[1]ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[2]Изобретение относится к области животноводства, в частности к коневодству и может быть использовано для отбора жеребцов с высоким качеством криоконсервированной спермы.
[4]Холестерин относится к липидам, он циркулирует в крови и используется в качестве строительного компонента для всех клеток организма (Багорова, Н.В. Холестерин и его влияние на организм / Н.В. Багорова // Инновационная наука. - 2017. - №2. - С.209-210.). Известно, что это вещество является важным компонентом клеточных биомембран и, выполняя структурную и функциональную роль, оно влияет на клеточное деление, активность белковых рецепторов плазматических мембран и мембрансвязанных ферментов, стабильность сывороточных липопротеидов и транспортных структур желчи (Тюрюмин, Я.Л. Физиология обмена холестерина / Я.Л. Тюрюмин, В.А. Шантуров, Е.Э. Тюрюмина // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2012. - Т. 84, №2. - С.153-158.). Холестерин также является одним из факторов стабильности мембран сперматозоидов, способствующим их сохранности и адекватной подвижности (Гусякова, О.А. Метаболические характеристики спермальной плазмы с различным числом сперматозоидов / О.А. Гусякова, В.М. Радомская, С.И. Мурский, А.И. Габрильчак, Г.В. Тукманов // Лабораторная служба. - 2008. - Т. 7, №1. - С. 15-19.).
[5]Ближайшим аналогом (прототипом) заявляемого способа является способ оценки качества спермы жеребцов по активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови (Заявка №2021128712/14(060850), МПК G01N 33/49, A61D 99/00 (2006.01); заявл. 30.09.2021; Способ оценки качества спермы жеребцов по активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови / М.М. Атрощенко, А.И. Синякина, A.M. Зайцев, В.В. Калашников, А.А. Незаленова, А.А. Дацышин, М.Г. Енгалычева, A.M. Шитикова, О.В. Широкова; заявитель ФГБ-НУ "ВНИИ коневодства".), в котором в качестве критерия для оценки качества спермы используют уровень активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови. При уровне активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови выше 178 МЕ/л жеребца относят к группе с высоким качеством спермы, а при уровне активности креатинфосфокиназы в сыворотке крови ниже 178 МЕ/л, соответственно, к группе с низким качеством спермы.
[6]Недостатком этого способа является то, что он не дает возможности оценить качество криоконсервированной спермы жеребцов.
[7]Мы поставили задачу изучить влияние концентрации холестерина в семенной плазме на качество криоконсервированной спермы жеребцов, оценив количественно значение предельно допустимой концентрации (ПДК) холестерина в ней. А затем выяснить, какая связь существует между концентрацией холестерина в семенной плазме и качеством криоконсервированной спермы.
[8]Предлагаемый нами способ оценки качества криоконсервированной спермы жеребцов по концентрации холестерина в семенной плазме позволит это сделать, не прибегая к процедуре криоконсервации и последующему оттаиванию спермы, а также избежать проведения световой микроскопии для оценки морфологических показателей эякулята.
[9]РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[10]Образцы спермы, предназначенной для исследования (n равно 32), получают используя известную методику (Науменкова, В.А. Рекомендации по взятию, разбавлению и замораживанию спермы жеребцов / В.А. Науменкова. - Дивово: «Изд-во ВНИИ коневодства», 2006. - 23 с. Далее - Рекомендации). После этого, каждый эякулят оценивают по следующим показателям: объем эякулята, концентрация сперматозоидов.
[11]Затем одну часть эякулята подвергают процедуре криоконсервации - оттаивания, после чего оценивают выживаемость сперматозоидов при Т 2-4°С и определяют количество морфологически нормальных сперматозоидов в сперме, подвергшейся криоконсервации.
[12]Для получения спермоплазмы другую часть эякулята сразу же после получения спермы центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин с помощью центрифуги ELMI СМ-6М (SIA ELMI, Латвия). После световой микроскопии супернатанта, аликвоты семенной плазмы, свободные от сперматозоидов, замораживают при температуре -18°С до проведения исследований.
[13]Определение концентрации холестерина в семенной плазме проводят на биохимическом анализаторе AU 680 (Beckman Coulter, США). Используя полученные результаты и известные рекомендации (Назаренко, Г.И. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований / Г.И. Назаренко, А.А. Кишкун. - М.: Медицина, 2002. - 544 с.), рассчитывают ПДК холестерина в семенной плазме жеребцов в границах 50 процентиля репрезентативной выборки. Оказалось, что ПДК холестерина в семенной плазме жеребцов равна 0,18 ммоль/л.
[14]Затем животных распределяют по группам. В первую группу попали жеребцы со значением концентрации холестерина в семенной плазме больше 0,18 ммоль/л, во вторую группу, соответственно, меньше 0,18 ммоль/л.
[15]
[16]Как видно из полученных данных, жеребцы с концентрацией холестерина в семенной плазме меньше 0,18 ммоль/л превосходили по количеству морфологически нормальных сперматозоидов в криоконсервированной сперме на 19,22% аналогов из группы с большим значением данного показателя (Р не больше 0,01).
[17]Известно, что в сперме жеребцов после криоконсервации - оттаивания, морфологически нормальных сперматозоидов должно быть не менее 80% (Рекомендации). В этом случае сперма считается качественной, т.е. пригодной для искусственного осеменения. Следовательно, криоконсервированную сперму, в которой количество морфологически нормальных сперматозоидов после оттаивания равно этому значению или бюлыпе, можно смело относить к группе с высоким уровнем качества.
[18]На основании результатов нашего эксперимента можно сделать следующее заключение - при значениях концентрации холестерина в семенной плазме меньше 0,18 ммоль/л, отмечается высокий уровень морфологически нормальных сперматозоидов в криоконсервированной сперме.
[19]ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[20]Применимость предлагаемого способа была проверена в условиях Терского племенного конного завода №169 Ставропольского края.
[21]Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.
[22]Производят отбор образцов спермы жеребцов и оценивают каждый по следующим показателям: объем эякулята, концентрация сперматозоидов.
[23]Затем получают спермоплазму. Для этого часть эякулята, полученного от каждого жеребца, сразу же после отбора образцов спермы, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 минут с помощью центрифуги ELMI СМ-6М (SIA ELMI, Латвия). Проводят световую микроскопию супернатанта, чтобы убедиться в отсутствии сперматозоидов.
[24]Полученные аликвоты семенной плазмы оценивают по концентрации холестерина на биохимическом анализаторе AU 680 (Beckman Coulter, США).
[25]Одновременно, для контроля, оценивают выживаемость сперматозоидов при Т 2-4°С и определяют количество морфологически нормальных сперматозоидов в криоконсервированной сперме, предварительно подвергнув другую часть каждого эякулята процедуре криоконсервации - оттаивания.
[26]
[27]Вывод: при концентрации холестерина в семенной плазме меньше 0,18 ммоль/л жеребца относят к группе с высоким качеством криоконсервированной спермы, а при концентрации холестерина в семенной плазме больше 0,18 ммоль/л, соответственно, к группе с низкой.
[28]Таким образом, при практическом использовании предлагаемого способа, для определения качества криоконсервированной спермы жеребцов, не нужно оценивать выживаемость сперматозоидов при Т 2-4°С и знать количество морфологически нормальных сперматозоидов в ней, а достаточно определить уровень концентрации холестерина в семенной плазме.
