминокислотные последовательности CDR участков SEQ NO: 5-7 представлены в перечне последовательностей.
[39]Специалистам в данной области техники известно, что делеция, добавление, замена одной или даже нескольких аминокислот могут приводить к получению аллельной формы исходного белка, которая будет сохранять свою активность. Также известен способ «перевивки» CDR-петель одного антитела в структуру рамочных последовательностей другого антитела с сохранением исходных свойств, что в частности позволяет производить гуманизацию антител, полученных в других млекопитающих. Таким образом, антитела предлагаемого решения включают те варианты, аминокислотная последовательность которых вне CDR петель отличается от приведенных в настоящей заявке последовательностей, но которые сохранили ту же антигенсвязывающую активность.
[40]Как известно специалисту в данной области технологии, консервативные Fc-фрагменты классических антител необходимы для их функционирования, в частности они обеспечивают связь между гуморальным и клеточным ответом и могут усилить действие терапевтических моноклональных антител (Gogesch P., Dudek S., van Zandbergen G. et al. Int J Mol Sci. 2021;22(16):8947. doi: 10.3390/ijms22168947). Fc-фрагмент IgG1 человека в составе антитела, имеющего последовательность SEQ ID NO: 2, согласно заявляемому решению может быть заменен на Fc-фрагмент другого изотипа (IgG2, IgG3, IgG4) или класса (IgM, IgD, IgE, IgA) человека.
[41]Специалистам в данной области техники также известно, что ввиду вырожденности генетического кода могут быть различия в последовательности ДНК. Поэтому последовательности нуклеиновых кислот, согласно заявляемому решению могут отличаться, при условии, что они кодируют участки цепей антитела, содержащего последовательность нуклеотидов, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 4, и последовательность аминокислот, не менее чем на 90% гомологичную SEQ ID NO: 1-2 и SEQ ID NO: 5-7.
[42]Антитела заявляемого решения могут быть человеческим антителом, гуманизованным антителом, мышиным антителом, химерным антителом и другими генно-инженерными антителами.
[43]Краткое описание чертежей, иллюстрирующих изобретение
[44]На фиг. 1 представлены аминокислотные последовательности однодоменного антитела ламы Н5 (А) и химерного антитела H5-Fc, представляющего собой однодоменное антитело ламы Н5, слитое с Fc-фрагментом IgG1 человека (Б). CDR районы отмечены жирным шрифтом. Введенные генно-инженерным способом последовательности отмечены подчеркиванием (сигнал транспорта в периплазму (*), НА и 6×His тэги, Fc'-фрагмент IgG1 человека).
[45]На фиг. 2 представлена схематическая структура однодоменного антитела ламы Н5, полученного в прокариотической экспрессионной системе (Е. coli). Сигнал для секреции в периплазму бактерии необходим для правильного фолдинга белка, 6xHis тэг - для металл-хелатной очистки белка.
[46]На фиг. 3 представлена схематическая структура химерного антитела H5-Fc, представляющего собой однодоменное антитело ламы Н5, слитое с Fc-фрагментом IgG1 человека, полученное в эукариотической экспрессионной системе (НЕК 293Т фибробласты). Данный белок представляет собой самособирающийся димер из двух одинаковых цепей, связанных двумя дисульфидными мостиками.
[47]На фиг. 4 представлен анализ чистоты однодоменного антитела ламы Н5 (дорожка 1) и химерного антитела H5-Fc (дорожка 2) с помощью электрофореза по Лэммли в разделяющем 15% полиакриламидном геле с додецил сульфатом натрия и меркаптоэтанолом. На дорожке М нанесен маркер молекулярного веса. Однодоменное антитело ламы Н5 было наработано в периплазме бактерий Е. coli и затем очищено с помощью аффинной металл-хелатной хроматографии на Ni-NTA агарозе. Антитело Н5-Fc было наработано в эукариотических клетках НЕК293Т и очищено с помощью аффинной хроматографии на белке А.
[48]На фиг. 5 представлен конкурентный иммуноферментный анализ взаимодействия рекомбинантного RBD-домена SARS-CoV-2 с Н5 однодоменным антителом ламы или рекомбинантным АСЕ2 растворимым рецептором. Однодоменное антитело ламы Н5 брали в последовательных разведениях, смешивали с биотинилированным RBD и добавляли в лунки с иммобилизованным АСЕ2. Детекцию RBD проводили стрептавидин-HRP конъюгатом. В качестве отрицательного контроля использовали нерелевантное однодоменное антитело А10.
