[1]Изобретение относится к медицине, а именно, к педиатрии и кардиологии, и позволяет выявлять лиц с предрасположенностью к преждевременному развитию атеросклероза с прогрессирующим течением, с целью постановки их на диспансерный учет для раннего начала профилактических, и лечебных мероприятий, позволяет упростить диагностику гетерозиготной семейной гиперхолестеринемии.
[2]Семейная гиперхолестеринемия (СГХС) — моногенное заболевание, преимущественно, с аутосомно-доминантным типом наследования, сопровождающееся значительным повышением уровня холестерина липопротеидов низкой плотности (ЛПНП) в крови и, как следствие, преждевременным развитием и прогрессирующим течением атеросклероза, как правило, в молодом возрасте [1, 2].
[3]В настоящее время существует два алгоритма выявления больных с семейной гиперхолестеринемией: 1) анализ фенотипа и 2) исследование генотипа.
[4]Анализ фенотипа включает в себя сбор анамнестических (наличие наследственной отягощенности по сердечно-сосудистым заболеваниям атеросклеротического генеза), клинических (определение признаков гиперхолестеринемии при физикальном осмотре - ксантома сухожилий, липоидная дуга роговицы, ксантеллазмы), и лабораторных данных (увеличение общего холестерина и липопротеинов низкой плотности).
[5]Анализ генотипа включает в себя проведение генетического тестирования на предмет выявления мутаций в генах, ответственных за моногенную форму СГХС: в гене рецептора ЛПНП (до 95% случаев), аполипопротеина В-100 (4-5%) и пропротеинконвертазы субтилизин/кексин 9-го типа (1%). В ряде случаев семейная гиперхолестеринемия имеет аутосомно-рецессивное наследование, и связано с мутацией в гене адаптивного белка LDLR 1 (LDLRAP1) [3].
[6]На основании этих подходов, существуют британские (Simon Broom Registry) и голландские (DLCN – Dutch Lipid Clinic Network) критерии диагностики семейной гиперхолестеринемии, основанные на фенотипических, семейных анамнестических данных и генетических признаках [1].
[7]Многочисленные исследования подчеркивают роль ЛПНП в качестве основного фактора риска развития атеросклероза, лежащего в основе сердечно-сосудистых катастроф. «Классический» взгляд на патогенез этого процесса заключается в том, что ЛПНП является основным компонентом атероматозной бляшки.
[8]В последние годы в центре внимания исследователей, наряду с ЛПНП, находятся вопросы, связанные с изучением аполипопротеинов, которые являются важными структурными, и функциональными, белками в частицах липопротеинов.
[9] Аполипопротеины группы А - это главные белковые компоненты липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) [4]. Примерно 70% ЛПВП представлено аполипопротеином А, поэтому число циркулирующих ЛПВП в значительной степени определяется концентрацией АпоА. В ряде исследований выявлено, что АпоА1 стабилизирует антиатерогенные частицы ЛПВП, и управляет их метаболизмом и функциональными взаимодействиями [4]. Показано, что у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями концентрация этого аполипопротеина достоверно ниже, по сравнению со здоровыми людьми [5]. Повышение уровня АпоА рассматривается в качестве предиктора снижения риска сердечно-сосудистых заболеваний [6].
[10] Другим важным аполипопротеином является аполипопротеин Б (АпоБ), включающий в себя АпоБ-100 и АпоБ-48. Уровень АпоБ отражает общее количество потенциально атерогенных частиц, в том числе, липопротеинов очень низкой плотности, липопротеинов промежуточной плотности, ЛПНП [7]. В работе Ohwada T и соавт. 2019г., приводят прямые корреляционные связи концентрации АпоБ, в частности >91мг/дл, и размера атеросклеротической бляшки коронарных артерий, измеренной путем внутрисосудистого ультразвукового исследования [8]. При этом авторы также обосновывают вероятность увеличения нестабильности бляшки при увеличении уровня АпоБ. Benn M. и соавт. показали, что концентрация АпоБ с высокой вероятностью прогнозирует ишемические сердечно-сосудистые события лучше, чем ЛПНП [9].
[11]В последние годы, ввиду высокой информативности прогностической значимости аполипопротеинов А и Б в диагностике липидных нарушений, некоторыми учеными предложено использовать уровень АпоА1 вместо традиционного ЛПВП [4], а рекомендации Канадского сердечно-сосудистого общества включают АпоБ в качестве альтернативы оценки ЛНП [10]. Исходя из этого, представляет ценность определение соотношения АпоБ/АпоА для оценки траектории атерогенных липидных нарушений, и выявления дислипидемий, в том числе, первичного генеза.
