[1]Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, и касается нового штамма-продуцента антибиотика хлорэремомицина.
[3]Хлорэремомицин - гликопептидный антибиотик класса ванкомицинов, имеет в составе своей структуры три сахара, одну D-глюкозу и два L-4-эпи-ванкозамина, присоединенные к сшитому гептапептидному остову тремя гликозилтрансферазами, GtfA, -B и –C (Lu W, et al. Characterization of a regiospecific epivancosaminyl transferase GtfA and enzymatic reconstitution of the antibiotic chloroeremomycin// Proc Natl Acad Sci U S A.- 2004 Mar 30.-101(13):4390-5. Epub 2004 Mar 18).
[4]Хлорэремомицин является предшественником полусинтетического антибиотика оритаванцина (Wang, W.-Y. et al. Enhancement of A82846B yield and proportion by overexpressing the halogenase gene in Amycolatopsis orientalis SIPI18099, Appl. Microbiol. Biotech.- 2018.- P.5635-5643).
[5]Большинство используемых в медицине антимикробных препаратов разработаны на основе природных метаболитов бактерий и грибов. Актиномицеты, грамположительные мицелиальные бактерии порядка Actinomycetales являются продуцентами таких классов антибиотиков, как макролиды, антрациклины, полиэфирные антибиотики, циклополилактоны, аминогликозиды, стрептотрицины, актиномицины, хиноксалиновые пептиды, гликопептиды и др. Для поиска актиномицетов — продуцентов биологически активных соединений разрабатываются различные методы селективной изоляции новых штаммов (Синёва О.Н. Выделение актиномицетов редких родов — продуцентов антибиотиков из почв с применением сока Aloe arborescens// Антибиотики и Химиотерапия.- 2021.- 66(9-10):4-11).
[6]Известен штамм-продуцент Кibdelosporangium aridum JH100-32B16B промежуточного продукта синтеза оритаванцина, депонированный в Общем центре сбора микробиологических культур Китая (CGMCC) под номером CGMCC №17931 (CN113493748, опубл. 12.10.2021).
[7]Известен рекомбинантный штамм Kibdelosporangium aridum, продуцирующий антибиотик A82846B, который является важным предшественником полусинтетического гликопептидного антибиотика оритаванцина (Тian et al., Enhancing A82846B production by artificial attB-assisted overexpression of orf10-orf11 genes in Kibdelosporangium aridum SIPI-3927. AMB Express. - 2020 Mar 16. - 10(1):52). Указанный штамм рассматривался авторами настоящего изобретения в качестве близкого аналога.
[8]Цель настоящего изобретения - получение нового штамма микроорганизма, превосходящего по уровню накопления хлорэремомицина известные ранее штаммы.
[9]Техническим результатом заявленного изобретения является увеличение продуктивности нового штамма Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184, сокращение времени культивирования, снижение количества примесей в субстанции антибиотика хлорэремомицин, высокая биохимическая активность и повышенная устойчивость нового штамма по настоящему изобретению к неблагоприятным факторам, в том числе, при хранении и культивировании.
[10]СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ.
[11]Из образца дерново–подзолистой почвы (Мордовия) был выделен штамм дикого типа, продуцирующий антибиотик хлорэремомицин.
[12]Для повышения секреции хлорэремомицина штамм дикого типа подвергался процессу индуцированного мутагенеза путем воздействия на него ультрафиолета при низких температурах.
[13]Далее полученный высокопродуктивный штамм, который получил внутреннее наименование CLE 20-36, был идентифицирован по макро- и микроморфологическим признакам, а родовая принадлежность была подтверждена секвенированием гена 16S рРНК.
[14]По результатам анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм CLE 20-36 оказался наиболее близок к виду Kibdelosporangium aridum.
[15]Полученный новый штамм Kibdelosporangium aridum депонирован в Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Ac-2184.
[16]Таким образом, одним из вариантов настоящего изобретения является штамм продуцент хлорэремомицина Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184. Другим вариантом настоящего изобретения является применение штамма Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 для получения антибиотика хлорэремомицина. Еще одним из вариантов настоящего изобретения является способ получения антибиотика хлорэремомицина, который заключается в том, что осуществляют культивирование штамма Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 и выделение хлорэремомицина из культуральной жидкости с последующей очисткой (Фиг.1).
[17]ТЕРМИНЫ и ОПРЕДЕЛЕНИЯ
[18]Ниже приведены термины, которые могут использоваться при описании настоящего изобретения. Если не указано иное, все технические и специальные термины, использованные в описании, имеют общепринятое в данной области техники значение.
[19]Термин «антибиотик» включает в себя любую молекулу, которая может ингибировать рост, разрушать или приводит к гибели микроорганизмов, но не является смертельным для пациента в интервалах концентрации и дозировании, предполагаемых для введения. Согласно настоящему изобретению указанные антибиотики могут быть классифицированы как бактерицидные (т.е., непосредственно приводящие к гибели микроорганизма) или бактериостатические (т.е. предотвращающие деление и/или размножение микроорганизма). В контексте настоящего изобретения антибиотик не является токсичным для пациента, в интервалах вводимых концентраций и дозирования.