[49]На фиг. 6 представлена динамика веса сирийских хомячков, зараженных вирусом SARS-CoV-2. Хомячкам вводили по 10 мг антител/1 кг веса за 24 часа до (профилактика) или за 6 часов после заражения (терапия). В качестве положительного контроля использовали iB14 моноклональное антитело человека, нейтрализующее SARS-CoV-2. В качестве отрицательного контроля - суммарные IgG человека. Химерное антитело H5-Fc являлось тестируемым.
[50]На фиг. 7 представлена вирусная нагрузка SARS-CoV-2 в легких сирийских хомячков, определенная методом RT-qPCR. В качестве положительного контроля использовали iB14 моноклональное антитело человека, нейтрализующее SARS-CoV-2. В качестве отрицательного контроля - суммарные IgG человека. Химерное антитело H5-Fc являлось тестируемым.
[51]Последующие примеры приведены для целей объяснения и не ограничивают каким-либо образом рамки заявленного изобретения.
[52]Пример 1. Получение иммунной библиотеки кДНК однодоменных антител ламы с использованием рекомбинантного RBD-домена S-белка SARS-CoV-2 вируса дикого типа.
[53]Иммунизация ламы (Llama glama) была проведена согласно стандартному полному протоколу с использованием в качестве адьюванта GERBU LQ (Baral T.N., MacKenzie R., Arbabi Ghahroudi M. Curr Protoc Immunol. 2013;103:2.17.1-2.17.57. doi: 10.1002/0471142735.im0217sl03). Необходимое количество рекомбинантного RBD (от 600 до 900 мкг на одну инъекцию) смешивали с адьювантом и вводили ламе в две точки в нижней части шеи подкожно. Цикл иммунизаций включал три инъекции с перерывом в три недели. Через неделю после третьей иммунизации из яремной вены ламы брали 25 мл крови. Для выделения лейкоцитов из крови иммунизированной ламы использовали центрифугирование в градиенте плотности фиколла (ПанЭко, Россия). Всего было выделено 1,5×10 лейкоцитов.
[54]Выделение суммарной РНК В-лимфоцитов проводили согласно одностадийному методу с использованием гуанидин изотиоцианата (Chomczynski P., Sacchi N. Nat Protocol. 2006;1(2):581-5. doi: 10.1038/nprot.2006.83). Все работы по выделению проводились со стандартными предосторожностями, направленными на сохранение интактности РНК. Количество суммарной РНК полученной из периферических В-лимфоцитов, составило 200 мкг.
[55]Синтез кДНК проводили с использованием набора RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific) по протоколу производителя. Параллельно проводили 2 реакции с использованием 10 мкг суммарной РНК в каждой и двух разных праймеров - Олиго (dT)ig и статистического гексамерного праймера. Амплификацию VHH кДНК-фрагментов проводили в 2 этапа методом ПЦР с использованием Phusion ДНК-полимеразы (Thermo Fischer Scientific) (Pardon E., Laeremans Т., Triest S. et al Nat Protoc. 2014;9(3):674-93. doi: 10.1038/nprot.2014.039).
[56]Для создания кДНК-библиотеки, позволяющей проводить скрининг методом фагового дисплея был выбран вектор pHEN4 (Arbabi Ghahroudi М., Desmyter A., Wyns L., Hamers R., Muyldermans S. FEBS Lett. 1997; 414(3):521-6. doi: 10.1016/s0014-5793(97)01062-4). Данный вектор не позволяет проводить выделение и очистку однодоменных антител после завершения процедуры скрининга. В связи с этим вектор pHEN4 был модифицирован генно-инженерным путем. Полученный в итоге вектор pHEN4-HH содержал в своей последовательности 6xHis-tag, что позволяет проводить очистку продуктов экспрессии методом металл-хелатной аффинной хроматографии.
[57]Далее проводили гидролиз и лигирование полученных VHH кДНК фрагментов в фагмидный вектор для фагового дисплея, pHEN4-HH, по сайтам для эндонуклеаз рестрикции Pst I и Not I. Полученными плазмидными конструкциями трансформировали штамм Е. coli TG1. В данном амбер-супрессорном штамме VHH при экспрессии сливаются с поверхностным белком III фага. Представительность созданной иммунной библиотеки VHH-последовательностей составила 10 независимых клонов.
[58]Пример 2. Получение библиотеки бактериофагов.