[12]Представленные ранее критерии диагностики СГХС (Голландские, Британские) трудоемки – требуют подробного сбора семейного анамнеза, физикального осмотра врачом пациента и его родственников, измерения в сыворотке крови общего холестерина, ЛПНП, а также генетического тестирования.
[13]Сущность настоящего изобретения состоит в совокупности существенных признаков, обеспечивающей достижение искомого технического результата, состоящего в создании более простого в исполнении способа диагностики гетерозиготной семейной гиперхолестеринемии в детском возрасте, требующего меньших затрат времени, и финансовых средств.
[14]Нами было обследовано 243 ребенка в возрасте от 5 до 17 лет (медиана 11 [7,0 – 15,0]), из них 122 ребенка - с диагнозом «семейная гиперхолестеринемия», вошедшие в основную группу. Контрольную группу составил 121 здоровый ребенок.
[15]Критерии включения детей в основную группу:
[16]– возраст пациента от 5 до 17 лет 11 месяцев и 29 дней включительно;
[17]– установленный диагноз «Гетерозиготная форма семейной гиперхолестеринемии» в соответствии с клиническими рекомендациями, согласно критериям Simon Broome Registry [1];
[18]– информированное согласие на участие в проводимом исследовании детей и/их родителей.
[19]Критерии исключения детей основной группы:
[20]– возраст пациента менее 5 и более 17 лет 11 месяцев и 29 дней;
[21]– основные заболевания/состояния, а также лекарственные препараты, которые могут обусловливать вторичное повышение ЛПНП (холестаз, нефротический синдром, хроническая болезнь почек, сахарный диабет, гипотиреоз, ожирение, синдром Кушинга; лекарственные средства – циклоспорин, диуретики, глюкокортикоиды, амиодарон, иммунодепрессанты, комбинированные оральные контрацептивы, антивирусная терапия при ВИЧ).
[22]Всем детям проводили оценку липидограммы: общий холестерин - ОХ, липопротеины высокой плотности - ЛПВП, липопротеины низкой плотности - ЛПНП, триглицериды - ТГ, аполипопротеин А1 – АпоА1, аполипопротеин Б – АпоБ. Результаты сведены таблицу 1.
[23]Таблица 1. Липидный профиль детей основной и контрольной групп
[24]| Показатель | Здоровые
Ме(Q1-Q3) | СГХС
Ме(Q1-Q3) | p |
| ОХ, ммоль/л | 3,60 (3,30‒4,10) | 7,30 (6,96‒7,74) | <0,0001* |
| ЛПВП, ммоль/л | 1,20 (1,10‒1,27) |
1,30 (1,10‒1,40) | <0,0001* |
| ЛПНП, ммоль/л | 2,20 (1,90‒2,43) | 5,20 (4,90‒5,77) | <0,0001* |
| ТГ, ммоль/л | 1,00 (0,78‒1,20) | 1,10 (0,90‒1,30) | 0,0175* |
| АпоА1 (мг/дл) | 128 (119‒140) | 118 (110‒127) | <0,0001* |
| АпоВ(мг/дл) | 68 (58‒77) | 98 (87‒110) | <0,0001* |
| АпоВ/АпоА1 |
0,51 (0,45‒0,60) |
0,84 (0,72‒0,93) | <0,0001* |
[25]p-значение получено с использованием теста Манна-Уитни
[26]Количественное определение АпоА1, АпоБ в сыворотке крови проводили иммунотурбидиметрическим методом на автоматическом анализаторе Beckman Coulter AU5800, c использованием набора реактивов Apolipoprotein А1, Apolipoprotein B «Beckman Coulter» (США). После проведения калибровки, визуально оценивали полученную кривую на анализаторе Beckman Coulter. Сразу после калибровки, в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики, проводили измерение контроля качества. При смешивании пробы с буфером R1 и раствором антисыворотки R2, АпоА1 и АпоБ специфически связываются с антителами к человеческому АпоА1 и АпоБ, в результате чего образуются нерастворимые агрегаты. Интенсивность поглощения агрегатов пропорциональна концентрации АпоА1 и АпоБ в пробе. Единица измерения мг/дл. После определения количественных показателей АпоА1 и АпоБ, вычисляли соотношение АпоБ/АпоА1.