[20]Использование термина «антибиотический» в контексте настоящего изобретения означает эффект или тип воздействия в лечении или профилактике инфекций, вызванных грамотрицательными и/или грамположительными бактериями.
[21]Термин «биомасса» в контексте настоящего изобретения относится к совокупной массе клеток Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184, отделенных в процессе центрифугирования от супернатанта культуральной жидкости, полученной в результате культивирования, в том числе, в качалочных колбах или биореакторах (например, при культивировании батарейным способом).
[22]Термин «культуральная жидкость» в контексте настоящего изобретения означает газожидкостную питательную (или ферментационную) среду, в которую в процессе глубинного культивирования микроорганизмы выделяют продукты метаболизма (в т.ч. вторичные метаболиты). Термин «биореактор» в контексте настоящего изобретения относится к сосуду или устройству, в котором осуществляются процесс глубинного культивирования микроорганизмов для наработки целевого продукта (в рамках настоящего изобретения, антибиотика хлорэремомицина).
[23]Термин «продуктивность штамма» в контексте настоящего изобретения относится к количеству полученного антибиотика хлорэремомицина, рассчитанному на единицу объема культуральной жидкости, при глубинном культивировании штамма Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 в условиях биореактора, выраженному в граммах хлорэремомицина на литр культуральной жидкости.
[24]При использовании в описании термина «примерно», «приблизительно», «около» следует считать, что он характеризует плюс минус десять процентов от указанной величины.
[25]КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[26]Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано посредством Фиг. 1.
[27]На Фиг. 1 изображены основные этапы скрининга штамма Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 и наработки хлорэремомицина из его культуральной жидкости, полученной после глубинного культивирования.
[28]РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[29]Согласно настоящему изобретению предложен новый штамм продуцент хлорэремомицина - штамм Kibdelosporangium aridum депонирован в Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Ac-2184.
[30]Культурально-морфологические признаки: аэроб; окраска по Граму – положительная, при культивировании на плотной среде нижеуказанного состава типичные колонии имеют цвет от светло-бежевого до серо-бежевого, коническую форму, диаметр 3-5 мм, приподняты над агаром, поверхность неровная.
[31]Физиолого-биохимические характеристики: Хорошо утилизирует сахарозу, крахмал, фруктозу, арабинозу, инозит, галактозу, манит, глюкозу; умеренно лактозу, рамнозу, ксилозу, не утилизирует рафинозу. Обладает протеолитической активностью. Восстанавливает нитраты до нитритов.
[32]Для хранения и приготовления посевного материала используется среда следующего состава, г/л: растворимый крахмал –15.0-19.0; глюкоза – 8.0-10.0; дрожжевой экстракт – 3.0-4.0; ферментативный гидролизат казеина – 4.0-4.5; гидрофосфат калия – 0.3 - 0.5; агар-агар - 18.0-21.0; вода очищенная; рН среды 6.7±0.3.
[33]Условия культивирования для выделения единичных колоний- 10-12 суток, при температуре 27-32°С.
[35]Изобретение поясняется следующими иллюстративными примерами, которые не ограничивают заявленный объем охраны.
[36]Пример 1. Способ селективного выделения из штамма - продуцента хлорэремомицина из образца почвы.
[37]Объектами исследования были образцы дерново-подзолистой почвы. Образцы почвы были отобраны в Республике Мордовия в летний период из верхних горизонтов почвы.
[38]Для выделения штамма дикого типа - продуцента хлорэремомицина из образцов почв использовали метод посева на твердые питательные среды. Гомогенизированный образец почвы массой 1 г помещали в колбу со 100 мл стерильной водопроводной воды, далее готовили разведение 1:300 и проводили посев на чашки с питательной средой Гаузе 1. В питательную среду добавляли антибиотики широкого спектра для ограничения роста и активности нежелательных микроорганизмов.
[39]Посевы инкубировали при температурах 20 - 30°С до появления видимых колоний. Чистую культуру выводили путем последовательных пересевов до единичной колонии. Контроль чистоты культуры проводили микроскопически.
[40]Пример 2. Получение высокопродуктивного штамма-продуцента хлорэремомицина.
[41]Путем многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов и направленных методов отбора модификантов родительского дикого штамма был получен новый высокопродуктивный штамм - продуцент хлорэремомицина CLE 20-36.
[42]Для этого осуществляли воздействие УФ с длиной волны 250 нм (лампа Mineralight) водной суспензии спор и клеток родительского штамма, размещенного на расстоянии 55 см от лампы в течение 20 минут при температуре 0oC. Полученному штамму был присвоен внутренний номер CLE 20-36.
[43]Пример 3. Идентификация штамма CLE 20-36 до вида с помощью анализа 16s РНК.
[44]Выделение ДНК штамма CLE 20-36 для ПЦР проводили по стандартной методике (PCR Protocols. A Guide to methods and applications. Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15).
[45]Для секвенирования использовали консервативные праймеры для наработки 16S rDNA:
[46]8f - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
[47]926r - CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT
[48]Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе АЕ3000 с режимами реакции:
[53] 72оС - 1 мин. 30 сек.