[59]Процедура скрининга кДНК библиотеки методом фагового дисплея требует ее перевода в фаговую форму, поскольку сам принцип метода заключается в том, что белок-мишень, иммобилизованный на твердой подложке, связывается, в данном случае, с однодоменными антителами, которые фаг экспонирует на своей оболочке. Это достигается путем слияния интересующих нас генов с геном фага, отвечающего за синтез белка капсида, что и было достигнуто в результате получения библиотеки VHH-фрагментов в векторе pHEN4-HH. Перевод библиотеки в фаговую форму осуществлялся при ее культивировании совместно с фагом-помощником VCSM13. Титр полученного препарата фага, несущего VHH, составил 8x10, что вполне достаточно для проведения минимум 10 процедур скрининга.
[60]Пример 3. Селекция однодоменных антител, специфически узнающих RBD-домен S-белка SARS-CoV-2 вируса, определение их последовательности.
[61]Аффинное обогащение фаговой библиотеки проводили согласно базовому протоколу по генерации наноантител с целью повышения содержания в ней фаговых клонов, экспонирующих VHH против RBD (Esparza T.J., Martin N.P., Anderson G.P., Goldman E.R., Brody D.L. Sci Rep.2020; 10(1):22370. doi: 10.1038/s41598-020-79036-0). Отбор RBD-связывающих фагов проводили на SS-биотинилированном рекомбинантном RBD, связанным с магнитным сорбентом со стрептавидином (MagnaBind Streptavidin, Thermo Fisher Scientific). После интенсивных отмывок неспецифически связавшихся фагов, дисульфидные связи SS-биотина восстанавливали дитиотритолом и высвобождали фаговые частицы. Затем фаг в количестве 105-106 частиц добавляли к клеткам Е. coli штамма TG, в результате чего геном фага попадал в цитоплазму бактерии-хозяина с последующей репликация фагмиды через ori Е. coli., таким образом получали суббиблиотеку с преобладающим количеством клонов, способных связывать RBD.
[62]Иммуноферментный анализ проводили с целью поиска отдельных фаговых клонов, экспонирующих VHH против RBD. Для этого рекомбинантый RBD иммобилизовали на дне лунок планшета и добавляли в них отдельные клоны суббиблиотеки, переведенные с помощью фага помощника в форму фага, экспонирующего индивидуальные VHH. Не связавшиеся с RBD фаги тщательно отмывали и добавляли в лунки мышиные антитела против фага М13, после чего вносили RAM-HRP конъюгат.При добавление субстратного буфера в лунках, в которых фаги связались с иммобилизованным RBD, происходило проявление цветовой индикации в ходе ферментативной реакции. Результаты реакции оценивали визуально, а в числовом виде получали с помощью микропланшетного спектрофотометра Multiskan GO (Thermo Scientific) при длине волны 491 нм. В результате проведенных процедур был отобран Н5 клон, взаимодействующий с RBD SARS-CoV-2.
[63]В дальнейшем проводили культивацию бактерий, содержащих вектор pHEN4-Н5, кодирующий последовательность Н5 однодоменного антитела ламы, и выделяли из них плазмидную ДНК с помощью набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Fischer Scientific) согласно рекомендациям производителя. Нуклеотидную последовательность однодоменного антитела определяли методом секвенирования по Сэнгеру с использованием набора реактивов BigDye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kit (Thermo Fischer Scientific) на приборе Gene Analyzer 3500 (Applied Biosystems). В результате была определена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 3), кодирующая однодоменное антитело ламы Н5 (SEQ ID NO: 1), для которого были найдены границы CDR и FR участков и определены аминокислотные последовательности CDR: CDR1 - SEQ NO: 5, CDR2 - SEQ NO: 6 и CDR3 - SEQ NO: 7 (Фиг. 1 А).
[64]Пример 4. Получение и очистка однодоменного антитела ламы Н5 Наработку однодоменного антитела ламы Н5, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и структуру, указанную на Фиг. 2, проводили в периплазматическом пространстве Е. coli штамма НВ2151. Очистку полученных VHH проводили с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA агарозном сорбенте (Novagen). После тщательных промывок, VHH элюировали с сорбента с помощью буфера элюции (25 мМ Трис-HCl рН 8,0, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол) и измеряли оптическую плотность (А280). Фракции, содержащие белки, объединяли и проводили диализ против PBS с двукратной сменой буфера.
[65]Пример 5. Получение, продукция и очистка химерного антитела H5-Fc, представляющего собой однодоменное антитело ламы Н5, слитое с Fc-фрагментом IgG1 человека.
[66]Для получения химерного антитела H5-Fc на первом этапе была проведена амплификация кДНК последовательности, кодирующей однодоменное антитело ламы Н5, с использованием метода ПЦР. Затем эта последовательность была клонирована по сайтам Agel-Apal в эукариотический экспрессирующий вектор pCDH3, содержащий последовательность Fc-фрагмента IgG1 человека. В результате был получен вектор pCDH3-H5-Fc' содержащий нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 4), кодирующую химерные H5-Fc' цепи (SEQ ID NO: 2), которые при экспрессии в эукариотической системе самостоятельно объединяются по двум S-S мостиками и формируют димер (H5-Fc')2, который мы называем химерным антителом H5-Fc (Фиг. 1Б, Фиг. 3).