[27]Статистический анализ проводился с использованием программы StatTech v.1.2.0 (разработчик – ООО «Статтех», Российская Федерация). Количественные данные были подвергнуты статистической обработке с использованием параметрических или непараметрических методов в зависимости от результатов проверки на нормальность распределения, проводимой с помощью критерия Шапиро-Уилка. Ввиду распределения, отличного от нормального, количественные данные описывались при помощи значений медианы (Me), нижнего и верхнего квартилей (Q1-Q3), а сравнение количественных показателей между двумя независимыми группами выполнялось с помощью критерия Манна-Уитни. Различия показателей и выявленные связи считались статистически значимыми при p<0,05.
[28]Анализ параметров проведенной липидограммы по стандартному алгоритму, включающему оценку ОХ, ЛПВП, ЛПНП, ТГ, подтверждает нам отсутствие нарушения липидного обмена в группе здоровых участников (таблица 1). При этом в группе СГХС зарегистрировано увеличение ОХ и ЛПНП, что соответствует критериям диагностики данного заболевания. Анализ содержания АпоА1 и АпоБ в сыворотке крови у исследуемых детей показывает статистически значимое увеличение АпоБ и снижение АпоА1 среди пациентов с СГХС в сравнении со здоровыми сверстниками, что приводит к смещению соотношения АпоБ/АпоА1 в сторону его увеличения у детей с семейной гиперхолестеринемией.
[29]Для оценки дискриминативных характеристик АпоБ/АпоА1 проводился ROC-анализ (Фиг.1). ROC-анализ (от receiver operating characteristic - рабочая характеристика приемника) - полезный способ оценить точность предсказаний модели путем построения графика чувствительности в зависимости от значения теста классификации. Основой данного анализа является построение, так называемой, ROC-кривой, которая наиболее часто используется для представления результатов бинарной классификации в машинном обучении. ROC кривая показывает зависимость количества верно классифицированных положительных примеров от количества неверно классифицированных отрицательных примеров. В результате построения ROC кривой получают набор значений порога отсечения, и соответствующие ему значения чувствительности и специфичности.
[30]Чувствительность теста показывает долю (процент) истинно положительных результатов у всех лиц, имеющих исследуемую патологию; специфичность теста показывает долю (процент) лиц, не имеющих исследуемой патологии (здоровых), у которых результаты теста оказались отрицательными.
[31]Для получения численного значения клинической значимости теста, а также для сравнения двух тестов, используется показатель AUC (Area Under Curve), который может быть рассчитан при помощи численных методов.
[32]С целью оценки информативности соотношения АпоБ/АпоА1 для выявления семейной гиперхолестеринемии была построена ROC-кривая. В качестве критерия диагностической эффективности рассчитывалась площадь под кривой с соответствующим 95% доверительным интервалом. Она составила 0,95 (95% ДИ: 0,93; 0,98) что, согласно экспертной оценке шкалы AUC, соответствует отличному качеству модели, и доказывает ее высокую прогностическую ценность (таблица 2) [11]. Для оценки порога оптимального порогового значения АпоВ/АпоА1 использовалась J-статистика Юдена. В качестве диагностических характеристик использовались чувствительность и специфичность с соответствующими 95% точными доверительными интервалами. Значение соотношения АпоВ/АпоА1 равное 0,645, оказалось оптимальным (чувствительность - 92,6 (95% ДИ: 86,5; 96,6), специфичность – 86,0 (95% ДИ: 78,5; 91,6)) для диагностики гетерозиготной семейной гиперхолестеринемии для детей в возрасте 5-17 лет включительно.
[33]Таблица 2. Экспертная шкала для значений AUC [11].