[55]Для анализа секвенированных последовательностей использовали специализированные филогенетические компьютерные программы. Для стабильности воспроизведения результатов проводили не менее трех повторов ПЦР-реакций.
[56]Далее проводили электрофорез ПЦР исследуемых образцов в 1,0% агарозном геле, при напряженности электрического поля 5 В/см.
[57]Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам: Bacteria; Actinobacteria; Pseudonocardiales; Pseudonocardiaceae; Kibdelosporangium.
[58]Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank.
[59]Обработку секвенированных последовательностей проводились при помощи биоинформатического программного обеспечения в открытом доступе - программы Blast (Basic Local Alignment Search Tool), предназначенной в т.ч. для определения степени филогенетической близости живых организмов.
[60]По результатам анализа последовательностей вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм CLE 20-36 оказался наиболее близок к виду Kibdelosporangium aridum.
[61]Пример 4. Методика культивирования.
[62]Проводили подготовку посевного материала путем посева культуры Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 в чашках Петри. Для этого агаризованную среду засевали исходной посевной культуры, и выдерживали в термостате от 5 до 12 суток, при температуре 25-34°С.
[63]Далее проводили наработку культуры в колбах в жидкой среде в при 25-34°С в течение 24-48 часов на термостатируемой качалочной установке при 200-300 об/мин.
[64]Далее проводили наработку посевной культуры в ферментере объемом 5/15/100 л, для этого проводили засев ферментера путем внесения посевной культуры в количестве 5-15% от объема среды в ферментере, при непрерывной подаче стерильного воздуха во время культивирования при перемешивании в течении 110-170 часов.
[65]Контроль содержания антибиотика проводили методом ВЭЖХ. При максимальном накоплении антибиотика в среде процесс ферментации прекращали.
[66]Пример 5. Определение содержания хлорэремомицина в культуральной жидкости методом ВЭЖХ.
[67]Анализ содержания хлорэремомицина в культуральной жидкости методом ВЭЖХ проводили на колонке С18, 100 Å, 250*4,6 мм, 5 мкм; подвижная фаза А - 0,1 % ацетонитрила в 0,1 % водном растворе трифторуксусной кислоты. Подвижная фаза В: 0,1 % изопропилового спирта и 0,1 % подвижной фазы А в ацетонитриле скорость потока -1,1 мл/мин; длина волны детектирования – 254 нм.
[68]Полученные данные представлены в таблице 1.
[69]Таблица 1. Выход целевого продукта при глубинном культивировании
[70]| Штамм | Продуктивность штаммов (г/л культуральной жидкости ±0,2 г/л) |
| в ферментере объемом 5 литров | в ферментере объемом 15 литров | в ферментере объемом 100 литров |
Kibdelosporangium aridum VKPM
Ac-2184 | 5,5
5,7
6,4 | 6,8
7,0
7,4 | 15,1
15,8
16,2 |
[71]Согласно литературным данным продуктивность известного штамма Kibdelosporangium aridum составляла 1,45 г/л (CN113493748, опубл. 12.10.2021). А продуктивность генетически модифицированного штамма Kibdelosporangium aridum достигала 2,52 г/л (Тian et al., Enhancing A82846B production by artificial attB-assisted overexpression of orf10-orf11 genes in Kibdelosporangium aridum SIPI-3927. AMB Express. - 2020 Mar.- 16;10(1):52).
[72]Результаты исследований позволяют сделать вывод о том, что штамм микроорганизма по настоящему изобретению обладает высоким биотехнологическим потенциалом, значительно увеличенной продуктивностью и может применяться для промышленного производства антибиотика хлорэремомицина.
[73]Пример 6. Методика выделения хлорэремомицина.
[74]После культивирования микроорганизма Kibdelosporangium aridum VKPM Ac-2184 проводили отделение биомассы от культуральной жидкости центрифугированием. Очищенную от биомассы культуральную жидкость переносили на стадию очистки, а отработанную биомассу утилизировали.
[75]Очищенную от биомассы культуральную жидкость наносили на колонку с гидрофобным сорбентом НР-20. Вытесненный с колонки раствор утилизировали. Колонку промывали очищенной водой. Элюат собирали и переносили порционно в колбу ротационного испарителя. Удаляли растворитель в вакууме при температуре не выше 40 °С. Полученный концентрат снова наносили на колонку с сорбентом НР-20. Колонку промывали очищенной водой. Затем колонку элюировали 50 % водным этанолом с добавлением уксусной кислоты. Контроль осуществляли методом ВЭЖХ/УФ. Элюат фракционировали, отдельные фракции анализировали методом ВЭЖХ. Фракции, содержащие хлорэремомицин с чистотой не менее 80 % объединяли. Менее чистые фракции утилизировали. Очищенный раствор хлорэремомицина депигментировали перемешиванием в течение 30 мин с 0.5 масс. % угля апирогенного. Уголь отделяли фильтрованием через слой силикагеля. Далее раствор хлорэремомицина концентрировали при помощи ротационного испарителя в вакууме до 1/3 от первоначального объема. Концентрат охлаждали, выпавший осадок отделяли фильтрованием.