[67]Экспрессирующие конструкции pCDH3-H5-Fc'' доставляли в клетки НЕК293Т с использованием кальций-фосфатной трансфекции (Kutner R. Н., Zhang X. Y., Reiser J. Nat Protoc. 2009; 4(4):495-505. doi: 10.1038/nprot.2009.22). Через 8 ч среду IMDM с добавлением 10% FBS для выращивания клеток заменяли бессывороточной средой EX-CELL (Сигма-Олдрич, США) для НЕК293 клеток. Трансфицированные клетки выдерживали в течение 6 дней в СО2-инкубаторе при 37°С, 5% CO2. Клеточные супернатанты, очищенные от клеточного дебриса кратким центрифугированием, фильтровали через 0,22 мкм PES-фильтр (ТРР, Швейцария), а белковые продукты очищали на колонке с агарозой с белком A (McLab, США, #РРА-503) в соответствии с инструкциями производителя. Затем элюат с химерным антителом H5-Fc диализовали в течение ночи против PBS и концентрировали с использованием концентраторов Ultra-15 Ultracel-IOOK (Amicon) до конечной концентрации 2 мг/мл.
[68]Чистоту белковых проб контролировали, проводя 15% акриламидный гель-электрофорез (ДСН-ПААГ). Из Фиг. 4 видно, что полученные препараты однодоменного антитела ламы Н5 и химерного антитела H5-Fc имеют достаточную чистоту для их дальнейшего использования в in vitro и in vivo приложениях.
[69]Пример 6. Демонстрация специфического связывания однодоменного антитела ламы Н5 и химерного антитела H5-Fc с RBD-доменом S-белка SARS-CoV-2 вируса дикого типа.
[70]Конкурентный ИФА проводили для определения эффективности нейтрализации взаимодействия RBD-ACE2 одно доменным антителом ламы Н5. Для этого в лунках микропланшета иммобилизовали растворимый рекомбинантный АСЕ2, в которые затем добавляли смесь однодоменного антитела и биотинилированного рекомбинантного RBD. После тщательной промывки в лунки добавляли конъюгат Streptavidin-HRP (1:1000). Ферментативную реакцию проводили в субстратном буфере до проявления цветовой индикации. Результаты реакции оценивали визуально, а в числовом виде получали с помощью микропланшетного спектрофотометра Multiskan GO (Thermo Scientific) при длине волны 491 нм (Фиг. 5). Из Фиг. 5 видно, что однодоменное антитело ламы Н5 блокирует взаимодействие ACE2-RBD, в отличие от нерелевантного однодоменного антитела А10.
[71]Кинетику связывания однодоменного антитела ламы Н5 и химерного антитела H5-Fc с рекомбинантным RBD SARS-CoV-2 дикого типа (Wuhan-1) анализировали на приборе Octet RED96 (ForteBio, Pall LifeSciences, NewYork, NY, США). Рекомбинантный RBD SARS-CoV-2 биотинилировали с помощью EZ-Link™ NHS-LC-LC-Biotin (#21343, ThermoFisher Scientific, США) и иммобилизовали на SA-сенсоре, далее инкубировали с EZ-Link™ Biocytin (#28022, ThermoFisher Scientific, США) для блокировки неспецифического связывания. Нагруженные сенсоры тестировали против панели из трех концентраций однодоменного антитела ламы Н5 (6 нМ, 12 нМ, 20 нМ). Параллельно рекомбинантный RBD SARS-CoV-2 иммобилизовали на NTA-сенсоры (18-5101, ForteBio), которые тестировали против панели концентраций химерного антитела H5-Fc (1,3 нМ, 2,5 нМ, 4,5 нМ, 9 нМ, 18 нМ, 36 нМ). Обработка данных проводилась с использованием программного обеспечения для сбора данных ForteBiov.l 1.1.1.19 (модель 1:1 с глобальным приближением), R2>0,9, Х2<3. Значения кинетических констант приведены в Таблице 1, где KD - константа диссоциации, kon - кинетическая константа ассоциации, koff- кинетическая константа диссоциации.