[34]| Интервал AUC | Качество модели |
| 0,9-1,0 | Отличное |
| 0,8-0,9 | Очень хорошее |
| 0,7-0,8 | Хорошее |
| 0,6-0,7 | Среднее |
| 0,5-0,6 | Неудовлетворительное |
[35]Таким образом, настоящее исследование, проведенное с включением 243 детей (121 здоровый ребенок и 122 ребенка с семейной гиперхолестеринемией), измерением у них в сыворотке крови аполипопротеина А1, аполипопротеина Б, определением соотношения АпоБ/АпоА1 показал, что при значении соотношения АпоБ/АпоА1, равному 0,645 и выше, диагностируют гетерозиготной семейную гиперхолестеринемию. Выбранный нами способ, не требующий дорогостоящего оборудования, простой в исполнении, является достоверным и высокоинформативным в диагностике гетерозиготной семейной гиперхолестеринемии в детском возрасте, что подтверждается показателем AUC, равным 0,95, высокой чувствительностью (92,6 (95% ДИ: 86,5; 96,6)), и специфичностью (86,0 (95% ДИ: 78,5; 91,6)), доказывающим высокую прогностическую силу представленного способа. Его применение в клинической практике позволит значительно упростить, ускорить, и удешевить выявление гетерозиготной семейной гиперхолестеринемии. Использование настоящего способа допускает диагностику СГХС без сбора семейного анамнеза, оценки липидограммы, проведения сложного, дорогостоящего и, занимающего достаточно много времени, генетического тестирования.
[36]Сущностьспособа диагностики гетерозиготной семейной гиперхолестеринемии в детском возрасте по соотношению в сыворотке крови аполипопротеина Б к аполипопротеину А1 включает физикальный осмотр пациента. Определяют в сыворотке крови уровень аполипопротеина А1, аполипопротеина Б, вычисляют соотношение АпоБ/АпоА1, и при значении, равном 0,645, и выше, диагностируют гетерозиготной семейную гиперхолестеринемию.
[37]Способ осуществляют следующим образом.
[38]Проводят физикальный осмотр пациента, определяют в сыворотке крови уровень аполипопротеина А1, аполипопротеина Б, вычисляют соотношение АпоБ/АпоА1, и при значении, равном 0,645, и выше, диагностируют семейную гиперхолестеринемию.
[39]Клинический пример 1.
[40]Родители ребенка Б., 8 лет, обратились с жалобами на стойкие изменения в липидограмме в виде гиперхолестеринемии до 10,1 ммоль/л, ЛПНП до 6,07 ммоль/л.
[41]Проведен врачебный осмотр ребенка. Вторичные причины гиперлипидемии исключены. Ожирение, артериальная гипертензия не отмечались. Проведено определение аполипопротеинов А и Б в сыворотке крови, вычисление их соотношения. Результаты показали, что уровень АпоА1 составил 136 мг/дл, уровень АпоБ 102 мг/дл, соотношение АпоБ/АпоА1= 0,75. Согласно представленному способу, при значении АпоБ/АпоА1, равному 0,645 и выше, диагностируют семейную гиперхолестеринемию.
[42]Генетическое тестирование выявило наличие мутации в экзоне 6 гена LDLR (NM_000527, MIM_143890, Hypercholesterolemia, familial, 1_аутосомно доминантный тип наследования) – гетерозиготная замена, имеющая патогенетический характер. Далее ребенок был взят на диспансерный учет врачом детским кардиологом в условиях специализированной липидологической клиники. Ему проведены расширенные инструментальные исследования сердечно-сосудистой системы (ультразвуковое исследование сердца, ультразвуковое исследование сосудов шеи, суточное мониторирование артериального давления с оценкой ригидности сосудов) с целью оценки ранних признаков атеросклеротического поражения сосудов и начала профилактических мероприятий. Пациенту даны рекомендации по особенностям диеты и физической нагрузки.
[43]Клинический пример 2.
[44]Ребенок Р., 13 лет, обратился в детский стационар с целью планового медицинского осмотра. Во время физикального врачебного осмотра ожирение, артериальная гипертензия были исключены. В липидограмме отмечалось значимое повышение уровня общего холестерина до 7,27 ммоль/л и ЛПНП до 5,52 ммоль/л. Результаты измерения аполипопротеинов в сыворотке крови показали, что уровень АпоА1 составил 134 мг/дл, уровень АпоБ 65 мг/дл, соотношение АпоБ/АпоА1 0,48. Согласно представленному способу, при значении АпоБ/АпоА1, равному 0,645 и выше, диагностируют семейную гиперхолестеринемию. Учитывая, что у пациента значение АпоБ/АпоА1 было ниже 0,645, семейная гиперхолестеринемия диагностирована не была.
[45]Проведенное генетическое тестирование не выявило генетических вариантов, связанных с моногенными дислипидемиями.
[46]Таким образом, используя предложенный способ диагностики гетерозиготной семейной гиперхолестеринемии, можно диагностировать заболевание без сбора семейного анамнеза, оценки липидограммы и проведения генетического тестирования.