[72]
[73]Полученные данные указывают на то, что химерное антитело H5-Fc, как и Н5, специфически распознает RBD SARS-CoV-2. KD взаимодействия однодоменного антитела ламы Н5 с RBD SARS-CoV-2 находится ниже пикомолярных значений и однодоменное антитело ламы Н5 может быть охарактеризовано как ультра-аффинное. В сравнении с прототипом (однодоменное антитело р2 с5, KD=2,8×10-9 М), аффинность связывания однодоменного антитела ламы Н5 с RBD-доменом S-белка SARS-CoV-2 не менее чем в 2800 выше. Химерное антитело H5-Fc сравнить с прототипом (p2c5-fc) не представляется возможным из-за отсутствия данных о константе равновесной диссоциации для взаимодействия p2c5-fc с RBD. Стоит отметить, что, строго говоря, наличие специфического взаимодействия с RBD-доменом S-белка SARS-CoV-2 для прототипа p2c5-fc не показано.
[74]Пример 7. Демонстрация способности однодоменного антитела ламы Н5 и химерного антитела H5-Fc нейтрализовать лентивирусные частицы, псевдотипированные S-белком SARS-CoV-2 различных вариантов, in vitro в культуре клеток.
[75]Лентивирусные частицы, псевдотипированные S-белком SARS-CoV-2, получали способом, описанным ниже. Клетки НЕК293Т трансфицировали в молярном отношении 4:6:3 смесью плазмид psPAX2, pLV-EGFP и pCAGGS-SpikeA19, кодирующей укороченный S-белок либо дикого типа, либо мутантного варианта. Через восемь часов после трансфекции культуральную среду заменяли средой Opti-Mem (Gibco, Thermo Fisher Scientific) с добавлением 2,5% термоинактивированной FBS (Gibco, Thermo Fisher Scientific). Через 48 часов супернатанты собирали и предварительно очищали низкоскоростным центрифугированием и фильтрацией через фильтр 0,45 мкм. Затем псевдотипированные лентивирусные частицы концентрировали центрифугированием.
[76]Полученные лентивирусные частицы использовали для трансдукции клеток АСЕ2-НЕК293Т в присутствии различных концентраций нейтрализующих антител. Клетки АСЕ2-НЕК293Т, стабильно экспрессирующие АСЕ2 человека, высевали в культуральный планшет в день начала анализа нейтрализации. Антитела серийно разводили в Opti-MEM+2,5% FBS в два этапа до концентраций в диапазоне от 0,5 нг/мл до 1 мкг/мл и совместно инкубировали с 20 тыс.S-псевдотипированньгх лентивирусных частиц перед трансдукцией. Смесь антитело/8-псевдотипированный лентивирус добавляли к клеткам АСЕ2-НЕК293Т, и планшет возвращали в инкубатор с СО2. Через 72 часа после трансдукции процент трансдуцированных (GFP+) клеток измеряли с помощью проточной цитометрии. Полумаксимальную ингибирующую концентрацию (IC50) определяли с помощью нелинейной регрессии как концентрацию антитела, которая нейтрализовала 50% псевдотипированного лентивируса. Были использованы данные двух независимых экспериментов. В таблице 2 продемонстрирована способность антитела ламы Н5 и химерного антитела H5-Fc нейтрализовать лентивирусы, псевдотипированных S-белками SARS-CoV-2 вируса разных вариантов.
[77]
[78]Из полученных результатов видно, что химерное антитело H5-Fc, несмотря на худшую константу диссоциации KD, чем у однодоменного антитела ламы Н5, нейтрализует лентивирусные частицы, псевдотипированные S-белком SARS-CoV-2 дикого типа, в чуть меньшей концентрации. Однако, стоит учесть, что молекулярная масса химерного антитела H5-Fc примерно в 6 раз больше, чем у антитела ламы Н5, таким образом в молярном выражении, H5-Fc действует значительно эффективнее, чем Н5 (числовые значения показаны в квадратных скобках). Большая эффективность нейтрализации у химерного антитела H5-Fc может объясняться наличием двух паратопов, а также большими физическими размерами. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о том, что однодоменное антитело ламы Н5, а следовательно и химерное антитело H5-Fc, способны нейтрализовать не только вирусные частицы, несущие S-белок дикого типа (Wu-1), но и его мутантные варианты. Данные об псевдовирус-нейтрализующей активности у антител-прототипов (однодоменное антитело р2 с5 и фьюжн-антитело p2c5-fc) отсутствуют.Также для прототипов отсутствуют данные о нейтрализации вариантов SARS-CoV-2 вируса.
[79]Пример 8. Демонстрация способности однодоменного антитела ламы Н5 и химерного антитела H5-Fc нейтрализовать вирус SARS-CoV-2 дикого типа in vitro в культуре клеток.
[80]Анализ нейтрализации вируса в микрокультуре проводили в 96-луночных планшетах (Costar) с использованием в качестве мишеней клеток VeroE6, выращенных в среде DMEM+5% FCS (Nurtop Е., Villarroel P. М. S., Pastorino В. et al. Virol J. 2018;15(1):192. doi: 10.1186/sl2985-018-1105-5). Равный объем серийно разбавленных антител смешивали с вирусным супернатантом (100 TCID50 (50% инфекционная доза культуры ткани)/100 мкл) и оставляли при 37°С на 1 час. Затем смесь вирус/антитело (100 мкл) переносили в лунки с монослоем клеток VeroE6. На 5-7-е сутки после инфицирования лунки визуально просматривали под инвертированным микроскопом. IC100 определяли как самую низкую концентрацию антитела, обеспечивающую полную защиту от 100 TCID50 в 100 мкл. В таблице 3 представлена вируснейтрализующая активность полученных антител в отношении SARS-COV-2 дикого типа
[81]
[82]Для проводимых экспериментов использовали изолят hCoV-19/Russia/Moscow-PMVL-12/2020 (EPI_ISL_572398) (D614G, S686del, V687I). Полученные данные показывают, что однодоменное антитело ламы Н5 и химерное антитело H5-Fc нейтрализуют живой вирус примерно с одинаковой эффективностью (~0,1 нМ), что сравнимо с таковой у прототипа р2 с5 (5 нг/мл, ~0,06 нМ).
[83]Пример 9. Демонстрация способа экстренной профилактики и терапии заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2 дикого типа in vivo на модели золотистого хомячка с использованием химерного антитела H5-Fc
[84]Для исследований защитных свойств химерного антитела H5-Fc на животных были использованы самки сирийских хомяков. Использовали две схемы, профилактическую (введение антитела за 24 часа до инфицирования) и терапевтическую (6 часов после), в каждой - по 2 группы животных (n=5), которым внутрибрюшинно вводили H5-Fc или общий IgG человека (отрицатательный контроль) в количестве 10 мг/кг веса. В качестве положительно контроля использовали профилактическую схему с использованием ранее полученного iB14 моноклонального антитела человека, нейтрализующего SARS-CoV-2 (Gorchakov A. A., Kulemzin S. V., Guselnikov S. V. et al. Cell Discov. 2021;7(1):96. doi: 10.1038/s41421-021-00340-8). В нулевой точке (инфицирование) вводили интраназально (50 мкл/ноздрю) SARS-CoV-2 в общей дозе 1,3×103 бляшкообразующих единиц, изолят SARS-CoV-2/human/RUS/Nsk-FRCFTM-1/2020 (EPIJSL 481284) (D614G). Животных ежедневно взвешивали (Фиг. 6). Через 5 дней после инфекции животных подвергли эвтаназии и извлекали из них легкие для количественного определения вирусной нагрузки (Фиг. 7).
[85]Половину левой доли легкого хомячка взвешивали, помещали в раствор ЛИРА (Biolabmix) и хранили на холоде. Затем образцы тщательно гомогенизировали и выделяли РНК в соответствии с инструкциями производителя раствора. Набор для синтеза кДНК RevertAid (Thermo Scientific) использовали для превращения 1 мг суммарной РНК в кДНК с использованием случайных праймеров-гексамеров. RT-qPCR проводили с использованием кДНК в разведении 1:10 в качестве матрицы и двух наборов праймеров, специфичных для генов RdRp и Е SARS-CoV-2 (Corman V.M., Landt О., Kaiser М, et al. Euro Surveill. 2020;25(3):2000045. doi: 10.2807/1560-7917.ES.2020.25.3.2000045). Праймеры, обнаруживающие транскрипты RpU8 хомячка (Zivcec M., Safronetz, D., Haddock, E. et al. J. Immunol. Methods 2011;368, 24-35), использовали для нормализации. Каждый RT-qPCR анализ выполняли в трех повторениях с двумя техническими повторами, и каждый анализ включал отрицательные контроли без матрицы.
[86]Вышеприведенные данные показывают, что однодоменное антитело ламы Н5 и химерное антитело H5-Fc в концентрациях 10 мг/1 кг веса животного эффективно предотвращают появление клинических признаков заражения SARS-CoV-2 (потеря веса) на модели сирийского хомячка в профилактической и терапевтической моделях (Фиг. 6). Такие же результаты демонстрирует прототип p2c5-fc, однако только в профилактической схеме, терапевтический же эффект не был исследован. Кроме того, стоит отметить, что в качестве отрицательного контроля прототипа (плацебо) был использован фосфатно-солевой буфер, что оставляет вопрос о том, какая конкретно часть p2c5-fc молекулы отвечает за отсутствие клинических проявлений SARS-CoV-2 инфекции у хомячков, т.е. является ли это р2 с5-специфическим ответом. В нашей схеме в качестве отрицательного контроля был использован суммарный IgG человека, обладающий Fc-частью, что разрешает эту проблему.
[87]Для прототипа p2c5-fc также было показано протективное действие на модели АСЕ2-трансгенных мышей, заражаемых SARS-CoV-2 инфекцией. Эта модель хороша тем, что является летальной, то есть оказываемый эффект дискретен (выживание/смерть), но, в то же время, не лишена и недостатков. Так, она не соответствует тканевому распределению АСЕ2 в организме человека - у мыши АСЕ2 эксперссируется повсеместно и животные гибнут не только от поражения легких, но даже в большей степени головного мозга и почек. В заявляемом решении отказались от этой модели и изучали изменение вирусной нагрузки в легких тех же сирийских хомячках, для которых мы наблюдали динамику изменения веса. Данные количественного анализа содержания РНК вируса SARS-CoV-2 в легких хомячков на 5 день после заражения показали, что и в профилактической, и в терапевтической схеме введения химерного антитела H5-Fc вирусная нагрузка падает в 10000 раз по сравнению с контролем, в случае профилактики - практически до 0 (Фиг. 7). Таким образом, можно заключить, что химерное антитело H5-Fc обладает сходными протективными свойствами с прототипом р2 с5 в профилактической схеме, но дополнительно работает в терапевтической схеме на модели сирийского хомячка.
[88]Таким образом, можно заключить, что созданные однодоменное антитело ламы Н5 и химерное антитело H5-Fc лишены недостатков прототипа и могут быть использованы для профилактики и терапии заболевания человека, вызываемого вирусом SARS-CoV-2.
[89]Предлагаемые однодоменное антитело ламы Н5 и химерное антитело H5-Fc по сравнению с прототипом обладают следующими преимуществами: 1) более высокая вируснейтрализующая активность однодоменного антитела ламы Н5 по отношению к живому вирусу SARS-CoV-2; 2) более высокая аффинность по отношению к RBD SARS-CoV-2 дикого типа; 3) более широкие функциональные возможности за счет способности созданных антител нейтрализовать вирус SARS-CoV-2 разных вариантов, что позволяет использовать их для профилактики и терапии заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 разных штаммов.
[91]Перечень последовательностей
[92]<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
[93]<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
[94]1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
[95]<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Перечень
[96]последовательностей H5 H5-Fc CDR.xml" softwareName="WIPO Sequence"
[97]softwareVersion="2.0.0" productionDate="2022-06-08">
[98] <ApplicantFileReference>1</ApplicantFileReference>
[99] <ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное
[100]бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии
[101]Сибирского отделения Российской академии наук (ИМКБ СО
[102]РАН)</ApplicantName>
[103] <ApplicantNameLatin>Institute of Molecular and Cellular Biology,
[104]Siberian Branch of Russian Academy of Sciences</ApplicantNameLatin>
[105] <InventionTitle languageCode="ru">Однодоменное антитело ламы H5 и
[106]его производное Н5-Fc, специфически связывающие RBD-домен S-белка
[107]вируса SARS-CoV-2, обладающие вируснейтрализующей
[108]активностью</InventionTitle>
[109] <SequenceTotalQuantity>7</SequenceTotalQuantity>
[110] <SequenceData sequenceIDNumber="1">
[112] <INSDSeq_length>157</INSDSeq_length>
[113] <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
[114] <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
[115] <INSDSeq_feature-table>
[117] <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
[118] <INSDFeature_location>1..157</INSDFeature_location>
[119] <INSDFeature_quals>
[121] <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
[122] <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
[125] <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
[126] /INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
[128] </INSDFeature_quals>
[130] </INSDSeq_feature-table>
[131] <INSDSeq_sequence>MAQVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYTIGWFRQAPGKEREG
[132]VSCISSRDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMDNLKPEDTAVYYCATTPLTPYGSSWHPNCGSDYA
[133]VNYWGQGTQVTVSSRGRYPYDVPDYGAAHHHHHHNGRA</INSDSeq_sequence>
[136] <SequenceData sequenceIDNumber="2">
[138] <INSDSeq_length>365</INSDSeq_length>
[139] <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
[140] <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
[141] <INSDSeq_feature-table>
[143] <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
[144] <INSDFeature_location>1..365</INSDFeature_location>
[145] <INSDFeature_quals>
[147] <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
[148] <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
[151] <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
[152] <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
[154] </INSDFeature_quals>
[156] </INSDSeq_feature-table>
[157] <INSDSeq_sequence>QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTLDYYTIGWFRQAPGKEREGVS
[158]CISSRDGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMDNLKPEDTAVYYCATTPLTPYGSSWHPNCGSDYAVN
[159]YWGQGTQVTVSSGPEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDP
[160]EVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG
[161]QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT
[162]VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK</INSDSeq_sequence>
[165]</ST26SequenceListing>
[166]<SequenceData sequenceIDNumber="3">
[168] <INSDSeq_length>474</INSDSeq_length>
[169] <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
[170] <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
[171] <INSDSeq_feature-table>
[173] <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
[174] <INSDFeature_location>1..474</INSDFeature_location>
[175] <INSDFeature_quals>
[177] <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
[178] <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
[181] <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
[182] /INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
[184] </INSDFeature_quals>
[186] </INSDSeq_feature-table>
[187] <INSDSeq_sequence>ATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTG
[188]GGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTGGATTATTATACCATAGGCTGGTTCCG
[189]CCAGGCCCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCTCATGTATTAGTAGTAGGGATGGTAGCACATACTATGCA
[190]GACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGGACA
[191]ACCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGACGACCCCACTAACCCCGTACGGTAGTAGCTG
[192]GCACCCAAACTGCGGTTCAGACTATGCGGTTAACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA
[193]CGCGGCCGCTACCCGTACGACGTTCCGGACTACGGTGCCGCACATCATCATCACCATCACAACGGCCGAG
[194]CATAG</INSDSeq_sequence>
[197] <SequenceData sequenceIDNumber="4">
[199] <INSDSeq_length>1098</INSDSeq_length>
[200] <INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
[201] <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
[202] <INSDSeq_feature-table>
[204] <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
[205] <INSDFeature_location>1..1098</INSDFeature_location>
[206] <INSDFeature_quals>
[208] <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
[209] <INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
[212] <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
[213] <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
[215] </INSDFeature_quals>
[217] </INSDSeq_feature-table>
[218] <INSDSeq_sequence>CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTGCAGCCTGGGGGGT
[219]CTCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTGGATTATTATACCATAGGCTGGTTCCGCCAGGC
[220]CCCAGGGAAGGAGCGCGAGGGGGTCTCATGTATTAGTAGTAGGGATGGTAGCACATACTATGCAGACTCC
[221]GTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGGACAACCTGA
[222]AACCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCGACGACCCCACTAACCCCGTACGGTAGTAGCTGGCACCC
[223]AAACTGCGGTTCAGACTATGCGGTTAACTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCGGGCCCA
[224]GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGT
[225]CAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGT
[226]GGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT
[227]AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCC
[228]TGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCAT
[229]CGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGG
[230]GAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG
[231]TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGG
[232]CTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC
[233]TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCCCCGGGTAAATGA<
[237]</ST26SequenceListing>
[238] <SequenceData sequenceIDNumber="5">
[240] <INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>
[241] <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
[242] <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
[243] <INSDSeq_feature-table>
[245] <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
[246] <INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>
[247] <INSDFeature_quals>
[249] <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
[250] <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
[253] <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
[254] <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
[256] </INSDFeature_quals>
[258] </INSDSeq_feature-table>
[259] <INSDSeq_sequence>GFTLDYYT</INSDSeq_sequence>
[262]</ST26SequenceListing>
[263] <SequenceData sequenceIDNumber="6">
[265] <INSDSeq_length>8</INSDSeq_length>
[266] <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
[267] <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
[268] <INSDSeq_feature-table>
[270] <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
[271] <INSDFeature_location>1..8</INSDFeature_location>
[272] <INSDFeature_quals>
[274] <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
[275] <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
[278] <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
[279] <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
[281] </INSDFeature_quals>
[283] </INSDSeq_feature-table>
[284] <INSDSeq_sequence>ISSRDGST</INSDSeq_sequence>
[287]</ST26SequenceListing>
[288] <SequenceData sequenceIDNumber="7">
[290] <INSDSeq_length>24</INSDSeq_length>
[291] <INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
[292] <INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
[293] <INSDSeq_feature-table>
[295] <INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
[296] <INSDFeature_location>1..24</INSDFeature_location>
[297] <INSDFeature_quals>
[299] <INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
[300] <INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
[303] <INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
[304] <INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
[306] </INSDFeature_quals>
[308] </INSDSeq_feature-table>
[309]<INSDSeq_sequence>ATTPLTPYGSSWHPNCGSDYAVNY</INSDSeq_sequence>
[312]</ST26SequenceListing>
